李婷婷,陳 紅

(貴州大學(xué)/國(guó)家林業(yè)和草原局刺梨工程技術(shù)研究中心,貴陽,550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)是中國(guó)特有的果樹資源,具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。近年來,刺梨已作為貴州省重要的特色果樹產(chǎn)業(yè)被大力發(fā)展,但現(xiàn)有品種主要是通過野生馴化而來,且品種比較單一,遠(yuǎn)不能滿足廣大消費(fèi)者的多元化需求,因此,開展資源創(chuàng)新及新品種培育勢(shì)在必行。植物細(xì)胞工程作為資源創(chuàng)新的有效手段,已在月季[1]、桑樹[2]、柑桔[3]、火龍果[4]等很多園藝植物上被廣泛應(yīng)用并獲得了變異植株。此外,通過完善的離體再生體系已成功獲得了獼猴桃[5]和蘋果[6]的轉(zhuǎn)基因植株。目前,在刺梨上通過植物細(xì)胞工程手段創(chuàng)建新材料的研究鮮見報(bào)道,僅個(gè)別研究者對(duì)刺梨花藥[7]和未受精胚珠[8]的愈傷組織誘導(dǎo)等進(jìn)行了研究,并分化出少量的類原球莖,但最終未能萌發(fā)成植株。其主要原因是刺梨含有大量的酚類化合物[9-11],易導(dǎo)致愈傷組織褐化死亡,使得刺梨離體再生體系的建立極為困難。近年來,已有相關(guān)學(xué)者采用吸附劑或抑制劑抑制刺梨愈傷組織褐化[12],但刺梨愈傷組織褐化機(jī)理尚未見深入系統(tǒng)的研究報(bào)道。相關(guān)研究表明,愈傷組織發(fā)生褐化的原因與愈傷組織中酚類化合物的含量及多酚氧化酶(PPO)活性、過氧化物酶(POD)活性有直接關(guān)系[13-21],抑制酚類物質(zhì)的形成、提高POD活性、降低PPO活性的確可以減輕褐化[22-26]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),硝酸銀(AgNO3)抑制刺梨愈傷組織褐化的效果是最佳的。因此,本研究則以4種基因型刺梨葉片愈傷組織為試材,在培養(yǎng)基中添加不同濃度AgNO3,測(cè)定在培養(yǎng)過程中總酚含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性的動(dòng)態(tài)變化,分析愈傷組織褐化與總酚含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性之間的關(guān)系,探討引起刺梨愈傷組織褐化的生理機(jī)制,篩選抑制褐化效果最佳的AgNO3濃度,為控制刺梨愈傷組織褐化提供理論依據(jù),為刺梨再生體系的建立以及資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料供試刺梨品種為“貴農(nóng)1號(hào)”“貴農(nóng)2號(hào)”“貴農(nóng)5號(hào)”“貴農(nóng)7號(hào)”,以各品種繼代兩次的幼嫩葉片愈傷組織為試材。試驗(yàn)前的葉片愈傷組織培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,光照培養(yǎng)時(shí)間為16 h/d,培養(yǎng)時(shí)間為30 d。

1.2 方法選擇生長(zhǎng)健壯的愈傷組織分別接種于添加不同濃度AgNO3(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L)的MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基上,以未添加AgNO3作為對(duì)照。每個(gè)處理分別接種30瓶,每瓶接種愈傷組織5～8團(tuán),重復(fù)3次。接種后培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx,光照時(shí)間12 h/d,溫度(25±0.5) ℃。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)褐化率。褐化率=(褐化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%。培養(yǎng)10、20、30 d分別測(cè)定總酚含量、過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性。

總酚含量的測(cè)定使用北京索萊寶科技有限公司的植物總酚含量檢測(cè)試劑盒,每個(gè)重復(fù)3次[27]。經(jīng)測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.418 4x+0.071 8(R2=0.991 3)?？偡雍?mg/g)=2.5y÷m。式中:y為標(biāo)準(zhǔn)管濃度;m為樣本質(zhì)量,0.1 g。

POD活性的測(cè)定使用北京索萊寶科技有限公司的過氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒,每個(gè)處理3次重復(fù)[28]。每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中470 nm處吸光值變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。POD(U/g)=(4 900×ΔA)÷m。式中:ΔA=A2-A1;m為樣本質(zhì)量,0.1 g。

PPO活性測(cè)定使用北京索萊寶科技有限公司的過氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒,每個(gè)處理3次重復(fù)[29]。每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中410 nm處吸光值變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。PPO(U/g)=(120×ΔA)÷m。式中:ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照;m為樣本質(zhì)量,0.1 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用IBM SPSS STATISTIC 23.0軟件進(jìn)行分析并用R包繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO3對(duì)刺梨愈傷組織褐化的影響試驗(yàn)結(jié)果看出,不同基因型葉片愈傷組織褐化率隨AgNO3濃度升高的變化一致,均為先降低后升高,當(dāng)AgNO3濃度為0.4 g/L時(shí)葉片愈傷組織褐化率均達(dá)到最低值;同一基因型,不同AgNO3濃度間的褐化率差異極顯著(p<0.01);不同AgNO3濃度處理褐化率的大小關(guān)系在不同基因型間表現(xiàn)一致(見表1)。4種基因型葉片愈傷組織在添加不同濃度AgNO3的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d生長(zhǎng)狀態(tài)見圖1、圖2、圖3和圖4。

圖1 不同濃度AgNO3對(duì)“貴農(nóng)1號(hào)”刺梨葉片愈傷組織褐化的影響

圖2 不同濃度AgNO3對(duì)“貴農(nóng)2號(hào)”刺梨葉片愈傷組織褐化的影響

圖3 不同濃度AgNO3對(duì)“貴農(nóng)5號(hào)”刺梨葉片愈傷組織褐化的影響

圖4 不同濃度AgNO3對(duì)“貴農(nóng)7號(hào)”刺梨葉片愈傷組織褐化的影響

表1 不同濃度AgNO3下刺梨葉片愈傷組織的褐化率

2.2 AgNO3對(duì)刺梨愈傷組織總酚含量的影響

相同培養(yǎng)時(shí)間,“貴農(nóng)5號(hào)”刺梨葉片愈傷組織總酚含量隨培養(yǎng)基中AgNO3濃度增加呈先降低后回升,對(duì)照(0 g/L,未添加AgNO3)的總酚含量均高于添加AgNO3的處理。在培養(yǎng)10、20和30 d,均以AgNO30.4 g/L處理的總酚含量最低,分別為148.67、139.32和148.11 mg/g?？偡雍吭降?褐化越輕。綜合分析,以AgNO30.4 g/L培養(yǎng)20 d的效果最好(見表2)。

表2 “貴農(nóng)5號(hào)”刺梨葉片愈傷組織在不同濃度AgNO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)的總酚含量

2.3 AgNO3對(duì)刺梨愈傷組織過氧化物酶活性的影響相同培養(yǎng)時(shí)間,“貴農(nóng)5號(hào)”葉片愈傷組織POD活性隨AgNO3濃度升高表現(xiàn)為先升高后降低,均以AgNO3濃度為0.4 g/L時(shí)最高。培養(yǎng)10和20 d,AgNO3各處理的POD活性均高于對(duì)照(0 g/L,未添加AgNO3);培養(yǎng)30 d,除AgNO30.5 g/L處理的POD活性與對(duì)照無顯著差異外,其余各AgNO3處理的POD活性均高于對(duì)照。AgNO30.4 g/L處理下培養(yǎng)20 d,葉片愈傷組織POD活性最高,為49.00 U/g(見表3)。

表3 “貴農(nóng)5號(hào)”刺梨葉片愈傷組織在不同濃度AgNO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過氧化物酶活性

2.4 AgNO3對(duì)刺梨愈傷組織多酚氧化酶PPO活性的影響相同培養(yǎng)時(shí)間,愈傷組織PPO活性隨AgNO3濃度增加先降低再小幅回升,各AgNO3處理的PPO活性均極顯著低于對(duì)照(未添加AgNO3),其中AgNO30.4 g/L處理的PPO活性最低。這表明添加AgNO3處理均可降低PPO活性。其中,AgNO30.4 g/L處理下培養(yǎng)20 d,葉片愈傷組織PPO活性最低,為17.76 U/g(見表4)。

表4 “貴農(nóng)5號(hào)”刺梨葉片愈傷組織在不同濃度AgNO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)的多酚氧化酶活性

2.5 總酚含量、POD活性、PPO活性與褐化率的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果表明,刺梨葉片愈傷組織總酚含量與褐化率呈極顯著(p<0.01)正相關(guān)性,培養(yǎng)10、20和30 d的相關(guān)系數(shù)分別為0.818、0.922和0.947。POD活性與褐化率呈極顯著(p<0.01)負(fù)相關(guān),培養(yǎng)10、20和30 d的相關(guān)系數(shù)分別為-0.936、-0.896和-0.701。PPO活性與褐化率呈極顯著(p<0.01)正相關(guān),培養(yǎng)10、20和30 d的相關(guān)系數(shù)分別為0.949、0.984和0.980。同時(shí),總酚含量與POD活性之間和POD活性與PPO活性之間呈極顯著負(fù)相關(guān),總酚含量與PPO活性之間呈極顯著正相關(guān)(見圖5)。

注:總酚、POD和PPO后數(shù)字指培養(yǎng)時(shí)間(單位為d);**表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

3 討論

3.1 AgNO3的抗褐化作用AgNO3作為抗褐化劑用于園藝植物的組織培養(yǎng)[12,30-36],不僅可促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng),還可有效控制褐化的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加AgNO3能夠影響葡萄愈傷組織酚類物質(zhì)的含量[32],而減少酚類物質(zhì)合成可以有效減輕褐化[22,34]。在本研究中,添加AgNO3各處理的刺梨葉片愈傷組織的褐化率明顯低于對(duì)照(未添加AgNO3),這可能是因?yàn)榭偡拥男纬墒艿揭种?繼而減少了醌類物質(zhì)的形成,降低了刺梨葉片愈傷組織褐化的程度。當(dāng)AgNO3濃度為0.4 g/L時(shí),4個(gè)基因型刺梨的葉片愈傷組織褐化率均達(dá)到最低值,與其他處理存在極顯著差異。當(dāng)AgNO3濃度升為0.5 g/L時(shí),4個(gè)基因型刺梨的葉片愈傷組織褐化率又明顯升高,這可能是因?yàn)锳g+是重金屬,其增加至一定濃度會(huì)破壞植物體內(nèi)的酶蛋白結(jié)構(gòu),細(xì)胞的代謝活動(dòng)因此受阻,繼而產(chǎn)生了毒害作用[34]。

3.2 AgNO3抑制褐化的機(jī)理本研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加AgNO3后,刺梨葉片愈傷組織PPO活性和總酚含量均低于對(duì)照(未添加AgNO3),這與鄭超等[24]、岑忠用等[25]和許傳俊等[26]的研究結(jié)果相似。說明,添加適宜濃度的AgNO3有利于降低刺梨葉片愈傷組織的PPO活性,同時(shí)能抑制其總酚的形成和積累,從而表現(xiàn)出抗褐化作用。當(dāng)AgNO3濃度升高至0.5 g/L時(shí),可能由于部分AgNO3與某些氨基酸發(fā)生反應(yīng)生成棕褐色物質(zhì),反而在一定程度上加劇了刺梨葉片愈傷組織褐化的程度,導(dǎo)致了細(xì)胞的損傷和死亡,繼而提高了PPO活性。培養(yǎng)10、20和30 d時(shí),均是褐化嚴(yán)重的刺梨葉片愈傷組織的POD活性低于褐化程度較輕的POD活性,說明POD參與了刺梨葉片愈傷組織的褐化過程,POD脫除組織中的過氧化氫和超氧陰離子,保護(hù)細(xì)胞膜的通透性,能抑制褐化現(xiàn)象的發(fā)生[36]。本試驗(yàn)表明,隨著培養(yǎng)基中AgNO3濃度的增加,刺梨葉片愈傷組織POD活性、PPO活性和總酚含量呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化,適宜濃度的AgNO3處理有利于降低刺梨愈傷組織的PPO活性,提高POD活性,抑制總酚的形成和積累,從而可抑制愈傷組織的褐化。

4 結(jié)論

在培養(yǎng)基中添加0.4 g/L AgNO3抑制刺梨葉片愈傷組織褐化的效果最好,供試不同刺梨品種中“貴農(nóng)5號(hào)”的葉片愈傷組織褐化程度最輕。在添加0.4 g/L AgNO3的培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d時(shí),刺梨葉片愈傷組織的總酚含量最低,POD活性最高,PPO活性最低。刺梨葉片愈傷組織總酚含量、PPO活性分別與褐化率呈極顯著正相關(guān),POD活性與褐化率呈極顯著負(fù)相關(guān)。