劉 然,吳婧波,徐永艷,詹儒林,柳 鳳,姚全勝,李國平,魏 卿

(1 西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明,650224;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點實驗室/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點實驗,廣東湛江,524091;3 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚??？?571101;4 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院,海南三亞,572025)

杧果炭疽病是杧果采前和采后主要病害之一,主要由杧果膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides引起,在我國海南、廣東、云南和四川等主產(chǎn)地造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1-2]。我們前期觀察和研究發(fā)現(xiàn),田間存在豐富的抗感炭疽病杧果種質(zhì)資源[3],且抗感病品種與普通品種的果皮結(jié)構(gòu)存在明顯差異[4]。

果皮在果實抵抗病原侵染過程中發(fā)揮著積極作用。而蠟質(zhì)是果皮角質(zhì)層的重要組成部分,分為具有一定晶體結(jié)構(gòu)的外蠟和由蠟?zāi)じ采w、鑲嵌在外部角質(zhì)的無定形內(nèi)蠟。外蠟是果皮與環(huán)境接觸的第一道屏障,其獨特結(jié)構(gòu)在抵抗病菌侵染過程中表現(xiàn)出一定的物理性阻礙。研究結(jié)果表明,藍(lán)莓[5-6]、秋子梨[7]果實表面蠟質(zhì)被破壞后,其衰老加速,病菌侵染嚴(yán)重;芝麻斑病菌侵染番茄葉片過程中,蠟質(zhì)主要發(fā)揮物理阻礙作用[8];大麥葉片蠟質(zhì)被去除后,有更多銹菌附著孢形成[9];蘋果經(jīng)過熱處理后,蠟質(zhì)裂紋愈合,對病原菌的抵抗力明顯提高[10-13]。

植物蠟質(zhì)的三維晶體結(jié)構(gòu)分為線狀、片狀、顆粒狀、板狀等26種,大小介0.2～100.0 μm之間,需要借助掃描電子顯微鏡(SEM)觀察[14]。不同物種,同物種不同品種,同品種不同生長環(huán)境的蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)不同[15],在植物抗病過程中也發(fā)揮著不同作用。本研究采用膠孢炭疽菌孢子懸浮液無傷接種的方法分析20個杧果品種脫蠟處理前后抗病情況,并利用掃描電子顯微鏡觀察其表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,探究杧果果皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)在抗炭疽病過程中的作用,為研究杧果抗炭疽病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所園藝產(chǎn)品保鮮與加工研究室分離鑒定保存的杧果炭疽病病原菌膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides供試,編號W1,其孢子懸浮液制備參考李志偉等[16]的方法。

2022年7—8月從杧果產(chǎn)區(qū)采集20個杧果品種,其中“熱農(nóng)1號”“金香杧”“湯米06”“咖喱杧”“椰香”“金百花”來自四川省攀枝花市,“玉文”“桂熱杧82號”“紅象牙”“澳杧”“紅凱特”“板蒂”“金星”“肯特”“鷹嘴”“金煌”“貴妃”“臺牙”“凱特”“海頓”來自云南省華坪縣。每個品種從東南西北4個方向隨機采摘成熟度一致、無病斑、無損傷果實各70個。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 每個杧果品種隨機選取果實60個,用清水沖洗晾干后隨即分為兩組,一組為不脫蠟處理,另一組進(jìn)行藍(lán)丁膠粘連脫蠟處理,兩個處理再分別設(shè)置無傷接種病菌和無菌培養(yǎng)液處理,具體接種方法為每個果實表面接種膠孢炭疽菌孢子懸浮液(1×106個/mL)或無菌培養(yǎng)液各20 μL,均接種2個點,并潤濕棉球保濕,放置于接種盒中,室溫26～28 ℃下培養(yǎng)。觀察果實發(fā)病情況,接種2 d和6 d分別調(diào)查各處理發(fā)病率、病斑直徑,并拍照,參考劉羽等[17]的方法計算病情指數(shù)。

1.2.2 果皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)觀察 各品種樣品采摘后用清水緩流沖洗,盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機械損傷,在果實赤道周圍,用無菌手術(shù)刀片切取果皮長2.0 mm、寬1.0 mm、厚1.0 mm樣本后,立刻用2.5%戊二醛固定,pH值7.4 0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次,每次15 min,再依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇各脫水1次,每次15 min,用乙酸異戊酯脫去乙醇3次,每次15 min;樣本放入臨界點干燥儀Quorum K850內(nèi)干燥,用HITACHI MC1000型離子濺射儀鍍金膜,最后用Regulus 8100 型掃描電子顯微鏡觀察拍片。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 使用Excel 2019和SPSS 26.0統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽病發(fā)生情況

從表1和圖1可以看出,不脫蠟處理中,接種病菌孢子懸浮液2 d后,熱農(nóng)1號發(fā)病率最低,為26.67%,病情指數(shù)為19.74;鷹嘴、紅凱特、金香杧、板蒂、臺牙、澳杧、貴妃、湯米06、金煌、桂熱杧82號和玉文發(fā)病率在33.33%～56.67%之間,病情指數(shù)介于23.07～39.23之間。紅象牙等7個品種的發(fā)病率最高,達(dá)到100%;其中椰香、金星、肯特病情指數(shù)介于46.41～51.79之間,金百花、凱特、咖喱杧、紅象牙病情指數(shù)均大于60。脫蠟處理中,除了發(fā)病率100%的品種外,紅凱特、貴妃、海頓接種2 d發(fā)病率與對照(不脫蠟)相同,其他品種接種2 d發(fā)病率均比對照(不脫蠟)升高。說明杧果果皮蠟質(zhì)被破壞后,炭疽菌對部分品種杧果的侵染速度加快。接種后6 d,所有供試杧果品種發(fā)病率均達(dá)到100%,但病斑直徑不同,熱農(nóng)1號、金香杧、板蒂、澳杧、湯米06、金煌、玉文、椰香、金星、紅象牙等10個杧果品種脫蠟處理的病斑直徑較對照(不脫蠟)極顯著增加,說明脫蠟處理的杧果對炭疽病抗性顯著降低。脫蠟處理中,除鷹嘴、紅凱特病情指數(shù)與對照(不脫蠟)相同外,其他品種病情指數(shù)均較對照(不脫蠟)增加,說明脫蠟處理的杧果感染炭疽病后發(fā)病程度更重。

圖1 4個杧果品種果皮脫蠟處理后接種膠孢炭疽菌孢子懸浮液(1×106個/mL)6 d的發(fā)病情況

2.2 果皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化

試驗結(jié)果可以看出,杧果表皮蠟質(zhì)以不規(guī)則血小板狀晶體結(jié)構(gòu)為主,排列緊湊,密度較大,并且在其上會融合疊加形成片層狀蠟質(zhì)膜。與不脫蠟處理相比,脫蠟處理后熱農(nóng)1號果實表皮蠟質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)被破壞,表面孔隙增多,片狀蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)明顯減少(見圖2);湯米06果實表皮蠟質(zhì)的連續(xù)性較差,蠟質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)上縫隙與孔洞較多,不規(guī)則血小板狀晶體結(jié)構(gòu)被破壞,部分晶體結(jié)構(gòu)有下凹(見圖3);椰香果實表皮蠟質(zhì)層的連續(xù)性較好,但蠟質(zhì)表面孔洞與縫隙明顯,表面蠟質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,不規(guī)則血小板狀結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化(見圖4);紅象牙果實表皮蠟質(zhì)層的連續(xù)性好,孔隙與縫隙最多,蠟?zāi)そY(jié)構(gòu)雖被破壞,但蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)無顯著性變化(見圖5)。

圖2 脫蠟處理后熱農(nóng)1號杧果果實表皮結(jié)構(gòu)變化

圖3 脫蠟處理后湯米06杧果果實表皮結(jié)構(gòu)變化

圖4 脫蠟處理后椰香杧果果實表皮結(jié)構(gòu)變化

圖5 脫蠟處理后紅象牙杧果果實表皮結(jié)構(gòu)變化

說明藍(lán)丁膠粘連脫蠟處理可對杧果果實表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)造成一定破壞,從而導(dǎo)致大部分供試杧果品種果實更易受到炭疽菌浸染,發(fā)病速度更快,發(fā)病程度更嚴(yán)重,也證明杧果果皮蠟質(zhì)在炭疽菌浸染過程中發(fā)揮了一定的物理阻礙作用。

3 討論與結(jié)論

杧果抗性研究中,多采用菌塊刺傷和孢子懸浮液噴霧接種法[3,18,19]。菌塊刺傷接種會對杧果果實表面造成損傷,不能較好地反映表面蠟質(zhì)和抗病的關(guān)系;不定量的噴霧接種重復(fù)性稍差。本實驗采用孢子懸浮液無傷定量接種,彌補了前兩種方法的不足,可以更好地驗證果實表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)在杧果抗病過程中的作用。

表面蠟質(zhì)提取的主要方法包括有機溶劑溶解和黏合劑粘連兩種[20]。有機溶劑主要通過三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇等有機溶劑溶解植物蠟質(zhì)成分,溶解速度快、操作簡單,但該方法無法區(qū)分內(nèi)外蠟質(zhì),對果實的損傷較大。黏合劑法主要使用藍(lán)丁膠、阿拉伯樹膠等,可以區(qū)分內(nèi)外蠟質(zhì),但該方法無法完全去除蠟質(zhì)?？紤]到有機溶劑使用對果實損傷程度較大,且氯仿等有機溶劑的殘留可能對真菌的生長發(fā)育產(chǎn)生影響,本試驗選擇藍(lán)丁膠粘連脫蠟法處理杧果。為減小不同操作者的脫蠟處理誤差,我們通過預(yù)試驗規(guī)范制訂粘連杧果果皮蠟質(zhì)處理方法,以確保不同品種杧果果皮脫蠟處理一致。

試驗結(jié)果表明,脫蠟處理前后鷹嘴、紅凱特、臺牙、貴妃、桂熱杧82號等5個杧果品種接種6 d病斑直徑無顯著性差異,且發(fā)病率均未達(dá)到100%,推測這些品種果實表皮蠟質(zhì)較難破壞,是否屬于耐貯運品種,有待進(jìn)一步驗證。植物抵抗病原菌侵染是一個復(fù)雜的過程。研究發(fā)現(xiàn),蘋果梨果皮蠟質(zhì)能夠抑制Alternariaalternata分生孢子萌發(fā)和侵染菌絲形成[21],而不同植物的蠟質(zhì)成分不同,發(fā)揮的作用也不同[22-23]。供試杧果品種的蠟質(zhì)成分是否為其炭疽病菌抗性顯著差異的關(guān)鍵因子,也有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明,供試杧果品種的果皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)在炭疽菌浸染過程中發(fā)揮了一定的物理阻礙作用。這為杧果抗炭疽病機制研究及選育優(yōu)良抗病品種提供了參考。