齊紅莉,呂湘琳,劉家樂

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300392)

亞硝酸鹽是水生生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的自然組成部分,是一種常見的環(huán)境污染物[1-2]。在天然水體中,亞硝酸鹽通常保持在較低質(zhì)量濃度(<0.02 mg·L-1)[3-4],隨著近年來含氮污水、集約化養(yǎng)殖、高氮排泄物和高投餌量的影響,水體中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度急劇增長。在廢水中,亞硝酸鈉質(zhì)量濃度可達(dá)到90 mg·L-1的水平[5]。此外,在水生生物集約養(yǎng)殖的水域中,亞硝酸鹽增加,其中在封閉的金魚(Carassiusauratus)幼魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為0.24～0.30 mg·L-1[6];工業(yè)化養(yǎng)殖南美白對蝦(Penaeusvarlnamei)水體中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度可達(dá)4.70 mg·L-1[7]。高濃度的亞硝酸鹽是引發(fā)水生生物壓力的潛在因素,對水生生態(tài)系統(tǒng)中亞硝酸鹽的生態(tài)毒性研究引起了學(xué)者的關(guān)注[8]。

纖毛蟲被廣泛認(rèn)為是環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)早期預(yù)警的指示生物,它們獨(dú)特的生物特性,如高度多樣性、生命周期短、世界性分布、易于收集、數(shù)量大以及對環(huán)境干擾反應(yīng)迅速[5]。此外,纖毛蟲作為評估污染物毒理效應(yīng)的模型生物[9-11]。鹽蠶豆蟲(Fabreasalina)隸屬于纖毛蟲門(Ciliophora)多膜綱(Polyhymenophora)異毛目(Hetootricha)蠶豆蟲屬(Fabrea)。其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),繁殖周期快,作為海洋魚類幼魚階段的活飼料可進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖[12-14]。氮營養(yǎng)鹽可被原生動(dòng)物利用,但高濃度的氮營養(yǎng)鹽可對其產(chǎn)生脅迫作用。纖毛蟲對亞硝酸鹽的耐受性較高,是富營養(yǎng)浮游生態(tài)系統(tǒng)反硝化的主要貢獻(xiàn)者[15-16]。因此,探究氮對原生動(dòng)物的作用將為揭示原生動(dòng)物對水體營養(yǎng)化水平的響應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。

本文以鹽蠶豆蟲為材料,研究亞硝酸鹽對鹽蠶豆蟲的毒理學(xué)作用,以確定環(huán)境中氮營養(yǎng)鹽變化對鹽蠶豆蟲的種群動(dòng)力學(xué)特征和抗氧化酶系統(tǒng)的影響,為原生動(dòng)物對亞硝態(tài)氮脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持,為水生生態(tài)環(huán)境的亞硝態(tài)氮污染的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽蠶豆蟲(F.salina)采自天津市北大港沿岸濕地[17]。試驗(yàn)前,使用鹽度為50 g·L-1的滅菌人工海水進(jìn)行培養(yǎng)[18],以商業(yè)干酵母為食,在溫度(28±1)℃、光照度2 000 lx、光/暗培養(yǎng)時(shí)間為14 h/10 h恒溫培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng),當(dāng)其密度達(dá)到4×104個(gè)·L-1時(shí),開展試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞硝酸鈉脅迫毒性試驗(yàn)采用水生生物毒性試驗(yàn)方法[19],預(yù)試驗(yàn)測定出亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲的96 h半致死濃度(LC50)為2 358.27 mg·L-1,最低有效濃度(LOEC)為154 mg·L-1。以96 h LOEC為最大濃度,按等對數(shù)間距法設(shè)置正式試驗(yàn)濃度,分別為:0、9.63、19.25、38.50、77.00和154.00 mg·L-1。在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入3 mL鹽度為50 g·L-1的人工海水,鹽蠶豆蟲的接種密度為4 個(gè)·mL-1,每隔24 h于解剖鏡下觀察計(jì)數(shù)鹽蠶豆蟲的種群密度[20],每個(gè)質(zhì)量濃度組重復(fù)3次,計(jì)數(shù)重復(fù)2次,計(jì)數(shù)誤差不超過15%。

1.2.2 抗氧化酶活性的毒性試驗(yàn)參考Li等[21]的方法,將鹽蠶豆蟲轉(zhuǎn)移到設(shè)置好濃度的處理組中用于藥物處理試驗(yàn)。以亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲的96 h LC50的1/10為最大濃度,按等對數(shù)間距法設(shè)置的亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為0、91.0、153.0和235.8 mg·L-1。在50 mL錐形瓶中進(jìn)行試驗(yàn),每個(gè)處理重復(fù)3次,鹽蠶豆蟲的密度約為1×106個(gè)·L-1。不同處理組,在不同間隔時(shí)間點(diǎn)(12、24、36和48 h)用5 μm孔徑的濾膜于真空泵中抽濾并分別收集待測定鹽蠶豆蟲,隨后在研缽中加入1 mL裂解緩沖液進(jìn)行粗酶提取,全過程在冰浴中完成。將研磨好的樣品在4 ℃、3 000 r·min-1離心5 min,取上清液,按照南京建成試劑盒說明測定鹽蠶豆蟲抗氧化酶活性(SOD、CAT、POD、GPx、總蛋白)。

1.3 種群動(dòng)力學(xué)參數(shù)及綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)的計(jì)算

原生動(dòng)物的比生長率(μ)根據(jù)式(1)[22]計(jì)算,世代時(shí)間(G)與比生長率(μ)之間的關(guān)系根據(jù)式(2)計(jì)算,綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)值根據(jù)Kim等[23]的方法計(jì)算:

μ=[ln(Ct)-ln(C0)]/t

(1)

G=ln 2/μ

(2)

式中:μ為比生長率,即假設(shè)纖毛蟲的生長為指數(shù)生長時(shí)的生長率[24];C0為初始纖毛蟲的種群密度;Ct為時(shí)間t時(shí)纖毛蟲的種群密度;t為試驗(yàn)時(shí)間(d),即纖毛蟲指數(shù)生長期的持續(xù)時(shí)間;G為世代時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用單因素方差(one-way ANOVA)對種群生長參數(shù)以及抗氧化酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲種群生長的影響

不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫顯著影響鹽蠶豆蟲的種群生長(P<0.05)。亞硝酸鈉處理1 d,鹽蠶豆蟲生長處于停滯期,然后種群生長進(jìn)入指數(shù)增長期并呈現(xiàn)出明顯的差異,5 d后達(dá)到最大種群密度,38.50和154.00 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲的種群生長于2 d的穩(wěn)定期后進(jìn)入衰退期,其他處理組穩(wěn)定期不明顯(圖 1-A)。鹽蠶豆蟲的最大種群密度隨亞硝酸鈉質(zhì)量濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(圖 1-B)。與其他處理組相比,9.63、19.25 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲的最大種群密度升高,其中9.63 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲的最大種群密度顯著高于對照組,顯著促進(jìn)鹽蠶豆蟲的種群生長(P<0.05)。而38.50、77.00和154.00 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲的最大種群密度則顯著低于對照組(P<0.05),抑制鹽蠶豆蟲的種群生長。

圖1 鹽蠶豆蟲在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫下的種群密度(A)和最大種群密度(B)Fig.1 The population densities(A)and maximum population densities(B)of Fabrea salina underdifferent concentration of sodium nitrite stress不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences at 0.05 level among treatment groups. The same as follows.

從表1可知:各處理組的鹽蠶豆蟲比生長率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。與對照組相比,9.63 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲的種群生長率增加了8.8%,而19.25、38.50、77.00和154.00 mg·L-1處理抑制鹽蠶豆蟲的比生長率,其中154.00 mg·L-1處理抑制作用最強(qiáng),比生長率顯著下降了20.59%(P<0.05)。各處理組的鹽蠶豆蟲的世代時(shí)間呈先縮短后延長的變化趨勢,世代時(shí)間的峰值出現(xiàn)在154.00 mg·L-1處理組(P<0.05),最低值出現(xiàn)在9.63 mg·L-1處理組。

表1 鹽蠶豆蟲在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫下的比生長率(μ)和世代時(shí)間(G)

2.2 亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲抗氧化酶活性的影響

從圖2可知:亞硝酸鈉脅迫下,12、24和48 h時(shí)鹽蠶豆蟲SOD活性隨亞硝酸鈉質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢。24 h時(shí),不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫下SOD活性變化不顯著(P>0.05);36 h時(shí),亞硝酸鈉處理組的SOD活性顯著低于對照組(P<0.05)。12和24 h時(shí)鹽蠶豆蟲CAT活性呈先上升后下降的趨勢,91.0和153.0 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲CAT的活性均顯著上升,并在24 h達(dá)到峰值,分別為對照組的4.32倍和4.55倍(P<0.05);在36 h時(shí),CAT活性與對照組水平相當(dāng)(P>0.05)。12和24 h時(shí),鹽蠶豆蟲的GPx活性總體上呈先上升后下降的趨勢;36 h時(shí),153.0和235.8 mg·L-1處理組鹽蠶豆蟲的GPx活性顯著增加(P<0.05)。鹽蠶豆蟲POD活性隨亞硝酸鈉質(zhì)量濃度的增加而增加,高濃度處理組(153.0和235.8 mg·L-1)鹽蠶豆蟲的POD活性顯著增加(P<0.05),而低濃度處理組(91.0 mg·L-1)的POD活性與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

圖2 鹽蠶豆蟲在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫下的抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activity of F.salina under different concentration of sodium nitrite stress

2.3 亞硝酸鈉對綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)的影響

在亞硝酸鈉脅迫下,不同處理時(shí)間鹽蠶豆蟲的劑量-效應(yīng)分析見圖3。153.0和235.8 mg·L-1處理組中IBR值隨處理時(shí)間的延長呈先下降后上升的趨勢,91.0 mg·L-1處理組在不同處理時(shí)間下變化不明顯,并且始終低于對照組。12 h時(shí),高濃度組(153.0和235.8 mg·L-1)IBR值高于低濃度組(0和91.0 mg·L-1),153.0 mg·L-1組于24～36 h時(shí)下降,且低于對照組,48 h時(shí)增加。235.8 mg·L-1處理組36～48 h時(shí)IBR呈上升趨勢,高于其他處理組。

圖3 鹽蠶豆蟲在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫下的整合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)的變化Fig.3 Changes of integrated biomarker response(IBR)ofF.salina under different concentration ofsodium nitrite stress

生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)星狀圖見圖4。由4種生物標(biāo)志物(SOD、CAT、GPx、POD)響應(yīng)得分構(gòu)成的星狀圖面積即為IBR值,星狀圖面積越大則代表亞硝酸鈉脅迫對鹽蠶豆蟲的毒性越大。12 h時(shí),SOD對星狀圖貢獻(xiàn)最大,與對照組相比,153.0 mg·L-1亞硝酸鈉處理組星狀圖覆蓋面積最大;24 h時(shí),CAT對星狀圖貢獻(xiàn)最大,0和153.0 mg·L-1處理組星狀圖面積較大,91.0和235.8 mg·L-1處理組對GPx和CAT響應(yīng)較小;36 h時(shí),不同濃度亞硝酸鈉對生物標(biāo)志物的響應(yīng)情況不同,0 mg·L-1處理組主要引起SOD的響應(yīng),235.8 mg·L-1處理組主要引起GPx和POD的響應(yīng),其中235.8 mg·L-1處理組星狀圖面積最大,153.0 mg·L-1處理組星狀圖面積最小;48 h時(shí),與對照組相比各亞硝酸鈉處理組抑制GPx的響應(yīng),引起CAT和SOD響應(yīng),235.8 mg·L-1處理組星狀圖面積最大,IBR值最高。

圖4 鹽蠶豆蟲在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉脅迫下的IBR星狀圖Fig.4 IBR star plots of F.salina under different concentration of sodium nitrite stress

3 討論

3.1 亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲種群生長的影響

纖毛蟲種群生長均符合邏輯斯蒂增長曲線,即細(xì)胞在進(jìn)行分裂前都有一段停滯期,隨后進(jìn)入指數(shù)生長期、穩(wěn)定期及衰退期[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,鹽蠶豆蟲在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鈉水體中的種群增長符合邏輯斯蒂增長曲線,隨亞硝酸鈉質(zhì)量濃度的增加,對鹽蠶豆蟲種群生長呈低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢。其中,高質(zhì)量濃度組(77.00～154.00 mg·L-1)組亞硝酸鈉脅迫鹽蠶豆蟲的最大種群密度和比生長率顯著低于對照組,對鹽蠶豆蟲的種群生長產(chǎn)生了抑制作用。推斷在一定濃度范圍內(nèi)亞硝酸鹽可以作為機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì),但是超過閾值就會(huì)對水生生物產(chǎn)生抑制效果。陳強(qiáng)等[26]的研究也證實(shí)了水生動(dòng)物對亞硝酸鹽有一定的適應(yīng)能力,但亞硝酸鹽濃度過高會(huì)對水生生物造成免疫損傷。

亞硝酸鹽作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的污染物,多數(shù)學(xué)者研究了亞硝酸鹽對水生生物的毒性。韋永春等[27]研究發(fā)現(xiàn)紅螯蝦(Cheraxquadricariratus)對亞硝酸鹽的安全濃度為2.2 mg·L-1;Huang等[28]發(fā)現(xiàn)南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)可以承受低于6.67 mg·L-1的亞硝酸鹽;王煜恒等[29]研究發(fā)現(xiàn)正常溶氧條件下亞硝酸鹽對中華絨螯蟹(Eriocheirsinenisis)的安全濃度為5.27 mg·L-1。本試驗(yàn)中,在低質(zhì)量濃度組(9.63 mg·L-1)亞硝酸鈉脅迫下鹽蠶豆蟲的最大種群密度顯著高于對照組,促進(jìn)鹽蠶豆蟲的種群生長。與上述水生生物對亞硝酸鹽的耐受性相比,鹽蠶豆蟲對亞硝酸鹽的耐受性較高,因此,纖毛蟲具有維持和改善富營養(yǎng)化的水生生態(tài)系統(tǒng)的潛力,并可作為探究亞硝酸鹽毒理學(xué)機(jī)制的模式生物。

3.2 亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲抗氧化酶活性的影響

亞硝酸鹽是自然水體中存在的一類物質(zhì),正常濃度范圍內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生毒性。若有大量的亞硝酸鹽沉積在養(yǎng)殖水體中,其會(huì)進(jìn)入水生生物的血液和其他組織中,進(jìn)而加速水生動(dòng)物體內(nèi)活性氧的形成,當(dāng)生物系統(tǒng)中活性氧的濃度瞬時(shí)或長期增強(qiáng)時(shí),導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷或死亡[30-31]。本試驗(yàn)中,鹽蠶豆蟲SOD、CAT、GPx和POD的活性均隨亞硝酸鹽處理時(shí)間和濃度的增加而顯著變化,說明海洋類纖毛蟲可通過抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行解毒。

SOD是一種重要的抗氧化酶,SOD催化超氧陰離子分解為過氧化氫,隨后通過CAT或GPx降解為水和氧氣[32]。在本研究中,當(dāng)鹽蠶豆蟲暴露于亞硝酸鈉時(shí),SOD活性總體上呈先上升后下降的趨勢。這與Ruan等[33]的研究基本一致,在苯酚脅迫下扇形游仆蟲(Euplotesvannus)SOD活性也有類似變化。鹽蠶豆蟲SOD活性的增加表明亞硝酸鈉脅迫會(huì)導(dǎo)致蟲體活性氧的積累,為了應(yīng)對體內(nèi)的不利環(huán)境,SOD活性增加以去除體內(nèi)多余的活性氧自由基,而高濃度的亞硝酸鈉會(huì)影響鹽蠶豆蟲正常的代謝活動(dòng),對蟲體造成損傷,導(dǎo)致SOD活性被抑制[34]。

CAT和GPx均是清除過氧化氫的抗氧化酶。本研究中,在12和24 h時(shí)亞硝酸鈉各處理組CAT和GPx活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,中濃度組(91.0和153.0 mg·L-1)鹽蠶豆蟲CAT和GPx活性增加,這與SOD活性變化的結(jié)果相印證。36 h時(shí)CAT活性變化不明顯,GPx活性則被顯著誘導(dǎo),表明在脅迫初期,CAT和GPx一同作用于蟲體內(nèi)過氧化氫的清除,而脅迫后期GPx則成為鹽蠶豆蟲體內(nèi)過氧化氫清除的主要作用酶。類似的CAT和GPx的協(xié)同作用關(guān)系,在其他研究中也有報(bào)道[35]。

POD能清除機(jī)體的過氧化物或氧化物,并且能夠調(diào)節(jié)氧含量,使細(xì)胞免受高濃度氧毒害。本研究結(jié)果表明,在亞硝酸鈉的脅迫下,鹽蠶豆蟲POD活性隨亞硝酸鈉濃度增加總體上呈升高趨勢,高濃度組顯著高于對照組,這與Hu等[36]研究尖吻鱸(Latescalcarifer)在亞硝酸鹽脅迫后POD酶活性增加的變化趨勢結(jié)果相似,亞硝酸鹽脅迫會(huì)引起機(jī)體過氧化物反應(yīng),導(dǎo)致POD活性升高。

3.3 亞硝酸鈉對鹽蠶豆蟲IBR的影響

由于水生生物的生物標(biāo)志物響應(yīng)與水生環(huán)境中的污染物暴露有關(guān),使用各種生物標(biāo)志物對水生生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境污染物的生態(tài)毒性評估引起了人們越來越濃厚的興趣。然而單一生物標(biāo)志物不能完全評價(jià)污染物對水生生物的毒性作用,因此使用IBR可以全面了解生物體如何對污染物暴露做出響應(yīng)[37-38]。在本研究中,12 h時(shí)高濃度亞硝酸鈉(153.0和235.8 mg·L-1)處理組IBR高于對照組,試驗(yàn)初期鹽蠶豆蟲在高濃度亞硝酸鈉脅迫下產(chǎn)生了氧化應(yīng)激,這與GPx和POD活性的變化趨勢相似,并且可見抗氧化酶系統(tǒng)是較敏感的生物標(biāo)志物。低濃度亞硝酸鹽(91.0 mg·L-1)處理組IBR值在整個(gè)處理期間低于對照組,這與SOD、GPx和POD活性的變化趨勢相印證,說明該濃度并未引起鹽蠶豆蟲的氧化應(yīng)激作用,而鹽蠶豆蟲生長受到亞硝酸鹽抑制的原因需要進(jìn)一步探究。153.0和235.8 mg·L-1處理組IBR值在48 h明顯升高,對鹽蠶豆蟲產(chǎn)生了毒性,鹽蠶豆蟲的抗氧化酶系統(tǒng)開始響應(yīng)并逐漸升高以更好地保護(hù)機(jī)體不受到損害。因此,IBR指數(shù)可以大體反映鹽蠶豆蟲抗氧化酶活性的變化,但無法完全揭示亞硝酸鹽對鹽蠶豆種群生長的影響。