金 明,張彩虹,董晨曦,史青堯,張 飛,單衛(wèi)星,強曉玉

(1.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學 園藝學院,陜西楊凌 712100)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科多年生草本植物,是中國第四大糧食作物。馬鈴薯在國內經(jīng)濟和糧食供應中具有重要作用[1],西北地區(qū)是中國馬鈴薯主要種植區(qū)之一,然而該地區(qū)生產(chǎn)條件差,普遍缺水少肥,導致其病害問題突出,其中以馬鈴薯晚疫病尤為嚴重,每年造成巨大的產(chǎn)量損失[2]。由于馬鈴薯晚疫病持久抗病基因的挖掘和利用研究有所欠缺[3],導致馬鈴薯品種抗病性喪失問題極為突出。因此,晚疫病害防控高度依賴化學農(nóng)藥,進而導致耕地地力下降和生態(tài)污染[4]。近年來,隨著高通量測序技術的發(fā)展,越來越多的研究從微生態(tài)視角探究馬鈴薯晚疫病發(fā)生的驅動因素。

有關馬鈴薯根際土壤細菌群落結構和多樣性與晚疫病之間的相關性已有報道,與健康馬鈴薯相比,感染晚疫病的馬鈴薯根際土壤細菌群落多樣性顯著降低;同時,部分細菌門、屬豐度占比變化導致根際細菌群落結構也發(fā)生改變[5]。此外,康利娟等[6]的研究揭示了耕作模式能夠影響馬鈴薯根內真菌多樣性及群落結構變化,與單一連續(xù)種植馬鈴薯模式相比,馬鈴薯與小麥輪作模式下馬鈴薯根內真菌多樣性水平更高,Mortierella和Trichoderma等根內有益真菌豐度明顯升高,推測輪作模式下豐度更高的根內有益真菌對馬鈴薯生長和抗逆性提高有促進作用。在此研究基礎上進一步分離培養(yǎng)獲得93株根部內生真菌,經(jīng)過比較分析,明確了連作和輪作模式下在屬水平上存在豐度顯著差異的一類真菌,如微座孢屬(Microdochium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、炭疽菌屬(Colletotrichum)和球腔菌屬(Mycosphaerella)等[7]。

內生真菌是一類能夠在植物組織中定殖、通常不會引起植物明顯疾病癥狀、且對植物產(chǎn)生有益作用的真菌[8]。內生真菌與其他微生物及宿主植物之間密切的相互作用對于植物的健康生長具有重要意義[9]。內生真菌有助于宿主植物從周圍環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質,從而促進其生長[10];此外,內生真菌還可能提高宿主植物對干旱、低溫等非生物逆境以及病蟲害等生物逆境的適應能力[11-12],如從印度西北部塔爾沙漠的灌木根部分離獲得的內生真菌印度梨形孢(Piriformosporaindica)具有廣泛的寄主范圍,能夠定殖于多種植物的根部細胞。P.indica不僅能夠促進植物生長、提高植物抗逆性[13-15],還有助于誘發(fā)寄主植物的系統(tǒng)抗病性,從而有效抵御病原菌的入侵[16]。本研究前期分離獲得的微座孢屬(Microdochium)是一種較常見的生防真菌,可抑制禾谷類作物的多種病害[17-18]。有益內生真菌及其代謝產(chǎn)物在生物醫(yī)學、能源和生物催化劑等方面也具有很廣泛的應用前景[19]。然而,內生真菌與植物和病原菌的互作機制尚不甚明了。寄生疫霉(P.parasitica)寄主范圍非常廣泛,侵染包括馬鈴薯、番茄(SolanumlycopersicumL.)、煙草(NicotianatabacumL.)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等多種植物[20]。同時,寄生疫霉具有較為成熟的遺傳轉化體系,利用穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的寄生疫霉轉化子,可觀察病菌侵染植物細胞的整個過程[21]。因此,寄生疫霉被作為一種重要模式卵菌進行植物與病原卵菌的互作機制研究。西北農(nóng)林科技大學單衛(wèi)星教授實驗室前期已建立了擬南芥與寄生疫霉的模式互作體系[22],可以快速、大規(guī)模篩選遺傳材料,并用于開展植物抗病分子遺傳機制研究?；诖?已經(jīng)篩選并鑒定一系列影響植物抗疫霉菌的關鍵免疫調控因子及其作用機制[23-24]。但是,目前尚缺乏成熟的植物—疫霉菌—內生真菌三方互作研究體系。

植物—疫霉菌—內生真菌三方互作研究體系的建立有助于快速而準確地篩選分析大量候選真菌影響植物與疫霉菌互作的功能,從而鑒定獲得關鍵候選真菌。此外,利用該模式體系完備的基因組信息、遺傳材料及技術優(yōu)勢,有助于深入解析植物—有益真菌—病原菌多方互作機制。因此,本試驗以潛在影響晚疫病菌變化的真菌M.bolleyi為例,構建根部內生真菌—寄生疫霉—擬南芥三方互作模式研究體系,為深入解析益生真菌影響植物抗病抗逆生物學功能以及互作機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料 擬南芥野生型Col-0。

菌株材料 真菌M.bolleyi、寄生疫霉(帶綠色熒光蛋白GFP的轉化子,1121)以及致病疫霉。以上材料由西北農(nóng)林科技大學單衛(wèi)星教授實驗室保存。

主要試劑 20%次氯酸鈉、75%乙醇、β-谷甾醇、碳酸鈣、胡蘿卜汁、蔗糖、瓊脂粉、1/2MS。

主要儀器 熒光顯微鏡、超凈工作臺、智能植物培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、打孔器、高壓滅菌鍋、超低溫冰箱。

主要培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):PDA培養(yǎng)基粉末23 g,加水定容至1 L,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。燕麥培養(yǎng)基(RSA):黑麥65～70 g,蔗糖20 g,瓊脂粉8 g,溶于去離子水中,加水定容至1 L,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。 胡蘿卜培養(yǎng)基(CA):取胡蘿卜200 g切成小塊,于500 mL水中煮沸,過濾,留取汁液,加入20 g瓊脂,加水定容至1 L,121 ℃滅菌30 min。1/2MS培養(yǎng)基:2.75 g 1/2MS培養(yǎng)基粉末,5 g蔗糖,3.75 g瓊脂,去離子水定容至500 mL,pH調制為6.0,121 ℃滅菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 平板拮抗試驗 致病疫霉的活化:于 20 ℃黑暗條件下,在RSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)致病疫霉10 d左右,用打孔器取直徑7 mm的菌餅, 備用。

平板對峙分析:用滅菌接種針挑取疫霉菌放入PDA培養(yǎng)基一側,在培養(yǎng)基另一側對稱接種經(jīng)PDA平板20 ℃活化培養(yǎng)4～5 d的真菌菌餅,病原真菌和內生真菌的菌餅接在同一直徑上, 20 ℃恒溫暗培養(yǎng)。對照試驗,將致病疫霉的菌餅單獨接種在另一個PDA培養(yǎng)基中,菌餅距離培養(yǎng)基邊緣的距離與上述試驗保持一致,不接種真菌,于相同條件下進行培養(yǎng),隨時觀察菌株生長情況。

真菌評測標準:待單獨接種的致病疫霉長滿培養(yǎng)基后,取出PDA培養(yǎng)基,用直尺測量單獨培養(yǎng)病原菌菌落直徑和對峙培養(yǎng)病原菌菌落生長直徑,按下式計算抑菌率。

抑菌率=(單獨培養(yǎng)病原菌菌落直徑-對峙培養(yǎng)病原菌菌落生長直徑)/單獨培養(yǎng)病原菌菌落直徑×100%

1.2.2 真菌M.bolleyi侵染植物根部的細胞學觀察分析 擬南芥種子的消毒:取適量的擬南芥種子于20 mL離心管中,先用75%酒精清洗30 min,再用滅菌的ddH2O清洗1 min,重復5次,接著用1% NaClO清洗10 min,之后轉移至 2 mL離心管中于4 000 g離心1 min,最后用滅菌的ddH2O清洗1 min,重復5次,將沖洗干凈的種子轉移到濾紙上于超凈臺中烘干。

擬南芥種子的培養(yǎng):將消毒處理后的擬南芥種子種植于1/2MS培養(yǎng)基中,于4 ℃黑暗條件下處理24 h,再于22 ℃培養(yǎng)箱中光照12 h/黑暗 12 h培養(yǎng)7 d,用于后續(xù)試驗。

真菌孢子懸浮液的制備:取適量0.002%Tween 20加入培養(yǎng)真菌1周左右的培養(yǎng)基中,用涂布器將真菌孢子輕輕刮下來,并用濾布過濾,最終制備成濃度為2.5×105spores/mL真菌M.bolleyi孢子懸浮液,將其接種于擬南芥根部,并于3 hpi、12 hpi、24 hpi、36 hpi和48 hpi時采集根樣品進行固定及WGA染色。

根樣品的固定及WGA染色:將根樣品固定在含有氯仿(20%,體積比)、乙醇(80%,體積比)和三氯乙酸(0.15%,質量與體積比)的溶液中至少24 h。染色前,用蒸餾水沖洗根樣品3次,每次5 min,之后將根在10% KOH中洗滌30 s,然后用1×PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次,每次 5 min。

將根樣品固定在含有10 μg/mL WGA Alexa Fluor○R488(Sigma)和0.02% Silwet L-77的1×PBS(pH=7.4)染色液中,并與真空下滲洗 3次,每次1 min,最后在染色液中于真空下滲洗 10 min。

分別將M.bolleyi接種3 hpi、12 hpi、24 hpi、36 hpi和48 hpi的根樣品制片后,運用熒光顯微鏡觀察真菌M.bolleyi侵染植物根部的細胞學 特征。

1.2.3 真菌M.bolleyi影響植物抗疫霉菌的功能分析 擬南芥幼苗的培養(yǎng):于22 ℃培養(yǎng)箱中光照12 h/黑暗12 h培養(yǎng)擬南芥幼苗7 d,之后挑選長勢相同的擬南芥苗每8株于同一培養(yǎng)皿中,用于后續(xù)試驗。

寄生疫霉的培養(yǎng):于20 ℃黑暗條件下,在CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)寄生疫霉10 d左右。

接種處理:取上述擬南芥,如表1所示,首先,對擬南芥根部分別進行真菌M.bolleyi孢子懸浮液和對照溶液預處理;并于預處理24 h后再分別對根部進行寄生疫霉菌絲塊接種和空白對照處理。最終,選取不同處理組合下長勢相似的10株擬南芥用于后續(xù)分析,共進行3次獨立重復試驗。

表1 試驗的處理設計Table 1 Treatment design of experiment

真菌懸浮液的接種:取適量濃度為2.5×105spores/mL的真菌M.bolleyi孢子懸浮液置于無菌的培養(yǎng)皿中,將待接菌處理的擬南芥幼苗根部浸入真菌懸浮液中,持續(xù)30 s～1 min,之后放回原培養(yǎng)皿中內,封口放置于22 ℃,12 h光照/12 h黑暗交替的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

寄生疫霉的接種:用打孔器在長滿新鮮菌絲的寄生疫霉CA培養(yǎng)基打孔,選取大小一致的菌絲塊,用牙簽將菌絲塊接種于真菌M.bolleyi孢子懸浮液和對照溶液(0.002% Tween 20)預處理的擬南芥幼苗根部,封口放置于22 ℃,12 h光照/12 h黑暗交替的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

寄生疫霉侵染觀察:在寄生疫霉接種24 hpi和48 hpi時,在熒光顯微鏡下觀察擬南芥根內細胞中寄生疫霉絲熒光強度。

寄生疫霉侵染量化分析:分別在寄生疫霉接種24 hpi、36 hpi和48 hpi時,在熒光顯微鏡下對寄生疫霉菌絲塊侵染的兩側對根部末端綠色熒光位置,即為寄生疫霉侵染位置進行劃線,并劃線標記總的根長位置,用ImageJ對根部受侵染的根長度及總根長進行測量,并計算侵染根長比。

侵染根長比(IRLR):IRLR=IL/TL

IL為擬南芥根部受寄生疫霉侵染的長度(cm);TL為擬南芥根總長(cm)。

試驗數(shù)據(jù)處理:用圖像處理軟件ImageJ測量每株擬南芥根部受侵染的長度和根部總長,經(jīng)Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計后,用SPSS 19.0軟件對3次獨立重復試驗中的真菌M.bolleyi孢子懸浮液和對照溶液(0.002% Tween 20)預處理組的8對侵染根長比數(shù)據(jù)進行差異分析,采用t檢驗進行差異顯著性驗證。

2 結果與分析

2.1 真菌M.bolleyi對致病疫霉的拮抗作用 分析

結果表明,與單獨培養(yǎng)致病疫霉的菌落相比(圖1-a),對峙培養(yǎng)皿中致病疫霉的菌落生長受到明顯抑制(圖1-b),培養(yǎng)1周后,M.bolleyi對致病疫霉的抑菌率達到63.55%(表2)。該結果揭示了真菌M.bolleyi對致病疫霉具有拮抗作用。

a.單獨培養(yǎng)1周的致病疫霉菌落生長狀況; b.培養(yǎng)1周的真菌M.bolleyi菌落與致病疫霉菌落對峙生長狀況

表2 內生真菌M.bolleyi對致病疫霉的抑菌率Table 2 Inhibitory rate of endophytic fungus M.bolleyi against P.infestans

2.2 真菌M.bolleyi與擬南芥根部互作的細胞學特征分析

結果表明,接種3 hpi,真菌M.bolleyi在擬南芥根細胞表面形成侵染釘(圖2-a);接種 12 hpi,真菌菌絲進一步在根細胞中擴展(圖2-b);接種24 hpi和36 hpi,可以觀察到菌絲侵染進入根部伸長區(qū)細胞,并在皮層組織的細胞間隙和細胞內定殖(圖2-c,圖2-d);接種48 hpi,致密的真菌菌絲已完全定殖并擴展至擬南芥根部的皮層組織(圖2-e);同時,明場觀察并未發(fā)現(xiàn)維管束解體或細胞壞死的現(xiàn)象(圖2-f)。由此表明,真菌M.bolleyi可成功侵染并定殖于擬南芥根部,并且具有典型的內生真菌侵染特征。

接種真菌M.bolleyi后,分別于3 hpi(a),12 hpi(b),24 hpi(c),36 hpi(d)和48 hpi(e)進行WGA染色,并利用熒光顯微鏡觀察真菌M.bolleyi侵染擬南芥根部的細胞學特征,標尺為50 μm;f.真菌M.bolleyi定殖于擬南芥根部的明場圖像,標尺為50 μm;a圖中白色箭頭所指為侵染釘;c和d圖中白色箭頭所指為真菌M.bolleyi在細胞間隙或胞內的擴展和定殖

2.3 擬南芥根部—內生真菌—寄生疫霉互作的細胞學特征分析

結果表明,對照溶液預處理后接種帶有GFP的寄生疫霉轉化子24 hpi,可以在擬南芥根部細胞間隙發(fā)現(xiàn)大量寄生疫霉菌絲擴展(圖3-a);至48 hpi,菌絲已完全擴展并定殖于根組織內,并可觀察到強烈的綠色熒光信號(圖3-b)。相較之下,真菌M.bolleyi孢子懸浮液預處理后接種寄生疫霉轉化子24 hpi(圖3-c)和48 hpi(圖3-d),根內寄生疫霉的菌絲生長和擴展均受到明顯抑制,綠色熒光強度也明顯減弱,且擴展范圍更小。該結果表明,真菌M.bolleyi在一定程度上可減輕寄生疫霉對植物根部的侵染。由此揭示擬南芥根部—內生真菌—寄生疫霉互作體系的建立,而該模式互作體系將有助于進一步探究內生真菌影響植物抗疫霉菌的功能與作用機制。

分別在真菌M.bolleyi孢子懸浮液和對照溶液預處理的擬南芥根部接種帶有GFP的寄生疫霉轉化子菌絲塊,并利用熒光顯微鏡分別于24 hpi和48 hpi觀察寄生疫霉侵染根組織的細胞學特征。a和b.對照溶液(0.002% Tween 20)預處理后接種寄生疫霉菌絲塊24 hpi和48 hpi寄生疫霉侵染狀況;c和d.真菌M.bolleyi孢子懸浮液預處理后接種寄生疫霉菌絲塊24 hpi和48 hpi寄生疫霉侵染狀況。GFP信號在特定激發(fā)光下(488 nm)進行觀察,標尺為50 μm

2.4 真菌M.bolleyi影響植物與寄生疫霉互作的鑒定分析

利用內生真菌—寄生疫霉—擬南芥三方互作模式體系,進一步鑒定分析真菌M.bolleyi影響寄生疫霉與擬南芥根部互作的生物學功能。首先,對10 d苗齡的擬南芥根部分別進行對照溶液(0.002% Tween 20)(圖4-a)和真菌M.bolleyi孢子懸浮液預處理(圖4-b),并于處理24 h后在根部接種帶有GFP的寄生疫霉轉化子菌絲塊。分別于接菌24 hpi、36 hpi和48 hpi測量并計算寄生疫霉侵染擬南芥根部的根長比,以評估鑒定擬南芥與寄生疫霉親和互作的狀態(tài)。侵染根長比值越小,表明植物受寄生疫霉菌侵染的程度越弱,即感病性越弱。結果表明,對照預處理的擬南芥根部接種寄生疫霉后,從24 hpi至48 hpi,寄生疫霉侵染根長比從19.51%增至42.66%,說明疫霉菌在擬南芥根部成功定殖和擴展。與之相比,真菌M.bolleyi孢子懸浮液預處理的擬南芥根部接種寄生疫霉24 hpi至48 hpi,寄生疫霉侵染根長比亦從14.23%增至29.43%;然而,相較于對照預處理組,其寄生疫霉侵染根長比于24 hpi、 36 hpi和48 hpi分別降低27.1%、11.6%和 45.0%,且差異顯著(P<0.05)(圖4-c)。該結果初步揭示真菌M.bolleyi有助于減輕擬南芥對寄生疫霉的感病性。由此亦表明,通過內生真菌—寄生疫霉—擬南芥三方互作體系,可實現(xiàn)快速鑒定與分析真菌影響植物與疫霉菌親和互作的 功能。

生長于1/2 MS培養(yǎng)基10 d的擬南芥根部分別于對照溶液(0.002% Tween 20)預處理(a)和真菌M.bolleyi孢子懸浮液預處理(b)24 h后,接種帶有GFP的寄生疫霉菌絲塊,用于后續(xù)測量并計算侵染根長比值;c.對照溶液(0.002% Tween 20)與真菌M.bolleyi孢子懸浮液預處理24 h后,分別于接種寄生疫霉24 hpi、36 hpi和48 hpi選取根樣,利用熒光顯微鏡測量寄生疫霉侵染根長及根總長,并計算侵染根長比率。誤差線代表標準差,利用t檢驗進行差異顯著性驗證,*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。3次獨立試驗均獲得相似結果

3 討論與結論

中國是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國[1],但在實際生產(chǎn)中病害嚴重,目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用化肥與化學藥劑仍是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的首選[4],然而長期使用化學肥料和藥劑對土壤的微生物群落結構和土壤的理化性質造成嚴重破壞[3]。植物內生真菌不僅對宿主植物不會產(chǎn)生危害,還能夠增強植物的抗逆性[11],抵抗外來病原菌的侵害[12]。然而在以往的研究中缺乏成熟的植物—疫霉菌—內生真菌三方互作研究體系,導致不能深入解析有益真菌影響植物抗病抗逆生物學功能及互作 機制。

在本研究中,以影響馬鈴薯晚疫病害發(fā)生的潛在內生真菌M.bolleyi為例,通過熒光顯微鏡觀察分析M.bolleyi侵染植物根部的細胞學特征,表明其能入侵植物根部,剛開始形成侵染釘定殖在根部細胞中,并逐漸擴展至根部皮層細胞,且未觀察到維管束解體和細胞壞死的現(xiàn)象,具有典型的內生真菌特征。這與之前研究報道一致,M.bolleyi是一種能夠廣泛定殖在植物根內的內生真菌,尤其是在小麥、大麥、燕麥等禾本科植物的根內最為常見[25]。通過觀察分析擬南芥根部與真菌M.bolleyi和寄生疫霉三方互作的細胞學特征,揭示真菌M.bolleyi能夠影響植物與寄生疫霉的親和互作,從而構建根部內生真菌—寄生疫霉—擬南芥三方互作模式研究體系。基于該互作體系,進一步分析真菌M.bolleyi影響寄生疫霉侵染根長比的水平變化,鑒定到候選真菌M.bolleyi有助于減輕植物對寄生疫霉的感病性。這與其他研究報道一致,M.bolleyi是一種潛在的有益內生真菌,它對鐮孢菌等病原菌起到良好的抑制效果[26]。這些結果表明真菌M.bolleyi在植物抗疫霉屬卵菌病害中具有潛在的應用價值。但有關多方互作的機制尚不明確,因此,該模式體系的建立有助于深入解析植物—病原菌—益生真菌互作機制。

在整個植物—疫霉菌—內生真菌三方互作研究體系建立中,本研究采用蘸根法接種內生真菌M.bolleyi孢子懸浮液,保證了擬南芥根部可以充分接種試驗真菌,增加了后續(xù)試驗的可靠性;并且試驗選用穩(wěn)定表達GFP的寄生疫霉轉化子作為指示病菌,即將寄生疫霉菌絲在擬南芥根部侵染的長度轉化為熒光顯微鏡下準確觀察到綠色熒光的長度,既使得寄生疫霉對擬南芥根部的侵染可視化,增加了試驗數(shù)據(jù)的準確性;在數(shù)據(jù)測量方面,試驗使用圖像處理軟件ImageJ來擬合根部形態(tài)測量寄生侵染長度,大大降低以往通過肉眼估計抗性產(chǎn)生的主觀因素誤差。從試驗方法上考慮,本研究采用了菌絲塊皿內接菌野生型擬南芥Col-0根部的方法,該方法操作簡便,且可通過測量并計算擬南芥Col-0的侵染根長比來比較寄生疫霉對擬南芥Col-0的侵染程度,可量化寄生疫霉侵染程度,且可操作性強。此外,選用模式植物擬南芥主要原因是其具有豐富的遺傳轉化材料,生長周期短,可直接在培養(yǎng)皿內進行試驗,能節(jié)省培養(yǎng)空間,試驗的環(huán)境因素穩(wěn)定可控,因此所得的測試結果相對可靠。

綜上所述,本研究以馬鈴薯根部內生真菌M.bolleyi為例,構建馬鈴薯根部內生真菌—寄生疫霉—擬南芥三方互作模式研究體系?；诖?初步揭示了真菌M.bolleyi侵染植物根部的細胞學特征,并鑒定分析了真菌M.bolleyi影響植物抗疫霉菌的生物學功能。這為后續(xù)挖掘馬鈴薯根內生有益真菌資源,并深入解析植物與病原菌和有益真菌的互作機制奠定了基礎。