高低溫催青溫度敏感期家蠶卵的差異蛋白篩查

白 旭,馮嘉偉,白新宇,李慶榮,鐘仰進(jìn),楊婉瑩*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642; 2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 廣州 510610)

滯育(Diapause)是昆蟲對外界環(huán)境變化做出的對策,在漫長的進(jìn)化過程中,該機(jī)制保護(hù)昆蟲渡過不利環(huán)境并保證了種族繁衍(柴華等,2019;Zhangetal., 2019)。根據(jù)昆蟲滯育發(fā)生階段的不同,可分為卵滯育、幼蟲滯育、蛹滯育以及成蟲滯育(徐衛(wèi)華,2008)。家蠶Bombyxmori是卵滯育昆蟲的典型代表,也是最早開展滯育研究的模式昆蟲。滯育誘導(dǎo)和滯育解除機(jī)理的應(yīng)用對蠶業(yè)生產(chǎn)有非常重要的推動作用。

家蠶滯育由滯育激素(Diapause hormone, DH)調(diào)控,DH由咽下神經(jīng)節(jié)(Suboesophageal ganglion, SG)的12個神經(jīng)細(xì)胞合成,再由心側(cè)體至咽側(cè)體釋放到血淋巴中(Kunioetal., 1991;Xuetal., 1995;Hayakawaetal., 1998)。DH被卵巢上的滯育激素受體(Diapause hormone receptor, DHR)識別后,作為G蛋白偶聯(lián)受體的DHR促使卵巢細(xì)胞內(nèi)第二信使鳥苷酸環(huán)化酶(cAMP)活性下降(Hommaetal., 2006),導(dǎo)致血液中的海藻糖被分解為葡萄糖。葡萄糖就如卵母細(xì)胞中的糖原,最后在滯育卵中被轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘油。這些物質(zhì)幫助蠶卵抵御低溫等不良環(huán)境(Chino, 1958;Yasuhiroetal., 2000)。

二化性家蠶滯育的發(fā)生主要受基因和外界環(huán)境的影響。蠶卵在25℃長光照下催青時,其產(chǎn)下的子代卵是滯育卵;當(dāng)蠶卵在15℃短光照下催青時,產(chǎn)下的子代為非滯育卵,可以正常發(fā)育(Noguchietal., 2001)。Sato等(2014)研究發(fā)現(xiàn)家蠶瞬時受體電位通道蛋白BmTrpA在高于21℃時被激活表達(dá),繼而通過未知的方式激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)信號系統(tǒng)和黑化誘導(dǎo)神經(jīng)肽(corazonin)級聯(lián)系統(tǒng),通過調(diào)節(jié)滯育激素釋放誘導(dǎo)子代滯育(Tsuchiyaetal., 2020)。也有研究發(fā)現(xiàn)激素控制、生物節(jié)律和瞬時電位通道等途徑也參與了家蠶滯育調(diào)控(Clapham, 2003;Huang, 2004)。說明家蠶滯育發(fā)生是一個非常復(fù)雜的過程,其具體機(jī)制還在不斷探索研究中。

隨著家蠶全基因組測序的完成和蛋白表達(dá)圖譜的建立,家蠶組學(xué)研究發(fā)展迅速。Lanfen等(2018)通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對家蠶產(chǎn)下的滯育卵和非滯育卵進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,從滯育卵和非滯育卵中鑒定出309個共有蛋白質(zhì)。陳艷榮(2019)分別對產(chǎn)滯育卵和產(chǎn)非滯育卵的雌蛹進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,鑒定出滯育相關(guān)基因akr2e-like,將其敲除后,25℃催青的雌蠶產(chǎn)下部分非滯育卵,證明該基因參與滯育調(diào)控。為了研究高低溫誘導(dǎo)家蠶滯育發(fā)生的分子機(jī)制,本研究用25℃和15℃分別催青蠶卵,按照Xu等(1995)建立的催青方法,在蠶卵發(fā)育到溫度敏感期時取樣,抽提蠶卵蛋白通過LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)測序,篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì),并結(jié)合數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行功能分類和功能富集,為進(jìn)一步解析溫度誘導(dǎo)家蠶滯育發(fā)生的分子機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家蠶

供試家蠶二化性品種P50由中國科學(xué)院蠶業(yè)研究所徐安英研究員提供,幼蟲在溫度26±2℃,相對濕度60%±5%,12 h日夜交替的環(huán)境下用新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.2 試劑

SDS、BSA、Tris、二乙醇胺、尿素等購自廣州翔博生物科技有限公司;BCA法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白酶抑制劑、TCA、Triton X-100、TSA、NAM、TEAB、二硫蘇糖醇DTT、碘乙酰胺(IAA)購自上海藍(lán)木化工有限公司。RNAex Pro RNA提取試劑、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。qPCR SYBR Green Master Mix購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.3 蠶卵催青處理

按照宋宇航等(2022)的方法,將二化性家蠶品種P50的蠶卵放在25℃催青,飼喂1代后產(chǎn)下滯育卵。將產(chǎn)下的滯育卵放置20 h后進(jìn)行浸酸處理,在比重1.075(115℉)的鹽酸溶液中浸泡270 s,隨即放在流動的水中浸泡30 min,沖洗干凈后放置在25℃晾干。將解除滯育的蠶卵分成兩組,1組放置于25℃氣候箱中催青(高溫滯育誘導(dǎo)組),另一組放置于15℃氣候箱中催青(低溫非滯育誘導(dǎo)組)。分別在蠶卵發(fā)育至反轉(zhuǎn)終了期即23期時取樣,將蠶卵在液氮中速凍后放入-80℃冰箱。

1.4 蠶卵蛋白質(zhì)的抽提

從-80℃取出蠶卵,加液氮充分研磨至粉末。各組樣品分別加入粉末4倍體積裂解緩沖液(1% Triton X-100,1%蛋白酶抑制劑,3 μmol/L TSA,50 mmol/L NAM),超聲裂解。4℃,12 000 g離心10 min,去除細(xì)胞碎片,上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管,利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。

1.5 蛋白質(zhì)電泳檢測

制樣:根據(jù)蛋白濃度測定結(jié)果,每個樣品取等量蛋白到離心管中,加入5 μL的4×Loading buffer,再加入2% SDS使總體積為20 μL;上樣:依次上樣1 μL預(yù)染蛋白marker和20 μL蛋白樣品;電泳:按照15 mA/gel的電流跑濃縮膠,約15 min后蛋白濃縮為一條線;用35 mA跑分離膠直至電泳到膠底部;染色和脫色:將凝膠取出后于考馬斯亮藍(lán)R-250染液中室溫染色2 h,然后加入脫色液,脫色至背景無色、條帶清晰。

1.6 胰酶酶解

取等量蛋白樣品,用裂解液將體積調(diào)整濃度體積一致。緩慢加入終濃度20%TCA,渦旋混勻,4℃沉淀2 h。4 500 g離心5 min,棄上清,用預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀2～3次。晾干沉淀后加入終濃度200 mmol/L TEAB,超聲波打散沉淀,以蛋白酶∶蛋白=1∶50的比例(m/m)加入胰蛋白酶,酶解過夜。加入DTT使其終濃度為5 mmol/L,56℃還原30 min,然后加入IAA使其終濃度為11 mmol/L,室溫避光孵育15 min。

1.7 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

肽段用液相色譜流動相A相溶解后使用NanoElute超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液;流動相B為含0.1%甲酸和100%乙腈溶液。液相梯度設(shè)置:0～70 min,6%～24%B;70～84 min,24%～35%B;84～87 min,35%～80%B;87～90 min,80%B,流速維持在450 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入Capillary離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)timsTOF Pro質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為1.65 kV,肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的TOF進(jìn)行檢測和分析。二級質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為100～1 700。數(shù)據(jù)采集模式使用平行累積串行碎裂(PASEF)模式。一張一級質(zhì)譜采集后進(jìn)行10次 PASEF模式采集母離子電荷數(shù)在0～5范圍內(nèi)的二級譜圖,串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時間設(shè)置為30 s避免母離子的重復(fù)掃描。

1.8 差異蛋白轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證

將蠶卵樣品置于液氮預(yù)冷的研缽中研磨為粉末,使用Trizol沉淀法提取樣本RNA,經(jīng)過去基因組DNA反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用Primer-BLAS網(wǎng)站設(shè)計目的基因的qRT-PCR引物(引物序列如表1所示),由生工生物公司合成。熒光定量PCR方法參照試劑SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)操作說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)度觀察

家蠶的胚胎期被劃分為30個發(fā)育階段,Xu等(1995)通過溫度交換催青實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在蠶卵胚胎發(fā)育的第20～23階段,即器官形成期的頭胸分節(jié)期、反轉(zhuǎn)期、反轉(zhuǎn)終了期、毛瘤發(fā)生期時對溫度誘導(dǎo)最為敏感。只要在蠶卵發(fā)育的20～23階段保持25℃催青,94%的子代卵為滯育卵,第20～25階段保持25℃催青,則子代97%為滯育卵。說明家蠶胚胎發(fā)育的第20～25階段是感受溫度變化誘導(dǎo)子代進(jìn)入滯育的窗口期,20～23階段是關(guān)鍵期,因此本實(shí)驗(yàn)取23階段即反轉(zhuǎn)終了期的蠶卵進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。為確保兩組蠶卵樣本處在同一發(fā)育階段,通過觀察胚胎形態(tài)來監(jiān)控蠶卵的發(fā)育進(jìn)程。圖1為15℃催青組和25℃催青組蠶卵胚胎,可以看出取樣時兩組蠶卵都發(fā)育到了第23階段。

圖1 反轉(zhuǎn)期家蠶胚胎Fig.1 Embryo in reversal period of Bombyx mori

2.2 蠶卵蛋白濃度測定及電泳檢測

蠶卵蛋白抽提完成后,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度(表2)。

表2 蠶卵蛋白濃度測定結(jié)果

通過SDS-PAGE電泳檢測抽提蛋白質(zhì)量,每個樣品取15 μg進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2所示,25℃和15℃催青組的蠶卵蛋白條帶清晰,分布正常均一,蛋白無降解,組內(nèi)各泳道平行性好,組間電泳行為差異不明顯。存在明顯的高豐度蛋白,蛋白總量滿足接下來的質(zhì)譜要求。

圖2 高低溫催青溫度敏感期家蠶卵蛋白的SDS-PAGE 電泳檢測Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis detection of silkworm egg protein in temperature-sensitive period of high and low temperature注:泳道M為蛋白Maker,15-1、15-2、15-3為15℃催青組的三個重復(fù)樣本,25-1、25-2、25-3為25℃催青組的三個重復(fù)樣本。Note: Lane M was the protein maker, 15-1, 15-2, and 15-3 were three replicates of the 15℃ group, and 25-1, 25-2, and 25-3 were three replicates of the 25℃ group.

2.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫篩選

質(zhì)譜測序完成后,為了得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)分析結(jié)果,首先做數(shù)據(jù)過濾。將譜圖、肽段、蛋白3個層面鑒定的準(zhǔn)確性FDR設(shè)定為1%;鑒定蛋白至少需要包含一個特異性(Unique)肽段。圖3-A是經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后鑒定的肽段和蛋白總數(shù)。從圖中可以看出質(zhì)譜檢測產(chǎn)生的二級譜圖數(shù),即總譜圖數(shù)(Total spectrums)為719 520條,其中有效譜圖數(shù)(Matched spectrums)為164 030條,鑒定肽段數(shù)(Peptides)為28 334條,根據(jù)匹配結(jié)果解析出的特異性肽段(Unique peptides)有27 570個。這些肽段對應(yīng)的鑒定蛋白數(shù)(Identified proteins)有3 817個,可量化的蛋白(Quantifiable proteins)數(shù)有3 076個。圖3-B是各組生物重復(fù)樣本的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD),RSD值越小,表明重復(fù)試驗(yàn)定量的波動程度越小。從圖中看出25℃催青蠶卵與15℃催青蠶卵組間的RSD數(shù)據(jù)均小于0.6,說明樣本重復(fù)性較好,具有統(tǒng)計學(xué)一致性。

圖3 差異蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計Fig.3 Basic data statistics of differentially expressed proteomics注:A,蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜結(jié)果統(tǒng)計圖;B,樣品重復(fù)性的RSD檢驗(yàn)。Note: A, Statistical chart of protein identification mass spectrometry results; B, RSD test of sample repeatability.

2.4 差異蛋白質(zhì)的分析

將15℃催青組與25℃催青組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,首先通過樣本定量值的P-value篩選差異表達(dá)蛋白,當(dāng)P-value <0.05時,以差異表達(dá)量變化超過1.5作為顯著上調(diào)的變化閾值,小于1/1.5作為顯著下調(diào)的變化閾值。比較發(fā)現(xiàn)兩個處理組中差異表達(dá)的蛋白有104個,其中56個蛋白上調(diào),48個蛋白下調(diào)(圖4)。表3是部分顯著差異蛋白。

圖4 25℃和15℃催青的蠶卵差異蛋白的火山圖Fig.4 Volcano plots of differential protein expression in silkworm eggs incubated at 25℃ and 15℃

表3 25℃/15℃下催青家蠶溫度敏感期卵的差異表達(dá)蛋白

2.5 差異蛋白的聚類分析

對25℃和15℃催青的蠶卵差異蛋白分別進(jìn)行了GO分類、KEGG通路和蛋白結(jié)構(gòu)域3個層面的富集分析。圖5-A是差異蛋白的本體聚類分析(Gene Ontology,GO),從圖中可以看出差異蛋白主要參與的生物過程有細(xì)胞過程(Cellular process)、代謝過程(Metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)、生長發(fā)育過程(Developmental process)、多細(xì)胞生物過程(Multicellular organismal process)和脅迫應(yīng)答(Response to stimulus)。差異蛋白的分子功能主要為催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合(Binding)。

圖5 差異蛋白的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of differentially expressed proteins注:A,差異蛋白的GO分類;B,差異蛋白的COG分類。Note: A, GO classification of differential protein expression; B, COG classification of differential protein expression .

圖5-B是COG功能分類的結(jié)果,從圖中可以看出差異蛋白的功能主要為翻譯后修飾(Posttranslational modification)、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)(Protein turnover)、分子伴侶(Chaperones)和物質(zhì)代謝。對差異蛋白的亞細(xì)胞定位顯示差異蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞核中。

2.6 差異蛋白的KEGG功能富集分析

接下來對差異蛋白進(jìn)行KEGG功能富集分析,通過氣泡圖的方式展現(xiàn)差異表達(dá)蛋白顯著富集(P-value <0.05)到的功能分類和通路。結(jié)果顯示(圖6),差異蛋白主要參與了乙醛酸和二羧酸代謝途徑(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、丙酮酸代謝途徑(Pyruvate metabolism)和半乳糖代謝途徑(Galactose metabolism)。其中,差異蛋白在乙醛酸和二羧酸代謝途徑富集最為顯著,所含5個顯著差異蛋白全部上調(diào)。此外,在丙酮酸代謝途徑中,蘋果酸合酶顯著上調(diào),而蘋果酸酶顯著下調(diào)。這些差異蛋白的主要分子功能有:鐵反應(yīng)元件結(jié)合(Iron-responsive element binding)、催化活性(Catalytic activity)、裂解酶活性(Lyase activity)、烏頭酸水合酶活性(Aconitate hydratase activity)、水解酶活性(Hydro-lyase activity)、外肽酶活性(Exopeptidase activity)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性(Glucuronosyltransferase activity)以及碳-碳裂解酶活性(Carbon-carbon lyase activity)。

圖6 差異蛋白的KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of differentially expressed proteins注:A,差異蛋白的KEGG通路分析;B,差異蛋白的KEGG分子功能分析?？v軸為通路或功能分類,橫軸為差異表達(dá)蛋白在該功能類型中所占比例相比于鑒定蛋白所占比例的變化倍數(shù)(Fold enrichment)的Log2轉(zhuǎn)換后的數(shù)值。圓圈顏色表示富集顯著性P-value,圓圈大小表示功能類或通路中的差異蛋白個數(shù)。Note: A, KEGG pathway analysis of differential protein expression; B, KEGG molecular function analysis of differential protein expression. Vertical axis was the pathway or functional classification, and horizontal axis was the Log2-transformed value of the fold enrichment (Fold enrichment) of the proportion of differential protein expression in this functional type compared to the proportion of identified proteins. The color of the circle indicated the significant P-value of enrichment, and the size of the circle indicated the number of differential protein expression in the functional class or pathway.

2.7 差異蛋白轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述差異蛋白定量結(jié)果,選取了參與代謝過程的L-乳酸脫氫酶、地芬甲酸酯合酶、尿酸酶、脫氧海絲氨酸合酶、UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)體、泛素硫酯酶和氨肽酶;參與脅迫應(yīng)答的蛋白絲光蛋白、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和觸角特異性蛋白;保幼激素信號通路中的保幼激素結(jié)合蛋白進(jìn)行實(shí)時熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證。圖7分別是qRT-PCR檢測結(jié)果,15℃和25℃催青組中,目的蛋白轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢與蛋白組學(xué)結(jié)果一致,說明差異蛋白定量結(jié)果準(zhǔn)確。

圖7 25℃和15℃催青的蠶卵差異蛋白的轉(zhuǎn)錄水平定量結(jié)果Fig.7 Quantitative results of transcriptional levels of differential protein expression in silkworm eggs treated at 25℃ and 15℃注:qRT-PCR檢測差異基因表達(dá)情況。用內(nèi)參基因Eif-4A使基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。Note: Differential gene expression was detected by qRT-PCR. Gene expression was normalized with the internal reference gene Eif-4A. * means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001.

3 結(jié)論與討論

家蠶滯育卵胚胎發(fā)育被劃分為30個階段,Xu等(1995)以二化性家蠶品種大造為研究材料,對蠶卵進(jìn)行高低溫(25℃/15℃)交替催青,發(fā)現(xiàn)在第20～23階段進(jìn)行25℃催青對誘導(dǎo)滯育至關(guān)重要,22～25期對滯育卵的誘導(dǎo)也很重要,完整經(jīng)歷20～25階段25℃催青的蠶卵,其子代滯育率升至100%。這說明第20～25階段是家蠶胚胎感受溫度變化誘導(dǎo)子代進(jìn)入滯育的敏感期。

本研究通過液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)對高、低溫催青下家蠶敏感期卵的差異蛋白進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與15℃催青的蠶卵相比,25℃催青的蠶卵在敏感期蛋白表達(dá)顯著上調(diào)的有56個,顯著下調(diào)的有48個,這些蛋白可能參與了溫度誘導(dǎo)家蠶子代滯育發(fā)生的調(diào)控過程。對差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋顯示,差異蛋白主要參與的生物過程有細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、生長發(fā)育過程、多細(xì)胞生物過程和脅迫應(yīng)答。差異蛋白的分子功能主要為催化活性和結(jié)合。KOG功能分類的結(jié)果顯示,差異蛋白的功能主要為翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶和物質(zhì)代謝。KEGG富集結(jié)果顯示,差異蛋白主要參與了乙醛酸和二羧酸代謝途徑、丙酮酸代謝途徑和半乳糖代謝途徑。

特定昆蟲通過調(diào)節(jié)發(fā)育過程中的某一步驟,在特定發(fā)育階段進(jìn)入滯育(Mikietal., 2020)。如,煙草天蛾Manducasexta蛹期滯育的原因被認(rèn)為是大腦分泌促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone, PTTH)的釋放量減少(Tomiokaetal., 1995);家蠶通過滯育激素誘導(dǎo)胚胎進(jìn)入滯育(Okitsugu, 1996);黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和庫蚊Culexpipiens主要通過胰島素(insulin)信號途徑誘導(dǎo)成蟲進(jìn)入滯育(Simetal., 2013)。保幼激素(Juvenile hormone,JH)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)昆蟲變態(tài)、繁殖和滯育的重要激素之一(Royetal., 2018)。胰島素信號通過JH通路誘導(dǎo)滯育發(fā)生,用外源性JH可以回補(bǔ)胰島素受體敲除后引起的滯育改變(Simetal., 2013)。大部分昆蟲滯育的誘導(dǎo)和發(fā)生往往伴隨著體內(nèi)JH水平的顯著降低,但在少數(shù)昆蟲中,滯育也會隨著體內(nèi)JH增加而發(fā)生。短光照可誘導(dǎo)異色瓢蟲Harmoniaaxyridis發(fā)生滯育,其體內(nèi)的JH滴度在短光照下飼養(yǎng)比在長光照下飼養(yǎng)更低(Gaoetal., 2022)。Jiang等(2011)的研究也表明,在家蠶中提高保幼激素水平的同時,降低蛻皮激素的水平可誘導(dǎo)滯育卵的產(chǎn)生。在篩選到的差異表達(dá)蛋白中發(fā)現(xiàn),保幼激素結(jié)合蛋白(Juvenile hormone binding protein, JHBP)在25℃催青蠶卵中的表達(dá)比15℃催青蠶卵顯著上調(diào)。在鱗翅目昆蟲中,JH信號主要由血淋巴中的物種特異性JHBP介導(dǎo)(Lietal., 2016)。在與其受體相互作用之前,JH作為與JHBP的復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織,在此期間,JHBP是JH信號轉(zhuǎn)運(yùn)中的第一個關(guān)鍵元件(Krameretal., 1974)。JHBP將JH從血淋巴輸送到靶器官的細(xì)胞,并保護(hù)JH免受非特異性酯酶的降解(Debskietal., 2004)。來自不同物種的JHBP的序列分析表明,JHBP蛋白與兩個保守的N末端半胱氨酸殘基具有高度相似性,并且可以結(jié)合親脂性小分子如JH的結(jié)構(gòu)域(Kolodziejczyketal., 2008)。保幼激素合成過程中JHBP基因的表達(dá)受JH負(fù)控制。JHBP在高低溫催青卵中的差異表達(dá),也為研究家蠶滯育誘導(dǎo)的機(jī)制提供了新的靶標(biāo)。

溫度是影響家蠶卵滯育發(fā)生的最主要環(huán)境因素(Baleetal., 2010),越來越多的研究表明溫度應(yīng)激反應(yīng)與滯育之間關(guān)系密切。在家蠶的滯育過程中,啟動了一套應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制來保證越冬存活,如合成甘油和山梨醇(Han, 1998;Kostaletal., 2000)、熱休克蛋白(Hsps)等分子伴侶的合成(Rinehartetal., 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白,如L-乳酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、蘋果酸酶和保幼激素結(jié)合蛋白等,可能參與到這些物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化。

綜上所述,家蠶滯育誘導(dǎo)的分子機(jī)制較為復(fù)雜,涉及多種信號通路和調(diào)控因子,本研究利用蛋白組學(xué)技術(shù)初步發(fā)現(xiàn)多種信號通路和差異蛋白可能在家蠶受環(huán)境溫度影響下誘導(dǎo)子代滯育的分子機(jī)制中起到重要作用,為進(jìn)一步研究滯育發(fā)生的分子機(jī)制研究提供候選蛋白。