蛋氨酸二肽對(duì)Transwell小室培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白合成的影響

祁業(yè)輝 黃 飛 杜心怡 劉桂芹 王長(zhǎng)法 周苗苗

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,聊城 252000)

乳腺以血液中的氨基酸為前體物質(zhì)來合成乳蛋白。然而,乳腺對(duì)一些必需氨基酸的攝取量低于乳中的排出量,乳腺攝取的游離氨基酸并不能完全滿足乳蛋白合成的需要[1]。為了彌補(bǔ)游離氨基酸的不足,乳腺必須攝取肽結(jié)合形式的氨基酸。反芻動(dòng)物乳蛋白的合成過程中,多肽及小肽的作用已引起重視。研究表明,奶牛乳腺可以攝取血液中的肽結(jié)合氨基酸,乳腺酪蛋白合成所需蛋氨酸(Met)的8%～18%來源于血液中的小肽[1-2]。奶牛飼養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),飼糧中添加小肽可顯著增加奶牛乳汁中乳蛋白含量[3-4]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary gland epithelial cells,BMECs)體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),許多必需氨基酸組成的小肽均顯著提高了BMECs中酪蛋白基因表達(dá)或培養(yǎng)液中酪蛋白濃度[5-9]。已有研究證實(shí)BMECs中有小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(oligopeptide transporter 2,PepT2)蛋白的表達(dá),小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在乳腺小肽吸收利用過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。然而,乳腺上皮細(xì)胞屬于極性細(xì)胞,其物質(zhì)的吸收和乳汁的分泌具有方向性,即:從基底膜側(cè)(血液)攝取營(yíng)養(yǎng)底物,而從頂膜側(cè)(腺泡)分泌乳汁顆粒。目前,相關(guān)研究所用BMECs的培養(yǎng)方式均為貼壁培養(yǎng)[5-9],不能保證細(xì)胞的極性狀態(tài),破壞了物質(zhì)吸收和乳汁分泌的方向性,不能完全代表奶牛乳腺的正常生理狀態(tài)。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體是否在乳腺從血液(基底膜側(cè))攝取小肽過程中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步的研究。

Transwell小室,即穿透小室,可用于生物屏障的建立、細(xì)胞共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲等多方面的研究[12-13]。Transwell小室可放入培養(yǎng)板中,小室內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液,下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液,上、下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。細(xì)胞種在上室內(nèi),由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞,從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。Lin等[14]利用Transwell小室培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞層研究了具有降壓功能的大豆蛋白源三肽[亮氨酸-絲氨酸-色氨酸(Leu-Ser-Trp,LSW)]的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理,結(jié)果顯示,LSW從頂膜側(cè)到基底膜側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯高于相反方向,且完整LSW主要通過細(xì)胞旁路和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(oligopeptide transporter 1,PepT1)介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Lacroix等[15]以Transwell小室培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞層為模型,研究了5種乳源肽的轉(zhuǎn)運(yùn)形式和生物活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大部分乳源肽在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中被肽酶水解而喪失生物活性。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合Transwell小室被廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究。因此,本試驗(yàn)將BMECs結(jié)合Transwell小室進(jìn)行極化培養(yǎng),研究BMECs對(duì)Transwell上室和下室培養(yǎng)液中蛋氨酸二肽(Met-Met)的攝取和利用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將BMECs培養(yǎng)在Transwell小室(Corning,美國(guó))中,待培養(yǎng)的BMECs形成細(xì)胞層后,以不添加Met-Met作為對(duì)照,分別在上室和下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L的Met-Met進(jìn)行試驗(yàn)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集BMECs,采用Western blot檢測(cè)β-酪蛋白(β-casein)、PepT2蛋白的相對(duì)表達(dá)量以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的磷酸化水平。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 BMECs的Transwell小室培養(yǎng)

選取3頭泌乳中后期的中國(guó)荷斯坦奶牛,于屠宰場(chǎng)宰殺后取乳腺腺泡組織,清洗并剪碎至1 mm3大小。參照Zhou等[6]的方法分離純化BMECs。調(diào)整BMECs濃度為1×105個(gè)/mL后,將細(xì)胞接種在12孔Tranwell小室中,分別在上室和下室中添加0.5和1.5 mL含有10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)-F12培養(yǎng)液(Gibco,美國(guó))(添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL胰島素、1 μg/mL氫化可的松)。然后將細(xì)胞置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),每2 d換1次培養(yǎng)液。待Transwell小室中培養(yǎng)的BMECs形成細(xì)胞層后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞層跨膜電阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)測(cè)定

通過測(cè)定細(xì)胞層TEER來檢測(cè)BMECs細(xì)胞層的緊密性。TEER用電阻儀(WPI EVOM,美國(guó))測(cè)定,在使用前,其2個(gè)電極先用75%酒精浸泡5 min消毒,再用D-Hanks沖洗電極,洗去酒精。從細(xì)胞接種到Transwell濾網(wǎng)上第1天開始,以未接種細(xì)胞的Transwell小室為空白對(duì)照,每天同一時(shí)間用電阻儀測(cè)3個(gè)孔的細(xì)胞層TEER并記錄,連續(xù)測(cè)10 d。

細(xì)胞層TEER(Ω·cm2)=(TEER細(xì)胞-TEER對(duì)照)/
有效膜面積(1.12 cm2)。

1.4 Western blot

以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,檢測(cè)β-酪蛋白、PepT2蛋白以及mTOR1、S6k1和AKT蛋白及磷酸化蛋白的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)束后,收集BMECs,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用含有完全蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解收集的細(xì)胞。然后將樣品100 ℃煮沸10 min,16 000×g離心1 min,提取細(xì)胞中總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及Western blot操作。最后將膜在吸水紙上瀝干,置于平板上,放入化學(xué)發(fā)光成像儀中,拍照記錄并分析。試驗(yàn)所用抗體分別進(jìn)行稀釋后用于Western blot檢測(cè),稀釋倍數(shù)見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)柱以平均值表示,誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

表1 Western blot所用抗體

2 結(jié)果與分析

2.1 Transwell小室培養(yǎng)的BMECs層TEER

經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn),BMECs接種于Transwell濾網(wǎng)約6 d時(shí)細(xì)胞層TEER達(dá)到平臺(tái)期(圖1),反映細(xì)胞層緊密性良好。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞層跨膜電阻

2.2 Met-Met對(duì)BMECs中β-酪蛋白蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示,Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L Met-Met均可顯著增加BMECs中β-酪蛋白的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05,圖2)。

2.3 Met-Met對(duì)BMECs中PepT2蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示,Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L Met-Met均顯著提高了BMECs中PepT2的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05,圖3)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3、圖4同。

2.4 Met-Met對(duì)BMECs中mTOR、S6K1和AKT磷酸化水平的影響

結(jié)果顯示,Transwell下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L Met-Met顯著提高了mTOR、S6K1和AKT的磷酸化水平(P<0.05,圖4) 。

3 討 論

乳蛋白的合成和分泌是一個(gè)復(fù)雜的生物過程,受到很多因素的影響[16]。其中,氨基酸和小肽作為乳蛋白合成的前體物質(zhì),是影響乳蛋白合成的主要因素[15]。眾多研究表明小肽可以調(diào)控乳蛋白的合成[5,17]。但是BMECs上皮細(xì)胞攝取血液小肽的機(jī)制還不十分清楚。已有研究表明PepT2在BMECs小肽攝取過程中發(fā)揮重要作用[6,18]。然而,另有研究證實(shí),PepT2在大鼠乳腺上皮細(xì)胞的頂膜側(cè)表達(dá),在從乳汁重吸收小肽類物質(zhì)(乳蛋白水解物和肽結(jié)構(gòu)類似藥物)的過程中發(fā)揮作用[19-20]。所以,Met-Met等小肽對(duì)PepT2表達(dá)和乳蛋白合成的促進(jìn)作用可能發(fā)生在乳腺上皮細(xì)胞頂膜側(cè)。因?yàn)樵贐MECs貼壁培養(yǎng)模式下,添加培養(yǎng)液側(cè)即為乳腺腺泡側(cè)(頂膜側(cè)),在培養(yǎng)液中添加Met-Met可使乳腺腺泡側(cè)Met-Met濃度升高,從而增加了PepT2表達(dá)和乳蛋白合成。乳腺上皮細(xì)胞屬于極性細(xì)胞,其物質(zhì)的吸收和乳汁的分泌具有方向性,貼壁培養(yǎng)不能保證細(xì)胞的極性狀態(tài),破壞了物質(zhì)吸收和乳汁分泌的方向性。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體是否在乳腺從血液攝取小肽過程中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步的研究。

圖3 Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加

圖4 Transwell下室培養(yǎng)液中添加Met-Met對(duì)mTOR、S6K1和AKT磷酸化的影響

鑒于此,本研究將BMECs在Transwell小室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),探討B(tài)MECs對(duì)上室和下室培養(yǎng)液中Met-Met的攝取利用。采用BMECs結(jié)合Transwell小室進(jìn)行極化培養(yǎng),上室代表上皮細(xì)胞頂膜側(cè)(腺泡腔),下室代表上皮細(xì)胞基底膜側(cè)(血液),這種屏障模型能代表BMECs的正常生理狀態(tài),便于更準(zhǔn)確地研究小肽在BMECs中的攝取機(jī)理。試驗(yàn)結(jié)果表明,BMECs接種于Transwell小室培養(yǎng)6 d后細(xì)胞層TEER達(dá)到平臺(tái)期,說明成功建立了細(xì)胞屏障,可用于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加Met-Met均顯著增加了β-酪蛋白和PepT2的蛋白相對(duì)表達(dá)量。以上結(jié)果提示Transwell上室和下室培養(yǎng)液中的Met-Met均可被BMECs吸收用于乳蛋白的合成,PepT2在BMECs頂膜側(cè)和基底膜側(cè)小肽的攝取過程中均發(fā)揮作用。Wang等[17]研究表明,PepT2蛋白在BMECs頂膜側(cè)和底膜側(cè)均有表達(dá),其在奶牛乳腺小肽攝取過程中發(fā)揮重要作用。Shennan等[19-20]研究證實(shí),PepT2蛋白在大鼠乳腺上皮細(xì)胞的頂膜側(cè)表達(dá),在從乳汁重吸收小肽類物質(zhì)的過程中發(fā)揮作用。本試驗(yàn)結(jié)果同以上研究結(jié)果一致。

被BMECs吸收后,小肽不僅可以作為底物參與乳蛋白合成,還可以作為信號(hào)分子調(diào)控乳蛋白的合成[21]。mTOR是一種哺乳動(dòng)物絲氨酸/蘇氨酸激酶,它能感受來自營(yíng)養(yǎng)素(氨基酸、小肽)等的信號(hào)來調(diào)控蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)[22]。S6K1是mTOR的直接靶元件?；罨腟6K1促進(jìn)mRNAs的5’端翻譯增加,這些mRNAs轉(zhuǎn)錄一些蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的組分(核糖體蛋白、延長(zhǎng)因子和PolyA結(jié)合蛋白),因而可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[23]。AKT是調(diào)控mTOR活性的一個(gè)關(guān)鍵的正調(diào)控因子[24]。本研究中,Transwell下室培養(yǎng)液中添加Met-Met顯著增加了BMECs中mTOR、S6K1和AKT的磷酸化水平,結(jié)果提示Met-Met通過激活mTOR和AKT信號(hào)通路促進(jìn)了乳蛋白的合成。Wang等[17]研究結(jié)果亦表明,Met-Met通過激活BMECs中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)、Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、mTOR、4E-結(jié)合蛋白1(4E-binding protein 1,4EBP1)和S6K1等信號(hào)通路元件促進(jìn)細(xì)胞增殖,提高了細(xì)胞活力和β-酪蛋白的合成;進(jìn)一步研究表明,抑制JAK2和mTOR信號(hào)通路降低了Met-Met引起的BMECs活力增加和乳蛋白合成[17]。另有研究發(fā)現(xiàn),Met-Met可以通過激活磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)-AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺發(fā)育(提高42%)和泌乳過程(增加84%)[25]。本試驗(yàn)結(jié)果同以上研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

① BMECs接種于Transwell小室培養(yǎng)6 d后形成細(xì)胞層,建立細(xì)胞屏障。BMECs結(jié)合Transwell小室進(jìn)行極化培養(yǎng),上室代表腺泡腔,下室代表血液側(cè),比傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)更接近乳腺上皮細(xì)胞的生理狀態(tài),能保障乳腺上皮細(xì)胞物質(zhì)吸收和乳汁分泌的方向性,便于更準(zhǔn)確地研究小肽在BMECs中的攝取機(jī)理。

② Transwell下室和上室培養(yǎng)液中的Met-Met均可被BMECs吸收用于乳蛋白的合成,PepT2在Met-Met的攝取過程中均發(fā)揮作用,提示血液和腺泡腔中的小肽均可被乳腺上皮細(xì)胞PepT2吸收或重吸收并用于乳蛋白的合成。

③ Transwell下室培養(yǎng)液中的Met-Met通過激活mTOR和AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳蛋白的合成。