接骨木鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素條件篩選及致病性分析

肖萌萌,賀付蒙,馮 旭,徐永清,蔣先鋒,王 雪,劉 丹,李鳳蘭

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是人類的主要食物來源之一[1]。然而,馬鈴薯干腐病作為一種常見的貯藏病害,嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和市場價值[2]。據(jù)估計,約有6%～25%的馬鈴薯儲藏期產(chǎn)量損失是由干腐病造成的[3-4]。鐮刀菌是馬鈴薯干腐病的主要病原菌[5],閔凡祥等[6]和李鳳蘭等[7]鑒定了黑龍江省馬鈴薯干腐病主要病原菌有7個種及變種,分別為擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotriodides)、擬絲孢鐮刀菌(F.trichothecioides)、茄腐鐮刀菌(F.solani)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、茄腐鐮刀菌藍(lán)色變種(F.solanivar.coeruleum)和黃色鐮刀菌(F.culmorum)。其中接骨木鐮刀菌致病性最強(qiáng),是甘肅、黑龍江、河北等馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢病原菌[8]。研究表明鐮刀菌能產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物鐮刀菌毒素,從而使植物致病。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名嘔吐毒素,是馬鈴薯干腐病致病鐮刀菌分泌的毒素之一,被認(rèn)為是重要的致病因子[9]。

1972年,嘔吐毒素在日本的赤霉病大麥中首次分離得到,并進(jìn)行鑒定和命名[10]。其化學(xué)名稱為3α,7α,15-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮,分子式為C15H20O6,在水和極性溶劑中溶解度良好[11]。嘔吐毒素理化性質(zhì)較穩(wěn)定,在弱酸條件具有較強(qiáng)的耐受性,而在堿性條件下不穩(wěn)定[12]。嘔吐毒素作為一種霉菌毒素常見于動物飼料中,通過動物腸道進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生毒理作用[13]。其產(chǎn)量受各種因素的影響,菌株是關(guān)鍵因素[14]。Bajestani等[15]通過研究小麥對真菌提取物、孢子懸液、嘔吐毒素的防御反應(yīng),發(fā)現(xiàn)低濃度嘔吐毒素能誘導(dǎo)小麥系統(tǒng)獲得性抗性的產(chǎn)生,從而提高對瘡痂病的抗性。研究表明低濃度嘔吐毒素處理馬鈴薯提高了薯塊防御酶和抗氧化酶的活性,從而有效提高了馬鈴薯的抗病性[16]。毒素能夠在感病組織中或人工培養(yǎng)條件下獲得[17]。通過對苦瓜枯萎病菌毒素[18]、玉米伏馬毒素[19]和赭曲霉毒素A[20]產(chǎn)生條件的研究表明,人工培養(yǎng)條件下毒素產(chǎn)量與培養(yǎng)時間、環(huán)境等條件有關(guān)。目前對于嘔吐毒素產(chǎn)生條件的研究較少。

為探討嘔吐毒素與馬鈴薯抗病誘導(dǎo)的相關(guān)性,首先需要培養(yǎng)出大量的嘔吐毒素,然而對于接骨木鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素的培養(yǎng)條件迄今未見報道。本研究以接骨木鐮刀菌為研究對象,通過響應(yīng)面法探究嘔吐毒素產(chǎn)生條件,研究接骨木鐮刀菌在產(chǎn)毒條件、毒素積累動態(tài)變化規(guī)律、霉變程度與嘔吐毒素之間的關(guān)系,為窖藏馬鈴薯提供用于指導(dǎo)防控實踐的理論依據(jù),有望在最大程度上降低馬鈴薯干腐病的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試致病鐮刀菌為接骨木鐮刀菌(F.sambucinum),供試植物為大西洋馬鈴薯,均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地藥用植物資源實驗室保存。嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒(NO.HEM0896/HEM0848)由中國北京華安麥格納奇生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 毒素粗提液制備 將置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng)的鐮刀菌用研缽進(jìn)行粉碎處理,然后轉(zhuǎn)到錐形瓶中,取100 mL提取液[V(乙腈)∶V(水)=84∶16],充分?jǐn)嚢韬竺芊?。用超聲震蕩法提? h,抽濾后收集濾液,轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,然后用色譜級純甲醇4 mL溶解瓶壁殘留物,以10 000 r/min離心5 min,取上清液為毒素粗提物,4 ℃保存,以備后續(xù)試驗。

1.2.2 LC-MS分析 將毒素粗提液用注射器和0.45 μL濾膜進(jìn)行過濾,然后裝入棕色小瓶,再加入100 μL的0.1 mol/L冰醋酸促進(jìn)電離,進(jìn)行樣品檢測。色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流速0.25 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動相A為 0.05%甲酸和1 mmol/L乙酸銨水溶液,B為甲醇,梯度洗脫條件為0～11 min,20%～40%B; 11～16 min,40%～70%B;16～25 min,70～95%B;95%B沖洗10 min;每次進(jìn)樣前用20%B平衡柱子,10 min。

1.2.3 單因素試驗及設(shè)計方案 分別考察碳源種類(乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)、培養(yǎng)時間 (10 d、15 d、20 d、25 d、30 d)、碳源濃度(10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L)、培養(yǎng)溫度 (20 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃)、pH(5.7、5.9、6.1、 6.3、6.5)等因素對嘔吐毒素產(chǎn)量的影響,采用酶聯(lián)免疫法測定嘔吐毒素的含量,平行試驗3次,結(jié)果取平均值,確定最佳產(chǎn)毒條件。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ),選擇培養(yǎng)時間、溫度和pH 3個因素,應(yīng)用Design-Expert v8.0.6軟件采用4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計法,每個因子設(shè)置為高、中、低3個水平(-1,0,1)作出響應(yīng)曲面圖。

1.2.5 毒素在致病性中的作用 方法參照單瑋玉等[21]略有改進(jìn),將大西洋馬鈴薯消毒后,用打孔器打出直徑為1 cm深1.5 cm的孔,以水為對照,以300 μL濃度為10 ng/mL的嘔吐毒素為處理組,經(jīng)6 h后將培養(yǎng)好的接骨木鐮刀菌挑取菌絲并接種在馬鈴薯體內(nèi),在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗室中培養(yǎng)10 d后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。試驗設(shè)3次重復(fù),每次重復(fù)選5個塊莖,根據(jù)病斑面積占薯塊表面積的百分比分為5級,標(biāo)準(zhǔn)為:0級塊莖無病斑,1級病斑面積為5%以下,2級病斑面積為6%～15%,3級病斑面積為16%～30%,4級病斑面積為31%～50%,5級病斑面積為50%以上。病情指數(shù)=Σ(各級發(fā)病塊莖×相對級數(shù)值)/(總塊莖數(shù)×最高病情級數(shù))×100。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft office Excel 2007和SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌的毒素分析

用LC-MS檢測樣品發(fā)現(xiàn)(圖1),嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間在樣品里也有峰,且嘔吐毒素的含量為6.10 ng/mL(表1)。

表1 LC-MS檢測嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的嘔吐毒素含量Table 1 Vomitoxin content of vomitoxin standards and sample tested by LC-MS

A.為標(biāo)準(zhǔn)品;B.為檢測樣品

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 碳源種類 由圖2-A可知,接骨木鐮刀菌在不同的碳源培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生嘔吐毒素,但產(chǎn)毒量有顯著差異。在以葡萄糖為碳源時,鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素量最高,達(dá)到1.38 ng/mL;以乳糖為碳源時,嘔吐毒素產(chǎn)量最低為0.57 ng/mL,因此選擇葡萄糖作為碳源。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 培養(yǎng)時間 由圖2-B可以看出,培養(yǎng)前期嘔吐毒素產(chǎn)量變化較為平緩,隨著培養(yǎng)時間的延長,在20～25 d產(chǎn)毒速率明顯加快,產(chǎn)毒量最高為2.25 ng/mL,并在25 d后產(chǎn)毒量出現(xiàn)下降趨勢,說明培養(yǎng)時間影響鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素的能力。因此將25 d作為最優(yōu)條件繼續(xù)培養(yǎng),并將響應(yīng)面試驗的培養(yǎng)時間設(shè)置為20～30 d。

2.2.3 培養(yǎng)溫度 圖2-C顯示,當(dāng)培養(yǎng)溫度由20 ℃上升到25 ℃時,隨著溫度的升高,接骨木鐮刀菌產(chǎn)生的嘔吐毒素濃度逐漸升高,并且在23 ℃至25 ℃過程中產(chǎn)毒速率加快,當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高,毒素含量逐漸降低,產(chǎn)毒量趨于平緩,說明溫度過高或過低都不利于接骨木鐮刀菌產(chǎn)毒,可能是因為溫度會影響酶活。在培養(yǎng)溫度為25 ℃時,達(dá)到最高產(chǎn)毒量1.85 ng/mL,因此將響應(yīng)面優(yōu)化試驗的培養(yǎng)溫度設(shè)置為23～27 ℃。

2.2.4 pH 由圖2-D可見,隨著pH由酸性到弱堿性過程中,嘔吐毒素含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,具體表現(xiàn)為pH 為5.9～6.1的條件下毒素含量迅速升高,然后逐漸降低,故確定以pH 5.9、6.1和6.3進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.2.5 碳源濃度 檢測碳源不同添加量對嘔吐毒素的產(chǎn)生情況,如圖2-E所示,隨著碳源濃度持續(xù)上升,嘔吐毒素產(chǎn)量趨于平緩,表明碳源濃度對接骨木鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素的能力影響不大。

2.3 接骨木鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素條件優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與回歸方程的建立 選擇A(培養(yǎng)時間)、B(培養(yǎng)溫度)、C(pH),根據(jù)嘔吐毒素含(Y)的響應(yīng)值,考察3個因素對鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素的影響(表2),進(jìn)行3因素3水平產(chǎn)毒條件響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果如表3所示,分析得到嘔吐毒素含量(Y)對編碼變量A、B、C的二次多項回歸方程為:Y=2.42+0.35A+0.16B+ 0.063C-0.050AB+0.15AC+0.020BC- 0.77A2-0.10B2-0.55C2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Response surface test factor level

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface test design and result

由方差分析可知(表4),該響應(yīng)面模型具有顯著性,回歸極顯著(P<0.000 1),失擬項不顯著(P=0.461 7)。R2為0.995 2,Radj=0.989 1,表明預(yù)測值與實際值有較高的相關(guān)性,擬合良好。因素一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2的P值均小于0.05,表明它們對鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素有較大影響,交互項只有AC對嘔吐毒素產(chǎn)量有顯著影響(P<0.05)。進(jìn)一步說明該方程與實際結(jié)果擬合較好,可靠性高。可用于嘔吐毒素含量的分析與計算;從各項F值可以看出,嘔吐毒素含量關(guān)鍵因素的關(guān)系為:A>B>C,即培養(yǎng)時間> 培養(yǎng)溫度>pH。

表4 響應(yīng)面法方差分析Table 4 Response surface analysis of variance table

2.3.2 響應(yīng)面模型分析 根據(jù)回歸方程得到嘔吐毒素含量與培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和pH 3個因素的3D響應(yīng)面模型(圖3),均為開口向下的凸形曲面,表明在考察范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極大值,由圖3-A可知培養(yǎng)時間對嘔吐毒素含量的影響較大,隨著培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度逐漸增加,嘔吐毒素含量呈先升高后降低的趨勢。在培養(yǎng)時間24～28 d,培養(yǎng)溫度24～27 ℃時,嘔吐毒素含量處于較高水平。在固定培養(yǎng)溫度的情況下,如圖3-B所示,培養(yǎng)時間與pH反映出一定的交互作用,隨著培養(yǎng)時間的延長及pH增大,嘔吐毒素含量呈先升高后降低的趨勢,嘔吐毒素含量最大值出現(xiàn)在培養(yǎng)時間24～29 d,pH 6.0～ 6.3時。由圖3-C可知,在固定培養(yǎng)時間的條件下,嘔吐毒素產(chǎn)量隨培養(yǎng)溫度及pH升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在pH為6.0～6.3,培養(yǎng)溫度24～27 ℃時,嘔吐毒素含量在較高范圍內(nèi)。綜上所述,嘔吐毒素含量的最大值出現(xiàn)的條件為:培養(yǎng)時間24～28 d,培養(yǎng)溫度24～27 ℃,pH 6.0～6.3。

A.培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間;B.培養(yǎng)時間和pH;C.培養(yǎng)溫度和pH

2.3.3 優(yōu)化工藝驗證 由Design-Expert V8.06軟件求解回歸方程,得出嘔吐毒素含量最大時的條件為:以葡萄糖為碳源,培養(yǎng)溫度26.19 ℃、pH 6.12、培養(yǎng)時間25.38 d。在此條件下,嘔吐毒素含量預(yù)測值為2.50 ng/mL。綜合試驗操作的可行性,調(diào)整產(chǎn)毒條件為:培養(yǎng)溫度26 ℃、pH 6.1、培養(yǎng)時間25 d,進(jìn)行3次重復(fù)試驗,嘔吐毒素含量為2.57 ng/mL,與預(yù)測值相差不大,說明此條件可以有效提高接骨木鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素含量。

2.4 毒素在致病性中的作用

由圖4和表5可知,用水(A)處理的馬鈴薯病健交界區(qū)域?qū)?呈現(xiàn)淺褐色,病健交界線不明顯且有蔓延趨勢,病情指數(shù)為61.3。而用嘔吐毒素(B)處理馬鈴薯,病斑平均直徑均小于水處理,病情指數(shù)為41.3。薯內(nèi)病健交界區(qū)域極窄且呈現(xiàn)深褐色,病健交界線更為清晰明顯,嘔吐毒素處理的塊莖病斑明顯小于水處理,且嘔吐毒素處理后病斑幾乎無蔓延。

表5 毒素致病性分析Table 5 Pathogenicity analysis of toxins

A.水+鐮刀菌處理;B.DON+鐮刀菌處理

3 討 論

鐮刀菌毒素的產(chǎn)生受到許多因素影響,如溫度、pH和時間等[22-23]。研究表明小麥貯藏階段的嘔吐毒素在溫度為25～30 ℃時大量積累[24]。唐亞梅等[25]利用響應(yīng)面分析法對硫色鐮刀菌體外產(chǎn)毒條件進(jìn)行篩選,結(jié)果表明溫度 22.2 ℃及pH 5.1最有利于產(chǎn)毒,鐮刀菌會隨著溫度的升高而快速生長,但產(chǎn)毒能力也會受到抑制[22]。本研究也出現(xiàn)類似趨勢,在25 ℃產(chǎn)毒量最高,溫度過高會造成酶失活,不利于鐮刀菌產(chǎn)毒。李俊霞等[26]在對四川玉米串珠鐮刀菌進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)其最佳產(chǎn)毒pH為5。本研究發(fā)現(xiàn)酸性條件有利于鐮刀菌產(chǎn)毒,研究結(jié)果與Merhej等[27]的研究類似。閆海霞[28]研究表明:禾谷鐮刀菌中嘔吐毒素的產(chǎn)量與時間呈近似拋物線關(guān)系且在30 d時產(chǎn)毒最高。而本研究中接骨木鐮刀菌在25 d產(chǎn)毒量達(dá)到高峰,這可能是由于菌株不同而造成的差異。

嘔吐毒素可以引起植物的代謝物轉(zhuǎn)化、氧化應(yīng)激反應(yīng)等一系列寄主防御反應(yīng)[29]。低濃度嘔吐毒素作為激發(fā)子處理馬鈴薯,提高了幾丁質(zhì)酶活性以及木質(zhì)素、花青素的積累[16]。從鐮刀菌毒素與致病性的試驗結(jié)果來看,毒素處理的馬鈴薯病健交界區(qū)域極窄,無蔓延趨勢,說明低濃度嘔吐毒素誘導(dǎo)了馬鈴薯的防御反應(yīng),合成木質(zhì)素以及酚類等物質(zhì),病健交界處呈現(xiàn)深褐色,阻止了病斑進(jìn)一步蔓延。鐮刀菌及毒素與馬鈴薯的互作是極其復(fù)雜的過程,包括鐮刀菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以及馬鈴薯防御反應(yīng)產(chǎn)生的酶及其他抗性物質(zhì),嘔吐毒素對馬鈴薯的這種抗性誘導(dǎo)是否會在分子水平對馬鈴薯塊莖具有影響需要進(jìn)行更多的研究和 分析。