王 鑫, 張 南, 楊亞威, 史陶中, 馬 鑫, 呂 培, 花日茂

(安徽農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品質量安全重點實驗室，合肥 230036)

百菌清 (chlorothalonil)，化學名稱為2,4,5,6-四氯-1,3-苯二腈，化學結構見圖式1，是一種廣譜殺菌劑，主要用于防治植物疫病、枯萎病、葉斑病、霜霉病、白粉病和葉斑病等病害[1]。由于百菌清的廣泛應用，在環(huán)境中經(jīng)?？梢詸z測到其殘留，例如蔬菜[2]、土壤[3]、河流水體[4]等。百菌清對哺乳動物的毒性較低，但對水生生物具有較強的毒性[5]，其在水體中的轉化主要為水解和光化學反應，在地表水中受有機物和無機物的作用，其消除方式主要為光降解[6]。百菌清在水體中的主要降解產(chǎn)物為4-羥基百菌清，其具有比母體更強的急性毒性和持久性[7]。黃酮類物質可以顯著促進百菌清溶液的降解，而且可以抑制4-羥基百菌清的產(chǎn)生[8]。

圖式1 百菌清 (左) 與丙溴磷 (右) 的化學結構式Scheme 1 Structural formula of chlorothalonil (left) and profenofos (right)

丙溴磷 (profenofos)，化學名稱為O-(4-溴-2-氯苯基)-O-乙基-S-丙基-硫代磷酸酯，化學結構見圖式1，為廣譜殺蟲殺螨劑，廣泛用于防治棉花、蔬菜和水稻等作物上的蟲害，是持久性有機氯農(nóng)藥的主要替代品種，其作用機理是使乙酰膽堿酯酶活性位點被磷酸化，導致乙酰膽堿的積累引起神經(jīng)元紊亂，從而引起害蟲過度興奮、痙攣、癱瘓和死亡[9]。丙溴磷盡管為中等毒性殺蟲劑，但對很多非靶標生物具有較強的毒性效應，如對魚類等水生生物具有較強的急性毒性[10]。暴露于不同亞致死濃度的丙溴磷下，尼羅羅非魚血液中葡萄糖和白細胞水平顯著增加，血紅蛋白、紅細胞和堆積細胞體積隨著丙溴磷濃度增加而降低[11]。有研究表明，天然有機物可以促進紫外光去除丙溴磷[12]以及UV-高鐵酸鹽體系能夠快速促進丙溴磷在不同pH 值水溶液中的降解[13]。Fleminger 等[14]報道，在紫外和可見光光照下，利用摻雜二氧化鈦納米顆?？梢钥焖購氐椎亟到馑斜辶住Ｋ芤褐械狞S酮物質會抑制丙溴磷在汞燈下的光降解[15]。

百菌清和丙溴磷在環(huán)境中的單獨光化學降解已被大量研究[6,16-17]，而在農(nóng)田水體環(huán)境中往往是兩種或多種農(nóng)藥同時存在，因此研究百菌清和丙溴磷復合污染下的光降解作用，對評估其在環(huán)境中的生態(tài)毒性具有十分重要的意義。本研究利用模擬光源 (高壓汞燈) 研究了百菌清與丙溴磷混合水溶液中的光降解效應和光降解產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑、試劑與主要儀器

百菌清 (chlorothalonil，純度 ≥ 99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙溴磷 (profenofos，純度 ≥ 99%，德國 Dr.Ehrenstorfer 公司)；超純水(實驗室艾科浦超純化水機制備)；乙腈、甲醇 (色譜純，美國天地公司)；N,N-二甲基對亞硝基苯胺(PNDA) (純度 ≥ 99%，上海安譜實驗科技有限公司)；4-羥基百菌清 (純度 ≥ 99% ，上海安譜實驗科技有限公司)；丙溴磷代謝物標準品：4-溴-2 氯苯基磷酸乙酯 (M1)、O-(4-溴-2-氯苯基)-O-乙基-硫代磷酸 (M2)、O-(2-氯苯基)-O-乙基-S-丙基硫代磷酸酯 (M3) 和O-(2-氯-4-羥基苯基)-O-乙基-S-丙基硫代磷酸酯 (M4) (純度 ≥ 95%，上海盈科科技有限公司)，2-氯-4-溴苯酚 (M5) (純度 ≥ 98%，泰坦科技有限公司)。

UV-1800 型紫外分光光度計 (島津儀器有限公司)；SE602F 型萬分之一電子分析天平 (奧豪斯儀器有限公司)；Waters e 2695 高效液相色譜儀 (美國Waters 公司)；UPLC TQ-S 液質聯(lián)用儀 (美國Waters 公司)；走馬燈旋轉式石英水冷光解儀 (安徽農(nóng)業(yè)大學自制)；光源為管狀高壓汞燈 (功率150 W，照度10 000～12 000 lx)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取一定量的百菌清、丙溴磷、代謝物和PNDA 標準品，用乙腈溶解，配制成質量濃度為1 g/L 的母液，儲存于棕色儲液瓶內(nèi)，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 不同比例的百菌清與丙溴磷在純水中的光降解[8]分別移取一定量的百菌清和丙溴磷標準溶液至100 mL 具塞容量瓶中，設1 倍百菌清和丙溴磷濃度為3 μmol/L，另外按照n(百菌清) :n(丙溴磷) = 1 : 0、1 : 1、1 : 2、1 : 3、0 : 1、0 : 2 和0 : 3的比例分別加入母液，用純水稀釋至設定濃度，超聲波助溶3 min 使其混合均勻，得到百菌清和丙溴磷的混合溶液。移取5 mL 上述配制的混合溶液于具塞石英試管中，置于光解儀 (試管距光源12.5 cm) 中進行光解。設3 個重復，同時以黑暗處理為對照組。n(百菌清) :n(丙溴磷) = 1 : 0 組取樣時間為0、60、120、180、240、300、360 min，n(百菌清) :n(丙溴磷) = 1 : 1、0 : 1、0 : 2 和0 : 3組取樣時間為0、30、60、90、120、150、180 min，n(百菌清) :n(丙溴磷) = 1 : 2 和1 : 3 組取樣時間為0、20、40、60、80、100、120、150、180 min。

樣品取出后，加入等體積乙腈 (5 mL)，渦旋混勻，過 0.22 μm 水系濾膜，待測。

1.2.3 高壓汞燈光照下百菌清與丙溴磷光降解產(chǎn)物的測定和降解機制 光解產(chǎn)物測定：配制百菌清與丙溴磷溶液，濃度均為3 μmol/L，置于高壓汞燈下進行光照處理。分別于0、60 和120 min取樣，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜 (UPLCMS/MS) 進行丙溴磷光解產(chǎn)物測定，利用高效液相色譜 (HPLC) 進行百菌清光解產(chǎn)物的測定。

混合體系光降解反應中羥基自由基的測定：設定PNDA、PNDA + H2O2、PNDA + 百菌清、PNDA + 丙溴磷和PNDA + 百菌清 + 丙溴磷試驗體系中PNDA 的濃度為200 μmol/L，百菌清濃度為3 μmol/L，丙溴磷濃度為9 μmol/L，H2O2濃度為5000 μmol/L。移取10 mL 配制好的溶液于石英管中，每個處理重復3 次，并設黑暗對照。將裝有反應液的石英管置于高壓汞燈下進行光照，分別于0、20、40 和60 min 取樣，利用紫外分光光度計測定其吸光度，檢測波長為440 nm。通過計算PNDA 剩余濃度的變化表示反應液中羥基自由基的量。

1.3 儀器檢測條件

1.3.1 百菌清與丙溴磷的HPLC 檢測條件[8,15]

XDB-C18色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相為V(體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液) :V(乙腈) =15 : 85；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣時間10 min，百菌清及其產(chǎn)物檢測波長均為236 nm，丙溴磷檢測波長為210 nm。

1.3.2 丙溴磷光解產(chǎn)物的UPLC-MS/MS 檢測條件

BEH-C18色譜柱 (2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；柱溫30 ℃；離子源ESI；進樣量5 μL；MS1和MS2正負離子掃描范圍50～400m/z；流動相為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫方式，流動相比例如表1 所示。

表1 UPLC-MS/MS 洗脫程序Table 1 UPLC-MS/MS elution procedure

1.4 統(tǒng)計方法及計算公式

運用Origin 2018 64Bit 和IBM SPSS Statistics 26 軟件對數(shù)據(jù)進行處理。按公式 (1) 計算降解率(f)[15]。

式中，a為光照條件下反應體系中藥劑的剩余濃度(μmol/L)；b為黑暗條件下藥劑的剩余濃度(μmol/L)。

光降解半衰期t1/2符合一級動力學方程，按公式 (2) 和 (3) 計算。

式中，C0為藥劑初始添加濃度(μmol/L)；Ct：藥劑在光照t時刻后的剩余濃度(μmol/L)；k：藥劑的光降解速率常數(shù)(min-1)。

2 結果與分析

2.1 丙溴磷對百菌清在純水中的光降解效應

在黑暗條件下，百菌清、丙溴磷及其混合水溶液在一定時間內(nèi)均不發(fā)生降解。將百菌清(3 μmol/L)、丙溴磷 (3、6、9 μmol/L) 和n(百菌清) :n(丙溴磷) = 1 : 1、1 : 2、1 : 3 混合水溶液，分別置于高壓汞燈照射下進行光降解，其降解動力學參數(shù)如表2 所示?？梢?， 在3 μmol/L 的百菌清溶液中加入1、2、3 倍的丙溴磷后，百菌清的光降解半衰期分別由122.46 降低為64.54、38.25 和33.05 min，降解速率分別提高了1.90 倍、3.20 倍和3.71 倍，表明降解速率隨著體系中丙溴磷的濃度增加而升高。而在同樣條件下，百菌清對丙溴磷的光降解無影響。

表2 高壓汞燈照射下丙溴磷與百菌清的光降解動力學參數(shù)Table 2 Photodegradation kinectic parameters of profenofos and chlorothalonil under HPML irradiation

2.2 百菌清和丙溴磷光降解產(chǎn)物的分析

為了進一步探究百菌清與丙溴磷混合水溶液的光降解機制，對百菌清和丙溴磷的光降解產(chǎn)物進行了檢測分析。丙溴磷及其光解產(chǎn)物的主要質譜檢測參數(shù)如表3 所示。

表3 丙溴磷及其光解產(chǎn)物的質譜主要檢測參數(shù) (光照2 h)Table 3 Mass spectrometry parameters for the detection of profenofos and its photolytic products (light for 2 hours)

UPLC-MS/MS 檢測結果表明：丙溴磷在光降解過程中產(chǎn)生了5 種代謝物。通過與丙溴磷5 種代謝物標準品 (M1～M5) 的色譜圖進行對比，發(fā)現(xiàn)其保留時間一致，證明這5 種代謝物均為丙溴磷的光降解產(chǎn)物，分別為4-溴-2 氯苯基磷酸氫乙酯(M1)、O-(4-溴-2-氯苯基)-O-乙基-S-氫磷酸 (M2)、O-(2-氯苯基)-O-乙基-S-丙基硫代磷酸酯 (M3)、(2-氯-4-羥基苯基)鄰乙基-S-丙基硫代磷酸酯 (M4) 和2-氯-4-溴苯酚 (M5) (圖式2)。

圖式2 丙溴磷在水溶液中的光降解產(chǎn)物及反應途徑推測Scheme 2 Proposed photodegradation reaction pathway of profenofos in aqueous solution

丙溴磷在高壓汞燈照射下的光降解涉及到脫溴、P－O 鍵和C－S 鍵的斷裂以及羥基取代反應，推測其降解途徑如圖式2 所示。丙溴磷分子在光照條件下吸收光子中的能量轉變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，而激發(fā)狀態(tài)下的化合物結構不穩(wěn)定，極易發(fā)生化學反應。丙溴磷在光照作用下，P－S 鍵斷裂和羥基自由基發(fā)生反應生成M1；P－S 鍵斷裂后獲得質子生成M5；C－Br 鍵發(fā)生斷裂，分別獲得電子和質子后生成脫溴產(chǎn)物M3 或與羥基自由基結合生成M4；C－S 發(fā)生斷裂獲得質子后生成產(chǎn)物M2。

為了分析百菌清的降解產(chǎn)物，選取高壓汞燈照射下百菌清的反應液進行HPLC 檢測。通過與4-羥基百菌清標準品對比發(fā)現(xiàn)，在百菌清及其與丙溴磷的混合液中均檢測到了4-羥基百菌清，如圖1 所示，說明丙溴磷的存在促進了百菌清的光降解和4-羥基百菌清的產(chǎn)生。

圖1 4-羥基百菌清高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 4-OH-chlorothalonil

2.3 反應體系中羥基自由基的變化

羥基自由基是光化學反應中常見的活性氧化物，N,N-二甲基對亞硝基苯胺 (PNDA) 是羥基自由基的捕獲劑，PNDA 含量的變化對應著體系中羥基自由基含量的變化[15]。本研究結果 (表4) 顯示：在高壓汞燈照射下， PNDA 在純水中60 min內(nèi)無明顯變化，說明純水在光照下不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生微量的羥基自由基。在添加H2O2后，PNDA 的濃度在20 min 內(nèi)由8.22 μmol/L 降至0，證明PNDA 具有捕獲羥基自由基的能力；在PNDA +百菌清和PNDA + 丙溴磷體系中，PNDA 的反應率分別為14.74%和26.51%，說明在高壓汞燈照射下，百菌清和丙溴磷的混合水溶液分別產(chǎn)生一定量的羥基自由基；在PNDA + 百菌清 + 丙溴磷體系中PNDA 的反應率為33.58%，明顯高于PNDA +百菌清和PNDA + 丙溴磷體系，但低于二者總和，說明百菌清與丙溴磷的混合溶液在進行光降解時，產(chǎn)生的羥基自由基比各自單獨降解時要多。通過對其降解產(chǎn)物進行分析發(fā)現(xiàn)，在百菌清中加入丙溴磷并未改變其降解途徑，推測丙溴磷促進百菌清的降解是因為產(chǎn)生了更多的羥基自由基。

表4 高壓汞燈照射下不同反應液體系中PNDA 的濃度Table 4 Concentration of PNDA in different reaction fluid systems under high-pressure mercury lamp

3 結論

在高壓汞燈照射下，丙溴磷對百菌清在純水中的光降解具有促進效應，且與丙溴磷的濃度呈正相關，而百菌清對丙溴磷的光降解無影響。百菌清在單獨光降解和加入丙溴磷后其光降解產(chǎn)物均為4-羥基百菌清；而丙溴磷的光降解產(chǎn)物有5 種，分別為4-溴-2 氯苯基磷酸氫乙酯、O-(4-溴-2-氯苯基)-O-乙基-S-氫磷酸、O- (2-氯苯基) -O-乙基-S-丙基硫代磷酸酯、2-氯-4-羥基苯基) 鄰乙基-S-丙基硫代磷酸酯和2-氯-4-溴苯酚。利用PNDA試驗發(fā)現(xiàn)，在光照作用下，百菌清和丙溴磷的混合水溶液中產(chǎn)生了更多的羥基自由基，這為評估水體中百菌清和丙溴磷的復合污染時的生態(tài)毒性提供了參考依據(jù)。