劉煒鑫 陳曉玲 李 蒙 王君霞 張緒濤黃 騫 李才文,4,5①

(1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2.日照市海洋與漁業(yè)研究院 山東日照276826; 3.嶗山實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;5.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(Portunus), 是我國(guó)沿海的重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類之一, 養(yǎng)殖區(qū)域主要涵蓋江蘇、山東半島、浙江、福建、廣東等沿海地區(qū), 其2021年產(chǎn)量超過10萬噸(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2022)。日照是山東省沿海地市三疣梭子蟹規(guī)?；B(yǎng)殖的重要區(qū)域, 已有20 多年的養(yǎng)殖歷史。2007 年以來, 日照地區(qū)養(yǎng)殖三疣梭子蟹頻繁發(fā)病發(fā)生大規(guī)模死亡事件; 病蟹個(gè)體主要表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、溜邊, 停止攝食, 逐漸消瘦, 體重下降; 病蟹肌肉呈現(xiàn)白濁、乳黃色病變, 打開病蟹殼后通?？梢姶罅奎S白色、乳白色液體, 伴隨有空腸、空胃等情況, 據(jù)此當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶將該病害稱為“牙膏病”或“牛奶病”。夏季暴發(fā)期間, 養(yǎng)殖池塘中梭子蟹死亡率達(dá)到60%～80%, 給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

血卵渦鞭蟲(Hematodiniumspp.)是一類主要感染海水甲殼類的致病性寄生甲藻(parasitic dinoflagellates),在世界范圍內(nèi)感染40 多種蟹、蝦類, 其中包括美國(guó)蘭蟹、挪威龍蝦、帝王蟹、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹等多種重要經(jīng)濟(jì)物種(Small, 2012; Stentifordet al, 2015;Liet al, 2021)。該寄生甲藻主要寄生于海水甲殼類動(dòng)物的血淋巴和組織血腔中; 感染后期, 寄生甲藻在宿主體內(nèi)大量增殖, 導(dǎo)致宿主的心臟、肝胰腺、鰓等重要器官發(fā)生功能失調(diào)乃至喪失, 最終造成宿主死亡(Fieldet al, 1995; Tayloret al, 1996; Sheppardet al,2003)。近年來, 在我國(guó)浙江舟山、廣東汕頭、山東青島、河北黃驊等沿海地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖區(qū)均報(bào)道發(fā)現(xiàn)了血卵渦鞭蟲流行病發(fā)生, 且三疣梭子蟹(P.trituberculatus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)和脊尾白對(duì)蝦(Exopalaemon carinicauda)等我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物均可被感染(許文軍等, 2007a, 2007b; Liet al, 2008; Xuet al, 2010;劉順等, 2014; Wanget al, 2017)。近年來, 血卵渦鞭蟲的流行區(qū)域和宿主種類持續(xù)增加, 已成為影響海水經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物漁業(yè)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新型流行性病原(Stentifordet al, 2005; Small, 2012; Liet al, 2021)。

課題組前期在日照地區(qū)采集的養(yǎng)殖梭子蟹樣品中發(fā)現(xiàn)存在血卵渦鞭蟲感染, 為進(jìn)一步探究該區(qū)域夏季養(yǎng)殖三疣梭子蟹大規(guī)模死亡的原因和流行病發(fā)生過程, 本研究對(duì)日照沿海地區(qū)的主要梭子蟹養(yǎng)殖區(qū)域開展了系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查, 并對(duì)該區(qū)域內(nèi)代表性養(yǎng)殖池塘進(jìn)行了連續(xù)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè), 以解析該地區(qū)血卵渦鞭蟲流行病發(fā)生的生態(tài)學(xué)過程, 為防控三疣梭子蟹血卵渦鞭蟲流行病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年8 月, 在日照市主要三疣梭子蟹養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行了血卵渦鞭蟲感染情況調(diào)查, 自東港區(qū)兩城鎮(zhèn)和經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)的發(fā)病池塘分別采集了23和26 只養(yǎng)殖三疣梭子蟹成蟹, 于濕潤(rùn)、低溫、充氧條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,后根據(jù)檢測(cè)方法要求分別采集血淋巴、組織樣品進(jìn)行血卵渦鞭蟲形態(tài)學(xué)觀察及組織病理檢測(cè)。

2021 年5～9 月, 在日照市兩城鎮(zhèn)一梭子蟹養(yǎng)殖池塘進(jìn)行了血卵渦鞭蟲流行病發(fā)生過程連續(xù)監(jiān)測(cè)調(diào)查(每月1～2 次), 分別采集60～100 只養(yǎng)殖梭子蟹個(gè)體, 置于低溫、潮濕泡沫盒中, 充氧后即刻運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室, 進(jìn)行類似處理、采集相應(yīng)樣品; 同時(shí)在養(yǎng)殖池塘(設(shè)4 個(gè)采樣點(diǎn))進(jìn)行環(huán)境樣品采集, 自水面以下0.5 m 處用采水器采集2 L 水樣裝于樣品瓶中, 運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步處理。

1.2 養(yǎng)殖池塘環(huán)境因子測(cè)定

養(yǎng)殖池塘水體溫度和鹽度通過YSI 水質(zhì)分析儀(EC300, EcoSense, 中國(guó))現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定。

葉綠素a樣品的處理與測(cè)定: 將現(xiàn)場(chǎng)采集的水樣通過真空泵負(fù)壓抽濾到Whatman GF/F 濾膜上, 濾膜用鋁箔包裹后于-80 °C 保存; 濾膜用90%丙酮萃取24 h 后, 使用Trilogy 熒光計(jì)(7200-000, Turner, 美國(guó))測(cè)定上清液酸化前后的熒光值, 計(jì)算葉綠素a的質(zhì)量濃度(中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等, 2008a)。

營(yíng)養(yǎng)鹽樣品的處理與測(cè)定: 將現(xiàn)場(chǎng)采集的水樣經(jīng) 0.45 μm 孔徑的濾膜過濾, 加入氯仿固定, 于-80 °C 保存; 使用營(yíng)養(yǎng)鹽連續(xù)流動(dòng)分析儀(San Plus,Skalar, 荷蘭)測(cè)定硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、硅酸鹽和磷酸鹽的質(zhì)量濃度(中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等, 2008b)。

1.3 血卵渦鞭蟲形態(tài)學(xué)觀察及組織病理檢測(cè)

采用中性紅染色血涂片法(Stentifordet al, 2005)對(duì)三疣梭子蟹中的血卵渦鞭蟲感染情況進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè), 具體步驟如下: 采用一次性1 mL 無菌注射器從梭子蟹第五步足的關(guān)節(jié)膜處抽取約200 μL 血淋巴,將1～2 滴血淋巴液滴在載玻片上并與等體積的中性紅溶液(質(zhì)量體積比為0.04%, 過濾海水)混勻, 蓋上蓋玻片于顯微鏡(BX53, Olympus)下觀察; 將剩余血淋巴加入到含有800 μL 無水乙醇的1.5 mL 離心管中固定, 于-20 °C 下保存, 用于DNA 提取。參照Wang等(2017), 基于200×顯微鏡視野下觀察到的血卵渦鞭蟲數(shù)量, 將梭子蟹感染程度認(rèn)定為輕度(<10)、中度(10～100)、重度(>100)感染狀態(tài)。

將經(jīng)血涂片法確認(rèn)存在血卵渦鞭蟲感染的三疣梭子蟹解剖, 采集肝胰腺、心臟、鰓、肌肉等組織, 置于波恩氏液進(jìn)行固定, 48 h 后轉(zhuǎn)移到70%酒精中保存。參考Wheeler 等(2007)的步驟處理固定的組織樣品, 經(jīng)系列脫水后進(jìn)行H&E(hematoxylin & eosin)染色, 切片經(jīng)蓋片、封片后于顯微鏡下觀察梭子蟹感染血卵渦鞭蟲后的組織病理變化。

1.4 血卵渦鞭蟲的分子生物學(xué)鑒定及遺傳分析

使用海洋動(dòng)物組織基因組 DNA 提取試劑盒(TIANGEN, 天津)提取1.3 采集的梭子蟹血淋巴樣品的基因組DNA, 于-20 °C 保存, 以待后續(xù)檢測(cè)使用。

采用血卵渦鞭蟲 ITS1 序列的特異性引物(F:5′CATTCACCGTGAACCTTAGCC3′; R: 5′CTAGTCAT ACGTTTGAAGAAAGCC3′)(Smallet al, 2007)對(duì)梭子蟹中的血卵渦鞭蟲感染情況進(jìn)行分子PCR 檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為: 2×ApexHFFS PCR Master Mix(艾科瑞生物, 海南)10.0 μL, DNA 模板1.0 μL, 上、下游引物(10 μM)各0.8 μL, 無菌水7.4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)? 94 °C 預(yù)變性5 min; 94 °C 變性30 s, 56 °C 退火30 s, 72 °C 延伸30 s, 進(jìn)行30 個(gè)循環(huán); 72 °C 延伸10 min, 4 °C 保存。采用1.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)分析。挑選陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收, 送上海生工生物工程股份有限公司純化后進(jìn)行TA克隆和Sanger 測(cè)序。將獲得的血卵渦鞭蟲ITS1 序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 分析, 并與GenBank 中對(duì)應(yīng)的代表性ITS1序列進(jìn)行比對(duì), 運(yùn)用Mega 5.05軟件基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 環(huán)境水體中血卵渦鞭蟲豐度的qRT-PCR 檢測(cè)

將現(xiàn)場(chǎng)采集的環(huán)境水樣(300 mL)通過真空泵負(fù)壓抽濾到孔徑為0.2 μm 的聚碳酸酯膜上, 濾膜置于2 mL凍存管中, 經(jīng)液氮速凍后, 置于-80 °C 保存, 以待后續(xù)檢測(cè)使用。

使用Biomarker Soil Genomic Kit 試劑盒(百邁客生物科技, 北京)提取100 mL 環(huán)境水樣的環(huán)境基因組DNA, 參照Li 等(2010)的方法對(duì)水體中的血卵渦鞭蟲進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。將含有ITS1 擴(kuò)增子的質(zhì)粒經(jīng)梯度稀釋為102～109copies/μL, 進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè), 反應(yīng)體系為: TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ(TaKaRa, 日本)10.0 μL, DNA 模板1.0 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 無菌水7.4 μL, 反應(yīng)條件為: 95 °C, 30 s; 95 °C,5 s, 60 °C, 30 s, 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。所得擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(threshold cycle,CT)與每反應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值通過線性回歸擬合為標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品DNA 進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每反應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值, 根據(jù)單個(gè)血卵渦鞭蟲細(xì)胞中有300 個(gè)ITS1 序列拷貝數(shù)(Liet al, 2010), 將拷貝數(shù)換算為血卵渦鞭蟲細(xì)胞數(shù), 估算環(huán)境水體中的血卵渦鞭蟲豐度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 23.0 軟件, 對(duì)不同時(shí)期水體中血卵渦鞭蟲的豐度是否存在差異進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA,P<0.05), 并對(duì)梭子蟹感染率、水體中血卵渦鞭蟲豐度和環(huán)境因子進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 日照地區(qū)血卵渦鞭蟲株系的鑒定分析

2.1.1 血卵渦鞭蟲形態(tài)學(xué)觀察及組織病理檢測(cè) 對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行中性紅染色血淋巴涂片顯微觀察,健康梭子蟹個(gè)體血淋巴涂片中的細(xì)胞均為未被中性紅染色的宿主血細(xì)胞, 未見被中性紅染色的血卵渦鞭蟲細(xì)胞(圖1a)。染病梭子蟹個(gè)體的鏡檢結(jié)果顯示,除了未被中性紅染色的血細(xì)胞外, 血淋巴中充斥著大量近似球形的類變形蟲狀滋養(yǎng)體, 其直徑約為10～15 μm, 細(xì)胞內(nèi)多個(gè)溶酶體吸收中性紅染液而呈亮紅色(圖1b)。

組織病理學(xué)觀察顯示, 染病梭子蟹個(gè)體的肝胰腺、心臟、肌肉、鰓等器官和組織中均發(fā)現(xiàn)存在血卵渦鞭蟲感染(圖2)。大多數(shù)血卵渦鞭蟲處于類變形蟲滋養(yǎng)體階段, 充斥在肝胰腺的肝小管間隙以及心肌和步足肌的肌束間隙中(圖2a, 2b, 2d), 鰓組織中也存在少量的血卵渦鞭蟲細(xì)胞(圖2c)。染病梭子蟹個(gè)體肌肉組織中的肌束間隙明顯增大, 肌絲斷裂溶解, 相鄰肌絲纖維互相分離; 肝胰腺的肝小管間隙和管腔增大, 結(jié)締組織嚴(yán)重缺失, 肝小管纖毛柱狀上皮結(jié)構(gòu)發(fā)生溶解變性呈空泡狀; 鰓組織中除鰓絲末端發(fā)生膨大外, 未見其他明顯的組織病理變化。

感染梭子蟹的心臟、肌肉、肝胰腺、鰓等多個(gè)重要組織器官中能夠觀察到血卵渦鞭蟲的多種生活史階段, 包括絲狀滋養(yǎng)體(圖3a)、類變形蟲滋養(yǎng)體(圖2a)、蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體(圖3b)、團(tuán)塊狀聚合體(圖3c)、孢子前細(xì)胞和孢子(圖3d)。其中, 絲狀滋養(yǎng)體主要出現(xiàn)在處于感染早期的病蟹血淋巴或組織中; 類變形蟲滋養(yǎng)體是檢測(cè)中常見的生活史階段, 在感染早期和中期的病蟹血淋巴和組織器官中常被發(fā)現(xiàn); 蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體、團(tuán)塊狀聚合體是血卵渦鞭蟲的主要增殖階段,主要出現(xiàn)于感染中、后期的病蟹組織中; 孢子前細(xì)胞、孢子是血卵渦鞭蟲在宿主體內(nèi)生活史發(fā)展的末尾階段, 出現(xiàn)在感染晚期的病蟹組織中。

2.1.2 血卵渦鞭蟲分子生物學(xué)鑒定分析 通過分子克隆和測(cè)序方法, 分別從日照市2 個(gè)梭子蟹養(yǎng)殖區(qū)(東港區(qū)兩城鎮(zhèn)和經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū))的感染梭子蟹樣品中獲得了長(zhǎng)度約為～299 bp 的特異性HematodiniumITS1 rDNA 序列, 并提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)分別為ON668054、ON668055 和ON668056)。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 比對(duì)分析結(jié)果顯示, 該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中感染我國(guó)沿海甲殼類的H.perezi株系的ITS1 序列相似性為98%～100%, 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也表明本研究獲得的ITS1 序列與感染我國(guó)海水蟹類的血卵渦鞭蟲ITS1序列聚為一枝(圖4), 同屬于H.perezi基因Ⅱ型。

圖4 基于ITS1 序列構(gòu)建的日照地區(qū)養(yǎng)殖池塘中感染三疣梭子蟹的血卵渦鞭蟲系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Molecular phylogenetic analysis of H. perezi infected P. trituberculatus in Rizhaoarea based on Hematodinium ITS1

2.2 三疣梭子蟹血卵渦鞭蟲感染狀況及感染率變化

2020 年8 月自日照市2 個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域(東港區(qū)兩城鎮(zhèn)和經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū))采集的三疣梭子蟹成體中的血卵渦鞭蟲感染率分別為52.2%和42.3%, 其中多數(shù)為中、重度感染。

2021 年5 至9 月, 我們對(duì)日照兩城鎮(zhèn)養(yǎng)殖池塘中梭子蟹的血卵渦鞭蟲感染情況進(jìn)行了連續(xù)定期采樣檢測(cè), 統(tǒng)計(jì)分析養(yǎng)殖期間梭子蟹的感染率和感染程度(圖5)。結(jié)果顯示, 5 月在梭子蟹幼苗中未發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲感染。6 月梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率為24.5%,其中輕度感染個(gè)體占比較高, 占感染宿主的60.9%。7月中旬, 梭子蟹感染率上升至50.7%, 感染宿主中輕度感染個(gè)體比例下降, 中、重度感染個(gè)體比例升高,分別為47.2%、22.2%和30.6%。7 月底, 梭子蟹感染率為47.0%, 輕度感染個(gè)體比例升高, 占感染宿主的59.0%。8 月下旬, 梭子蟹感染率達(dá)到峰值, 為52.5%。感染宿主中, 輕度感染個(gè)體的比例出現(xiàn)下降, 由8 月中旬的55.6%下降至18.8%; 而中度和重度感染個(gè)體的比例升高, 分別由25.9%和18.5%升至43.7%和37.5%, 中、重度感染個(gè)體比例高達(dá)81.2%。9 月梭子蟹感染率下降至23.8%, 感染宿主中33.3%為輕度感染、6.7%為中度感染, 60.0%為重度感染。該養(yǎng)殖池塘中血卵渦鞭蟲流行病高發(fā)期為7 至8 月, 其中8 月下旬中、重度感染宿主占比最高。

圖5 三疣梭子蟹血卵渦鞭蟲感染的流行情況Fig.5 Prevalence of H. perezi infection in P. trituberculatus

2.3 養(yǎng)殖池塘水體中血卵渦鞭蟲豐度變化

2021 年5～11 月, 在日照兩城鎮(zhèn)養(yǎng)殖池塘環(huán)境水體中檢測(cè)到血卵渦鞭蟲存在, 其豐度不同時(shí)間點(diǎn)有明顯變化(圖6)。養(yǎng)殖池塘水體中血卵渦鞭蟲的豐度在5 至6 月較高(血卵渦鞭蟲細(xì)胞數(shù)量1 194～1 271 cells/L)與7月中旬、8 月至11 月有顯著差異(P<0.05); 后在7 月中旬出現(xiàn)呈下降趨勢(shì), 到下旬再次出現(xiàn)峰值(676 cells/L),隨后8 月中旬至11 月中旬, 血卵渦鞭蟲豐度在193～556 cells/L 之間波動(dòng), 但無顯著差異(P>0.05)。進(jìn)一步分析梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率變化與養(yǎng)殖池塘水體中血卵渦鞭蟲豐度變化的關(guān)聯(lián)性發(fā)現(xiàn), 梭子蟹感染率的峰值出現(xiàn)在水體血卵渦鞭蟲豐度高值期之后(圖6)。

圖6 三疣梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率與水體中血卵渦鞭蟲豐度的關(guān)聯(lián)性Fig.6 Correlation between the prevalence of H. perezi and the abundance of H. perezi

2.4 血卵渦鞭蟲流行病發(fā)生與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性

2021 年5 至11 月調(diào)查期間, 日照市兩城鎮(zhèn)養(yǎng)殖池塘水體主要環(huán)境指標(biāo)變化概述如下: 水溫從5～6 月開始升高, 到7～8 月達(dá)到26.2～28.6 °C, 隨后開始降低。養(yǎng)殖水體鹽度變化范圍在20.7～29.6, 最大值為6月的29.6, 最小值為9 月的20.7。葉綠素a濃度變化范圍在2.2～13.3 μg/L, 在5 月、8～10 月維持在較高水平(8.0～13.3 μg/L), 峰值在8 月。硝酸鹽濃度變化范圍在0.5～694.3 μg/L, 峰值出現(xiàn)在9 月為694.3 μg/L。亞硝酸鹽濃度變化范圍在0～72.9 μg/L, 峰值出現(xiàn)在9月為72.9 μg/L。銨鹽濃度變化范圍在31.2～616.4 μg/L,峰值出現(xiàn)在8 月為616.4 μg/L。磷酸鹽濃度變化范圍在6.5～48.2 μg/L, 峰值出現(xiàn)在8 月為48.2 μg/L。硅酸鹽濃度變化范圍在521.4～2 735.0 μg/L, 峰值出現(xiàn)在9月為2 735.0 μg/L。

養(yǎng)殖池塘梭子蟹感染率和各因子之間進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析, 結(jié)果顯示梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率與溫度極顯著正相關(guān)(P<0.01), 梭子蟹感染率與溫度的變化趨勢(shì)基本一致, 7 月至8 月, 養(yǎng)殖池塘水溫較高時(shí)(>25 °C)發(fā)病率最高(圖7); 梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率與其他生物及環(huán)境因子無顯著相關(guān)性(表1)。養(yǎng)殖池塘水體中血卵渦鞭蟲豐度和各因子之間的Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示, 水體中血卵渦鞭蟲豐度與鹽度顯著正相關(guān)(P<0.05), 兩者變化趨勢(shì)基本一致(圖8); 與亞硝酸鹽、銨鹽、磷酸鹽呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05); 而葉綠素a、硝酸鹽、硅酸鹽與環(huán)境水體中的血卵渦鞭蟲豐度無顯著相關(guān)性(表1)。

表1 梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率、水體中血卵渦鞭蟲豐度與環(huán)境因子相關(guān)性Tab.1 Correlation between the prevalence of H. perezi in P. trituberculatus and environmental factors, and correlation between the abundance of H. perezi in water and environmental factors

圖7 三疣梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率與水體溫度的關(guān)聯(lián)性Fig.7 Correlation between the prevalence of H. perezi and the temperature

圖8 水體鹽度與水體中血卵渦鞭蟲豐度的關(guān)聯(lián)性Fig.8 Correlation between the salinity and the abundance of H.perezi in water

3 討論

本研究首次在日照市沿海地區(qū)的養(yǎng)殖三疣梭子蟹中報(bào)道發(fā)現(xiàn)了海洋寄生甲藻血卵渦鞭蟲感染。2020～2021 年在日照沿海地區(qū)的主要養(yǎng)殖區(qū)采集的“牛奶病”癥狀梭子蟹的血淋巴和器官、組織中均發(fā)現(xiàn)了包括絲狀滋養(yǎng)體、類變形蟲滋養(yǎng)體、蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體、團(tuán)塊狀聚合體、孢子前細(xì)胞和孢子等血卵渦鞭蟲的多個(gè)生活史階段。染病梭子蟹血淋巴中存在大量的血卵渦鞭蟲細(xì)胞, 尚存在少量的血淋巴細(xì)胞; 病蟹肝胰腺的肝小管間隙和管腔增大, 充斥著大量的血卵渦鞭蟲, 結(jié)締組織嚴(yán)重缺失; 心臟肌肉組織中的肌束間隙明顯增大, 肌絲斷裂溶解, 血竇中存在著大量的血卵渦鞭蟲。這些染病梭子蟹的主要器官和組織病理變化與我國(guó)沿海其他地區(qū)報(bào)道的血卵渦鞭蟲感染導(dǎo)致宿主的組織病理變化類似(許文軍等, 2007a, 2007b;王金鳳等, 2015; 王印庚等, 2017)。進(jìn)一步的分子遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示, 日照地區(qū)發(fā)現(xiàn)的血卵渦鞭蟲株系與感染我國(guó)沿海蟹類的血卵渦鞭蟲株系的序列相似性較高、親緣關(guān)系較近, 屬于我國(guó)沿海廣泛分布的主要致病株系Hematodinium perezi基因Ⅱ型(Smallet al,2012; Xiaoet al, 2016)。

該養(yǎng)殖區(qū)域血卵渦鞭蟲流行病主要發(fā)生在6～9月, 其中7～8 月為高峰期。養(yǎng)殖池塘中梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率峰值與水體中血卵渦鞭蟲豐度變化呈現(xiàn)錯(cuò)峰交替現(xiàn)象, 間隔時(shí)間(約3～4 周)基本與血卵渦鞭蟲生活史發(fā)展周期一致(Messicket al, 2000; Liet al,2011; Shieldset al, 2015)。5～6 月, 水體中血卵渦鞭蟲的豐度處于高值; 6 月, 在梭子蟹中檢測(cè)到血卵渦鞭蟲感染, 且輕度感染比例較高; 7 月中旬, 梭子蟹感染率升高至50.7%, 半數(shù)以上為中、重度感染。7 月中旬重度感染的個(gè)體數(shù)量較多, 而水體中血卵渦鞭蟲的豐度在7 月中旬至7 月底期間升高; 表明血卵渦鞭蟲已經(jīng)在宿主體內(nèi)完成生活史過程, 重度感染宿主將大量的血卵渦鞭蟲孢子釋放到環(huán)境水體中(Appletonet al, 1998; Liet al, 2010)。水體中的大量血卵渦鞭蟲孢子又引發(fā)了新一輪感染, 7 月底至8 月中旬又出現(xiàn)大量輕、中度感染個(gè)體, 至8 月下旬感染率再次達(dá)到峰值, 且多為重度感染個(gè)體。一般宿主從感染血卵渦鞭蟲到重度感染或死亡的高峰期需經(jīng)過一個(gè)月左右時(shí)間(Messicket al, 2000); 據(jù)此認(rèn)為6 月和7 月中下旬為該區(qū)域血卵渦鞭蟲傳播擴(kuò)散和梭子蟹大量感染的關(guān)鍵時(shí)期。

血卵渦鞭蟲流行病的發(fā)生與水體溫度和鹽度變化密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn), 梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率與溫度極顯著正相關(guān)(P<0.01), 梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率在7～8 月養(yǎng)殖池塘水溫較高(26.2～28.6 °C)時(shí)達(dá)到峰值。血卵渦鞭蟲流行病發(fā)生具有季節(jié)性特征, 其發(fā)生受溫度影響(Briggset al, 2002; Shieldset al, 2015;Huanget al, 2021)。在美國(guó)蘭蟹中, 血卵渦鞭蟲能夠在20～24 °C 下迅速發(fā)展(Messicket al, 2000), 其流行的最適溫度是25 °C(Huchin-Mianet al, 2018)。分離自山東沿海的血卵渦鞭蟲可以在15～25 °C 下在宿主體內(nèi)正常發(fā)育, 且溫度越高, 發(fā)展越快, 25 °C 時(shí)能迅速增殖發(fā)育(呂曉陽(yáng)等, 2022)。因此, 認(rèn)為是7～8 月適宜的溫度促進(jìn)了養(yǎng)殖池塘血卵渦鞭蟲流行病的爆發(fā)。本研究中, 水體中血卵渦鞭蟲的豐度與鹽度顯著正相關(guān)(P<0.05)。7 月底至9 月, 水體鹽度較低(20.7～25.3), 大致呈降低趨勢(shì), 與水體中血卵渦鞭蟲豐度變化趨勢(shì)基本一致。血卵渦鞭蟲孢子可以在20～35 鹽度的環(huán)境中存活3～7 天(Liet al, 2011), 其生存最適鹽度是30(Huchin-Mianet al, 2018), 其活性在10～20 鹽度中有明顯降低(Coffeyet al, 2012)。因此, 認(rèn)為鹽度降低抑制了水體中血卵渦鞭蟲存活, 進(jìn)而限制了血卵渦鞭蟲傳播擴(kuò)散。

本研究在放苗期(5 月)的三疣梭子蟹蟹苗(C2～C4期)中未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性感染個(gè)體, 而在后續(xù)養(yǎng)殖過程中采集的梭子蟹成蟹中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了血卵渦鞭蟲感染, 表明該區(qū)域養(yǎng)殖環(huán)境中存在血卵渦鞭蟲的病原來源。此前研究也發(fā)現(xiàn), 養(yǎng)殖池塘及周邊環(huán)境中的野生宿主的是養(yǎng)殖梭子蟹血卵渦鞭蟲流行病的重要病原來源(Huanget al, 2021), 孢子水體傳播是養(yǎng)殖池塘內(nèi)血卵渦鞭蟲流行病傳播擴(kuò)散的主要途徑(Shieldset al,2017; Huanget al, 2019, 2021)。本研究環(huán)境因子相關(guān)性分析顯示, 水體中血卵渦鞭蟲豐度與亞硝酸鹽、銨鹽、磷酸鹽也呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, 氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽的變化會(huì)影響環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)(Weiet al, 2016)。然而,血卵渦鞭蟲屬于海洋寄生甲藻類群, 其生活史過程主要在甲殼動(dòng)物宿主內(nèi)完成, 在感染晚期釋放游動(dòng)孢子到環(huán)境水體中(Appletonet al, 1998; Liet al,2010), 微生物群落結(jié)構(gòu)的改變有可能對(duì)孢子的存活產(chǎn)生一定的影響。因此, 進(jìn)一步明確養(yǎng)殖區(qū)域血卵渦鞭蟲的病原來源, 揭示關(guān)鍵環(huán)境因子對(duì)于其流行病發(fā)生的影響機(jī)理是后續(xù)研究的重點(diǎn), 可為養(yǎng)殖生產(chǎn)中有效防控該流行性提供理論依據(jù)和參考。

4 結(jié)論

本研究首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)了日照地區(qū)養(yǎng)殖三疣梭子蟹感染寄生甲藻血卵渦鞭蟲及其流行病發(fā)生情況。該區(qū)域血卵渦鞭蟲流行病主要發(fā)生在6～9 月間, 7～8 月為暴發(fā)期, 發(fā)病池塘中梭子蟹感染率超過50%。梭子蟹血卵渦鞭蟲感染率變化與水體中血卵渦鞭蟲豐度變化密切相關(guān), 梭子蟹感染率峰值出現(xiàn)在水體血卵渦鞭蟲豐度高值的3 至4 周之后。養(yǎng)殖池塘中血卵渦鞭蟲流行病的發(fā)生與水體溫度和鹽度密切相關(guān), 7～8月較高的水溫(26.2～28.6 °C)促進(jìn)了血卵渦鞭蟲在宿主體內(nèi)快速增殖及流行病暴發(fā), 而較低的鹽度(20.7～25.3)可能抑制了水環(huán)境中血卵渦鞭蟲的存活及其傳播擴(kuò)散。

致謝 感謝日照市春祥水產(chǎn)合作社及黃海水產(chǎn)研究所謝國(guó)駟博士在現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)過程中給予的幫助和支持。