鄧益琴

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300)

病害是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因之一。據(jù)《2022年中國水生動物衛(wèi)生狀況報告》報道，2021年中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)因病害造成的經(jīng)濟損失約為539億元。其中，弧菌病是影響多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物尤其是海水養(yǎng)殖魚類、貝類和甲殼類最常見的細菌性疾病之一[1]。Chong等[2]研究發(fā)現(xiàn)，石斑魚(Epinephelusspp.)約66.7%的疾病屬于弧菌病，且影響石斑魚生長的各個階段，并會導(dǎo)致高達50%的死亡率。由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的對蝦急性肝胰腺壞死綜合征(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)導(dǎo)致2010—2016年中國、馬來西亞、墨西哥、泰國和越南共計440億美元的經(jīng)濟損失；患AHPND的蝦苗在投苗后10～35 d內(nèi)，可達100%的死亡率[3]。因此，開展弧菌病防控技術(shù)研究對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。

目前，控制水產(chǎn)動物弧菌病的主要手段是以抗生素為代表的藥物防治、以疫苗為代表的免疫防治及以益生菌為代表的生物防治?？股厥窃缙陴B(yǎng)殖生產(chǎn)中防治弧菌病的主要手段，在弧菌病防控中也發(fā)揮著巨大的作用[4]。然而，隨著抗生素廣泛使用產(chǎn)生的選擇性壓力導(dǎo)致耐藥性細菌的發(fā)生、留存和傳播[5]，降低了藥物防控的效果，也對環(huán)境和食品安全造成了巨大的隱患。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中可用的抗生素藥劑僅包括甲砜霉素粉、 氟苯尼考粉、 氟苯尼考注射液、 氟甲喹粉、 恩諾沙星粉、 鹽酸多西環(huán)素粉、 維生素 C 磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑、鹽酸環(huán)丙沙星鹽酸小檗堿預(yù)混劑、硫酸新霉素粉、 磺胺間甲氧嘧啶鈉粉、 復(fù)方磺胺嘧啶粉、 復(fù)方磺胺二甲嘧啶粉和復(fù)方磺胺甲噁唑粉 13種藥物(水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年2號)，而隨著耐藥性的增加，原本可用于治療AHPND的四環(huán)素和土霉素已經(jīng)被限制使用[6]。疫苗接種是弧菌病的另一種有效控制策略，其是基于養(yǎng)殖動物免疫系統(tǒng)開發(fā)的用于預(yù)防感染性病害發(fā)生的一類生物制品。然而，弧菌疫苗具有一定的局限性：一是由于區(qū)域性菌種的差異導(dǎo)致有效性不理想；二是只能覆蓋部分養(yǎng)殖品種，對缺乏適應(yīng)性免疫反應(yīng)的蝦蟹貝等不能進行疫苗接種；三是疫苗再次免疫困難，免疫保護時間有限。因此，具有水產(chǎn)養(yǎng)殖市場授權(quán)的弧菌疫苗數(shù)量有限，國際上預(yù)防魚類弧菌病的商品化疫苗僅5種，主要針對溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)和鰻弧菌(V.anguillaris)感染引起的弧菌病[7]，國內(nèi)獲得中國新獸藥證書且用于預(yù)防弧菌病的疫苗僅2種，即牙鲆溶藻弧菌、鰻弧菌和遲緩愛德菌病多聯(lián)抗獨特型抗體疫苗，以及大菱鲆鰻弧菌基因工程活疫苗 (MVAV6203 株)[8]，不能完全覆蓋現(xiàn)有的弧菌種類和養(yǎng)殖品種。生物防治在水產(chǎn)養(yǎng)殖全過程進行疾病的廣譜預(yù)防和控制上具有優(yōu)勢，且對環(huán)境和食品安全影響小，是具有巨大潛力的病害防控技術(shù)。

本文在總結(jié)弧菌病病原學(xué)、流行病學(xué)、發(fā)病機制和診斷方法的基礎(chǔ)上，重點從作用機制方面綜述了弧菌病最新的生物防治技術(shù)，并闡述了生物防治技術(shù)在不同水產(chǎn)動物中的應(yīng)用，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物弧菌病的生物防治研究提供科學(xué)參考。

1 水產(chǎn)動物弧菌病概況

1.1 病原學(xué)

弧菌病通常指由弧菌科(Vibrionaceae)細菌引起的系統(tǒng)性細菌感染，進而引起的敗血癥、腸胃炎和潰瘍等[9](表1)。目前，被詳細描述和鑒定的弧菌科細菌有143種，隸屬于6個屬，即不利弧菌屬(Aliivibrio)、腸弧菌屬(Enterovibrio)、格里蒙特氏菌屬(Grimontia)、發(fā)光細菌屬(Photobacterium)、鹽弧菌屬(Salinivibrio)和弧菌屬(Vibrio)[7]。引起弧菌病最主要的是某些種類的弧菌，其次是發(fā)光桿菌。僅弧菌屬就有123個物種(http：//www.bacterio.net/)被鑒定，其中危害水產(chǎn)動物最主要的是哈維弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌[10]。此外，擬態(tài)弧菌(V.mimicus)是一種非嗜鹽弧菌，在淡水養(yǎng)殖魚類中也會造成嚴重危害。而引起弧菌病的發(fā)光桿菌主要是美人魚發(fā)光桿菌(P.damselae)，包括美人魚亞種[P.damselaesubsp.damselae，之前被稱為美人魚弧菌(V.damsela)]和殺魚亞種[P.damselaesubsp.psicicida，之前被稱為殺魚巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)]2個亞種。

表1 主要的水產(chǎn)動物弧菌病Tab.1 Main vibriosis of animals in aquatulture

1.2 流行病學(xué)

弧菌病最初在鰻魚中被描繪和命名，現(xiàn)在在全球范圍內(nèi)各種野生和養(yǎng)殖的海洋魚類、甲殼類、軟體動物和珊瑚等中流行(表1)。Noga[11]指出，所有海洋魚類可能至少對一種弧菌敏感。因此，弧菌病已成為許多水產(chǎn)動物常見的一種疾病。

溫暖的海水最有利于弧菌的生存和繁殖，病原體在魚類之間迅速傳播，使弧菌病成為一種“夏季”疾病。因此，弧菌病尤其對熱帶國家的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成威脅。如在馬來西亞及其鄰國，全年平均28 ℃的熱帶氣候，使得許多水產(chǎn)養(yǎng)殖場弧菌病頻發(fā)。其中，從養(yǎng)殖鱸、石斑魚和鯛等魚類中最常分離出的病原菌是哈維弧菌，其次是副溶血弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌[10]。Noorlis等[14]報道了在馬來西亞兩種常見淡水魚——羅非魚(Oreochromissp.)和鲇魚(Pangasiushypophthalmus)中副溶血弧菌的感染情況。另一項調(diào)查顯示，從泥蟹(Scyllaserrata)、花蟹(Portunuspelagicus)、地毯蛤(Paphiatextile)、硬殼蛤(Meretrixmeretrix)和泥海蜷(Cerithideaobtusa)中也分離出了副溶血弧菌，且這些弧菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用抗生素顯示出高耐藥性[15]。自2009年在中國發(fā)現(xiàn)AHPND以來，由副溶血弧菌引起的AHPND一直是全球蝦養(yǎng)殖業(yè)的重大威脅[3]，同時，中國象山灣大黃魚(Larimichthyscrocea)也受到溶藻弧菌、哈維弧菌和副溶血弧菌等的頻繁感染[16]。此外，近年來，隨著氣候變暖，許多溫帶和寒冷地區(qū)的軟體動物也暴發(fā)了弧菌病[17]。如在愛爾蘭海及周邊地區(qū)，弧菌病引起大范圍雙殼類軟體動物幼蟲和一些甲殼類動物大量死亡[18]。

美人魚發(fā)光桿菌是引起弧菌病樣癥狀的另一種主要病原體，這種疾病也稱為光細菌病[19]。自美人魚光桿菌首次從斑鰭光鰓魚(Chromispunctipinnis)的皮膚潰瘍中分離出以來[20]，其感染已傳播到各種宿主，如大菱鲆、虹鱒、卵形鯧鲹、鰻、鱸、鰤和鯛[21]。美人魚光桿菌包括美人魚亞種和殺魚亞種2個亞種。美人魚亞種已被廣泛認為是魚類和哺乳動物(包括人類)的機會致病菌，而殺魚亞種在多種海洋魚類中引起嚴重的敗血癥(稱為假結(jié)核)。與其他弧菌一樣，殺魚亞種因其無處不在，而且具有廣泛的抗生素耐藥性，使得其感染宿主廣泛，且缺乏有效的疫苗，對海水養(yǎng)殖業(yè)影響較大。

1.3 發(fā)病機制

疾病的發(fā)生是病原、環(huán)境和宿主 “三元”系統(tǒng)作用的結(jié)果(圖1)。從病原角度分析，弧菌病發(fā)病過程一般包括病原弧菌黏附與體表定植、侵襲、體內(nèi)定植與增殖擴散、產(chǎn)生毒素及宿主死亡等過程[7，22]。

圖1 水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生及其生物防治(改編自參考文獻[23]的圖1)Fig.1 Occurrence and biological control of animal diseases(adapted from Fig.1 of reference [23])

發(fā)病的第一個關(guān)鍵步驟是病原菌黏附并定植在宿主的黏膜表面。成功的黏附是后續(xù)定植和建立感染的先決條件，微生物細胞表面的疏水性決定了弧菌成功黏附到宿主組織。菌毛黏附素及鞭毛、外膜蛋白等非菌毛黏附素，在弧菌與宿主細胞的初始附著中也起著至關(guān)重要的作用。而生物膜是許多細菌在環(huán)境中生存和傳播的關(guān)鍵因素，且生物膜的形成是致病性弧菌定植的一個重要毒力因素。

病原菌定植只意味著微生物在宿主體表或體內(nèi)繁殖位點的建立，并不表示會導(dǎo)致對組織的入侵和損傷。病原體需要抵御宿主防御，從而侵入宿主組織，在宿主體內(nèi)定植并增殖擴散，進而對宿主組織造成損害。最常見的弧菌感染途徑是通過口腔、鰓和皮膚。在細菌感染后，宿主免疫系統(tǒng)觸發(fā)先天和/或適應(yīng)性免疫反應(yīng)來中和入侵的細菌。弧菌分泌的細胞外產(chǎn)物(ECPs)，如蛋白酶、溶血素、磷脂酶、鐵載體和細胞毒素，有助于其在引起宿主疾病前逃避宿主防御。炎癥反應(yīng)在細菌黏附和定植后的宿主防御機制中也至關(guān)重要?；【ㄟ^各種炎癥誘導(dǎo)因子，如脂多糖、肽聚糖、脂肽、脂質(zhì)A、鞭毛蛋白、菌毛蛋白、DNA和外毒素，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致宿主過度產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，造成宿主嚴重的組織損傷甚至死亡，即敗血癥。此外，分泌系統(tǒng)，如Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion systems，T3SSs)，是高度專門化的弧菌等革蘭氏陰性菌注射裝置，通過細胞膜將細菌蛋白(效應(yīng)器)直接注射到宿主細胞的細胞質(zhì)中，并參與細胞毒性，并能誘導(dǎo)細胞自噬、變圓和裂解等。

需要特別注意的是，盡管高毒力弧菌菌株可引起原發(fā)疾病，特別是在無脊椎動物和幾種養(yǎng)殖魚中，如患AHPND的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)及1990—1996年西班牙西南部養(yǎng)殖場感染弧菌的金頭鯛(SparusaurataL.)，弧菌常與其他已知的細菌病原體[如海水屈撓桿菌(Tenacibaculummaritimum)和假單胞菌(Pseudomonasspp.)]及病毒性病原體[如感染性胰腺壞死病毒(IPNV)和海洋雙RNA病毒(MABV-F)]等實現(xiàn)共感染。因此，弧菌經(jīng)常被稱為繼發(fā)性或機會性病原體。

1.4 診斷方法

弧菌病的診斷通常使用標準的微生物學(xué)方法，基于病原體分離和培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)的細菌后進行后續(xù)的鑒定和人工感染試驗等[21-22]。

1)病原體的分離和培養(yǎng)。病原體的分離和培養(yǎng)需要選定具有臨床癥狀的目標組織。分離全身弧菌感染的首選器官是腎臟、肝臟和脾臟，當(dāng)存在潰瘍時，可選擇從病變皮膚中分離。此外，胃腸道和眼等也可以進行弧菌的分離。合適的培養(yǎng)條件是獲得病原菌的基礎(chǔ)，主要考慮培養(yǎng)基、溫度和時長等因素。如硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽汁鹽-蔗糖(TCBS)是分離弧菌最常用的選擇性培養(yǎng)基。選擇性培養(yǎng)基的利用也被證明在針對特定物種的弧菌方面更有效。例如，CHROMagarTMVibrio(CaV)用于分離副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，而X-Gal(VVX)、纖維二糖多黏菌素(CPC)和纖維二糖黏菌素(CC)瓊脂則專門用于分離創(chuàng)傷弧菌。

2)細菌生理生化、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法的鑒定。傳統(tǒng)的試管培養(yǎng)法分析細菌生理生化指標，工作量大且對技術(shù)熟練度要求較高。近年來，國內(nèi)外推出了多種類型的成套鑒定系統(tǒng)即編碼鑒定方法。如法國生物-梅里埃集團的API/ATB、瑞士公司的Enterotube(腸管系統(tǒng))和美國的Biolog全自動和手動細菌鑒定系統(tǒng)等，使得細菌鑒定逐步簡易化、微量化和快速化。其中，API20E系統(tǒng)可用于鑒定副溶血弧菌和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種等。免疫學(xué)檢測技術(shù)是基于免疫學(xué)中抗原同抗體能特異性結(jié)合，通過抗原檢測抗體或通過抗體檢測抗原的技術(shù)。如免疫層析法被用于鑒定產(chǎn)生tdh的副溶血弧菌。然而生理生化和免疫學(xué)鑒定方法往往操作復(fù)雜、檢測耗時，甚至試劑價格昂貴等，因此，快捷、靈敏的分子生物學(xué)檢測技術(shù)迅速發(fā)展，并被廣泛運用。最常用的是基于16S rRNA的聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)。16S rRNA是弧菌科所有物種中唯一可用的基因，是避免假陽性檢測的最佳基因。然而，在某些情況下，由于16S rRNA的鑒別能力較低，不能鑒定到種，因此，針對蛋白質(zhì)編碼基因的PCR技術(shù)常用于鑒定弧菌，并發(fā)展出實時PCR技術(shù)(real-time PCR，RT-PCR)、多位點序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)等。如中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所開發(fā)了一套三重PCR檢測方法，用于同時檢測副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌和鰤諾卡氏菌[24]，并建立了一種多位點序列分析方法鑒定哈維弧菌[25]。

3)人工感染試驗驗證。對細菌進行鑒定之后，并不能確定其為疾病的原發(fā)病原。通常情況下必須對鑒定的潛在病原菌進行致病性試驗，即人工感染試驗，依據(jù)科赫法則確證該物種的致病性。

2 水產(chǎn)動物弧菌病的生物防治

生物防治是利用物種間的相互關(guān)系，以一種或一類生物或其衍生物抑制另一種或另一類生物的方法。目前，開展的弧菌病生物防治技術(shù)(圖1，表2)主要有分別基于細菌、植物和病毒的益生菌及其相關(guān)產(chǎn)品、藥用植物及噬菌體，它們主要通過直接殺滅弧菌、抑制弧菌生長、控制弧菌毒力(調(diào)控)基因表達與傳播、刺激宿主免疫反應(yīng)及改善養(yǎng)殖環(huán)境等方式防治弧菌病。

表2 水產(chǎn)動物弧菌病生物防治技術(shù)Tab.2 Biological control of vibriosis in animals in aquaculture

2.1 生物防治技術(shù)

2.1.1 益生菌及其相關(guān)產(chǎn)品 用于生物防治的益生菌及其相關(guān)產(chǎn)品主要包括益生菌(probiotics)、益生元(prebiotics)、后生元(postbiotics)和合生元(synbiotics)(表2)。1986年，Kozasa首次將益生菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，1999年Gatesoupe首次將益生菌定義引申到水產(chǎn)動物上[26]。益生菌是一類活的微生物，當(dāng)攝入數(shù)量足夠時有益于宿主健康[27]。益生菌可單獨使用或者混合使用[28]。目前，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌主要有乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、腸球菌(Enterococcus)、肉桿菌(Carnobacterium)和酵母菌(Yeast)[29-31]。益生元是指一些不被宿主消化吸收，卻能夠有選擇性地促進體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，改善宿主免疫反應(yīng)，幫助宿主抵御病原體或生物體的非生物應(yīng)激源，進而改善宿主健康的有機物質(zhì)[32]。益生元主要是各種寡糖或低聚糖，其中，水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生元包括甘露寡糖(MOS)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、阿拉伯木聚糖寡糖(AXOS)和菊粉。

盡管益生菌對防控弧菌病具有良好的效果，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加大量活細菌的安全性受到質(zhì)疑，因為這些細菌也可能通過水平基因轉(zhuǎn)移等獲得高水平的抗生素耐藥性基因和毒力因子[33]。為此，研究者又開發(fā)出了后生元和合生元作為治療和預(yù)防弧菌病的可行策略。后生元是來自益生菌微生物的非活性細菌產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物，在宿主中具有生物活性，這些物質(zhì)直接或間接地對宿主產(chǎn)生有益影響[34]。盡管后生元不含活微生物，但它們通過類似于益生菌的機制顯示出有益宿主健康的效果，同時最大限度地降低了與攝入相關(guān)的風(fēng)險[34]。目前，可用的后生元包括有益微生物的無細胞上清液、胞外多糖、抗氧化酶與過氧化物酶等酶類、細菌脂磷壁酸等細胞壁成分、短鏈脂肪酸、細菌裂解物，以及維生素、酚類代謝產(chǎn)物和芳香氨基酸等腸道微生物群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等。合生元是益生菌和益生元的混合物，兩者之間可通過協(xié)同和/或互補作用增強宿主生長性能[35]。其作用機理主要是合生元中的益生元通過選擇性刺激一種或有限數(shù)量的益生菌的生長和/或激活其代謝，來提高其中的益生菌在胃腸道中的存活和植入，最終改善宿主健康，如益生菌可以利用益生元作為碳源，在發(fā)酵過程中實現(xiàn)高生長率和細胞產(chǎn)量。此外，合生元中的益生元也可能直接作用于宿主免疫系統(tǒng)。目前，具有益生元特性的化合物，如甘露寡糖、低聚果糖、短鏈低聚果糖(SC)、菊粉、殼聚糖寡糖(COS)、低聚半乳糖、阿拉伯低聚木糖和異麥芽寡糖(IMO)，可與益生菌組合成水產(chǎn)養(yǎng)殖合生元。

2.1.3 噬菌體(bacteriophages) 噬菌體是感染和殺死細菌的病毒，廣泛分布在細菌宿主聚集的地方，如土壤或動物的腸道，其自然來源之一是海水，作為抗生素的替代品已經(jīng)使用了90多年，可對抗多種細菌[38]。與化學(xué)治療相比，噬菌體治療具有有機、經(jīng)濟、安全、高特異性及無副作用等特點。噬菌體有裂解性噬菌體和溶原性噬菌體兩種類型。裂解性噬菌體侵入宿主細胞后，隨即關(guān)閉其防御機制，自身復(fù)制并引起宿主細胞裂解。溶原性噬菌體侵入宿主細胞后，其核酸附著并整合在宿主染色體上，與宿主核酸同步復(fù)制，宿主細胞不裂解而繼續(xù)生長。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病控制中所選噬菌體應(yīng)具有溶解性，以避免有毒基因水平轉(zhuǎn)移到宿主，從而使養(yǎng)殖動物具有毒性。

2.2 生物防治機制

2.2.1 改善養(yǎng)殖水質(zhì) 不適當(dāng)?shù)乃|(zhì)會損害養(yǎng)殖動物的健康，削弱養(yǎng)殖動物的免疫系統(tǒng)，使得弧菌有條件感染宿主，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖動物大量死亡。益生菌尤其是光合細菌、硝化細菌和芽孢桿菌，能夠通過氧化、硝化、反硝化、硫化、氨化、解硫和固氮等作用，迅速降低水體中的氨氮、亞硝氮和硫化氫等有害物質(zhì)含量，以及降解水產(chǎn)動物排泄物、殘余餌料和動植物殘骸等大分子有機物，從而改善養(yǎng)殖水質(zhì)，降低弧菌感染率，促進養(yǎng)殖動物健康生長[39]。如芽孢桿菌，包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，可以幫助氨氮和亞硝氮的礦化，通過硝化和/或好氧反硝化防止含氮廢物的積累[40]，故此類益生菌制劑也被稱為微生態(tài)水質(zhì)調(diào)節(jié)劑。與此類似，綠藻和硅藻等微藻，可吸收水體中各種營養(yǎng)鹽，減少水中氨氮和亞硝氮等有害物質(zhì)，有效降低動物被弧菌感染的風(fēng)險[41]。

2.2.2 直接殺死或抑制弧菌 益生菌通過產(chǎn)生抗生素、細菌素、過氧化氫、水解酶及乳酸等抑制其他微生物的生長，如益生菌產(chǎn)生的細菌素是由細菌核糖體合成的抗菌肽，通常對同種近緣菌株具有殺菌或抑菌作用[42]，其主要通過直接溶解目標細菌細胞壁、抑制目標細菌細胞壁合成及在細胞膜上打孔3種作用方式發(fā)揮抑菌作用[40]。微藻和微藻共生細菌構(gòu)成“綠水”系統(tǒng)，通過產(chǎn)生對弧菌有害的抗菌物質(zhì)(如游離脂肪酸和原二硫辛酸)，從而競爭性排斥限制弧菌可獲得的營養(yǎng)量，創(chuàng)造一個限制系統(tǒng)中弧菌生長的環(huán)境。微藻產(chǎn)生的胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物，也可能抑制致病菌生長，有效地預(yù)防和控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病，包括弧菌病[43]。如微藻產(chǎn)生的長鏈飽和及不飽和脂肪酸通過誘導(dǎo)原生質(zhì)體裂解，成為對抗多種致病菌的殺菌劑[44]；微藻也可釋放萜烯、糖苷、多不飽和醛及葉綠素a衍生物等化合物破壞病原菌，抑制病原菌生長[45]。此外，植物提取物如鄰苯三酚也具有較強的殺菌效果，通過破壞弧菌細胞壁結(jié)構(gòu)等降解弧菌細胞[46]。而噬菌體則主要通過感染和裂解細菌達到防控弧菌病的目的。

2.2.3 刺激養(yǎng)殖動物免疫系統(tǒng) 益生菌進入腸道后，可以與免疫系統(tǒng)之間相互作用，提高淋巴細胞和吞噬細胞的活性，刺激宿主特異性和非特異性免疫，增強水產(chǎn)動物的免疫力和對傳染病的抵抗力，達到抗病效果[47]。與其相關(guān)的益生元、合生元和后生元也都可改善宿主免疫。

藥用植物也可安全有效地提高宿主免疫、代謝和生長能力，幫助宿主抵抗疾病[36]。如微藻產(chǎn)生的β-胡蘿卜素等可改善養(yǎng)殖動物生長，增強其免疫反應(yīng)和對抗副溶血弧菌感染的能力等。植物提取物生物堿、萜類、鞣質(zhì)、皂甙、糖苷類、黃酮類、酚類、甾體和精油等植物生物活性物質(zhì)也具有增強動物免疫力的特性。

2.2.4 阻斷附著位點 病原菌侵染宿主的第一步是黏附，而益生菌一個重要的益生作用機制就是對黏附位點的競爭，也稱為“競爭性排斥”。當(dāng)攝入益生菌時，它們會競爭結(jié)合位點，留下較少的結(jié)合位點供病原體使用。病原體通過腸道，在無結(jié)合位點的情況下能更快地離開宿主，降低感染概率。

2.2.5 競爭營養(yǎng)和能量 任何微生物種群的生存都取決于其在同一環(huán)境中與其他微生物爭奪營養(yǎng)和可用能量的能力。益生菌可利用更多可用營養(yǎng)來戰(zhàn)勝病原體，導(dǎo)致病原菌受饑餓而無法在腸道中生存。如鐵載體是一種低分子量的鐵螯合劑，可以溶解沉淀的鐵或從鐵絡(luò)合物中提取鐵，從而使其用于細菌生長。產(chǎn)鐵載體的益生菌，可以在低鐵環(huán)境中螯合三價鐵，故不利于病原菌的生長[48]。

2.2.6 干擾群體感應(yīng)效應(yīng) 群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是一種細胞間的通信系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，細菌通過產(chǎn)生、檢測和響應(yīng)自身誘導(dǎo)物(細胞外小信號分子)來控制某些基因的表達，以協(xié)調(diào)其行為。在弧菌中發(fā)現(xiàn)了三通道QS系統(tǒng)，即LuxM/LuxN、LuxS/LuxPQ和CqsA/CqsS通道。3個自身誘導(dǎo)劑信號分子Harveyi，即自身誘導(dǎo)劑1(HAI-1)、自身誘導(dǎo)物2(AI-2)和Cholerae自身誘導(dǎo)劑1(CAI-1)是分別由LuxM、LuxS和CqsA蛋白產(chǎn)生的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)N-(3-羥基丁酰基)-L-高絲氨酸內(nèi)酯、呋喃基硼酸二酯和(Z)-3-氨基十一碳-2-烯-4-酮，并分別由LuxN、LuxPQ和CqsS蛋白感應(yīng)[49]。QS系統(tǒng)被證明可以調(diào)節(jié)弧菌的多種生理活性，包括毒力、共生、感受態(tài)、接合轉(zhuǎn)移、抗生素產(chǎn)生、運動性和生物膜形成。一些益生菌，如抑黃桿菌(Phaeobacterinhibens)，可通過分泌AHL信號分子等調(diào)節(jié)弧菌的QS途徑，最終調(diào)節(jié)弧菌的生長和毒力等[50]?！熬G水”系統(tǒng)中的許多微藻或細菌可以分泌QS抑制劑(即N-酰基-絲氨酸內(nèi)酯類似物)，干擾弧菌中毒力基因的表達，并抑制其致病性。植物提取物，如十一酸(UDA)和生長素(IAA和IBA)等，也可通過下調(diào)弧菌QS相關(guān)主調(diào)控基因(luxO、luxQ、luxR和luxS)，干擾弧菌QS，從而抑制弧菌毒力基因表達。

7#橋臺外側(cè)存在兩個方向的臨空面，6#橋臺內(nèi)側(cè)坡腳存在長近50 m的凹巖腔，凹巖腔砂泥巖界面發(fā)現(xiàn)明顯的相對位移痕跡(見圖10)，7#臺南側(cè)發(fā)現(xiàn)變形體并伴隨明顯的新近活動現(xiàn)象(見圖12)，因此該病害本質(zhì)上為一巖質(zhì)滑坡體，滑床為泥巖或粉砂質(zhì)泥巖，滑動面為砂泥巖接觸面，后緣受L3裂隙、樁基孔發(fā)現(xiàn)的裂隙綜合控制，前緣為兩臨空面交匯帶，活動矢量方向非巖層傾向，受巖層產(chǎn)狀、凹巖腔、臨空面綜合控制，約205°左右，滑坡體規(guī)模約3.5×104 m3。

2.2.7 抑制水平基因轉(zhuǎn)移 水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)不同于垂直基因轉(zhuǎn)移，其是種內(nèi)或種間不同個體之間遺傳物質(zhì)的交流方式，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合轉(zhuǎn)移3種方式[51]。接合轉(zhuǎn)移是功能基因傳播和擴散效率最高的水平基因轉(zhuǎn)移方式，其影響原核生物的致病性、耐藥性和代謝等各個方面[50]。哈維弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌等常見弧菌病原均被發(fā)現(xiàn)，可通過接合轉(zhuǎn)移獲取外源毒力和耐藥基因[52-55]。乳桿菌和乳酸菌等益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的不飽和脂肪酸(如油酸和亞油酸)，被發(fā)現(xiàn)可抑制細菌接合轉(zhuǎn)移[56]。因此，益生菌產(chǎn)生的不飽和脂肪酸通過抑制接合轉(zhuǎn)移可阻礙弧菌毒力和耐藥基因的獲得，最終控制弧菌病害的發(fā)生[57-58]。而油酸、亞油酸、脫氫戊烯酸也是微藻和植物提取物，說明微藻和植物提取物也可抑制細菌接合轉(zhuǎn)移[59]，最終控制弧菌感染。

3 水產(chǎn)動物弧菌病生物防治技術(shù)的應(yīng)用

3.1 益生菌和植物(提取物)的單一使用

益生菌和植物(提取物)的生物防治技術(shù)已被廣泛研究并應(yīng)用于水產(chǎn)動物弧菌病防控(魚、蝦、蟹和貝類中弧菌病的生物防治見電子版附表A)中。使用最多的是益生菌和植物提取物，通常以拌料投喂形式進行疾病的預(yù)防和治療。在魚類養(yǎng)殖中，主要用于抵抗哈維弧菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌。如從健康石斑魚腸道中分離到的芽孢桿菌K2拌料投喂石斑魚后，可顯著提高其生長性能、免疫力和對哈維弧菌感染的保護力；經(jīng)芽孢桿菌K2拌料投喂28 d后，用哈維弧菌攻毒，拌料投喂組石斑魚存活率(55%)顯著高于對照組(25%)[60]。用創(chuàng)傷弧菌感染石斑魚后，用植物提取物油酸拌料投喂石斑魚，可顯著提高石斑魚免疫反應(yīng)水平和存活率(從對照組的43.3%提高至63.3%)[61]。在蝦類養(yǎng)殖中，由副溶血弧菌VPAHPND感染引起的急性肝胰腺壞死病及哈維弧菌感染引起的發(fā)光弧菌病是最主要的弧菌病，且蝦類生物防治技術(shù)研究主要集中于全球養(yǎng)殖產(chǎn)量第一的凡納濱對蝦。如球形紅桿菌SS15可產(chǎn)生抗弧菌肽，伴飼投喂可將感染VPAHPND的凡納濱對蝦的存活率提高27%[62]。而日本納豆浸提液能夠抑制細菌生物膜的形成，其拌料投喂后可將感染哈維弧菌的凡納濱對蝦的成活率從對照組的29%提高到76%[63]。在貝類養(yǎng)殖中，貝類弧菌病生物防治技術(shù)主要針對感染副溶血弧菌的鮑魚和牡蠣。如解淀粉芽孢桿菌可促進皺紋盤鮑(Haliotisdiscusnannai)的攝食和生長，且有效地提高了鮑魚的非特異性免疫和對副溶血弧菌感染的抵抗力。其中，105CFU/g解淀粉芽孢桿菌拌料組投喂效果最佳，感染副溶血弧菌后鮑魚死亡率從100%降低至約50%[64]。在12.5 ℃條件下，用1.5%葡萄籽提取物凈化人工海水2 d，可將太平洋牡蠣(Crassostreagigas)中副溶血弧菌數(shù)的對數(shù)(lg)減少3.52[65]。

3.2 益生菌和植物(提取物)的復(fù)合和聯(lián)用

相同的防控方式不僅可單一使用，還可復(fù)合使用，且復(fù)合可能會取得更好的效果。如用添加市售復(fù)合益生菌(含有枯草芽孢桿菌7.0×109CFU/g、地衣芽孢桿菌3.0×109CFU/g、乳桿菌5.0×108CFU/g和節(jié)桿菌1.0×108CFU/g)的飼料投喂軍曹魚(Rachycentroncanadum)，可顯著提高其生長和免疫力，并顯著降低哈維弧菌感染后的死亡率，且最佳復(fù)合益生菌添加劑量為3.3 g/kg[66]。用益生元AXOS和菊粉單獨或復(fù)合拌料投喂凡納濱對蝦后發(fā)現(xiàn)，與單一益生元處理相比，飼料中同時添加4 mg/g的AXOS和菊粉顯著提高了飼養(yǎng)8周后對蝦的生長參數(shù)及免疫相關(guān)基因的表達，還顯著提高了溶藻弧菌感染對蝦的存活率(約從10%提高至50%)[67]。用同溫層芽孢桿菌A3440和/或海洋褐色桿菌AP1220拌料投喂雜色鮑(Haliotisdiversicolor)180 d后，進行哈維弧菌感染試驗發(fā)現(xiàn)，單獨或者復(fù)合益生菌均可提高稚鮑的殼長和濕質(zhì)量，其中，A3440拌料投喂后稚鮑殼長和濕質(zhì)量增加最多，其次是復(fù)合益生菌和AP1220，而AP1220拌料投喂后稚鮑存活率提高最多，從對照組的61.33%±8.33%提高至89.33%±10.07%，其次是復(fù)合益生菌(84.00%±6.93%)和A3440(70.67%±28.37%)[68]。

不同防控方式也可以聯(lián)用，如益生菌和益生元組合成合生元使用，往往比單用益生菌或者益生元的防控效率更高。如枯草芽孢桿菌和低聚果糖聯(lián)合使用，對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)幼魚免疫應(yīng)答和抗病性具有顯著的促進作用，且在飼料中添加5.62×107CFU/g枯草芽孢桿菌后，再分別添加0、0.2%和0.4% FOS，創(chuàng)傷弧菌感染后10 d，幼魚的累積死亡率分別為62.96%±1.85%、57.41%±1.85%和29.63%±1.85%[69]。

3.3 噬菌體的應(yīng)用

近年來，噬菌體生物防治技術(shù)逐漸成為研究熱點，其主要通過直接投入養(yǎng)殖水體達到裂解病原菌和凈化水體的目的，并且也有單一和復(fù)合使用的方式。如從智利圣地亞哥中心市場購買的雙殼類樣品中分離出來的噬菌體，在鰻弧菌感染復(fù)數(shù)(MOA)為1和20時，將噬菌體直接加入養(yǎng)殖水體，可使大西洋鮭(Salmosalar)的存活率提高到100%，而在無噬菌體的情況下，存活率不到10%[70]。從牡蠣中分離出的噬菌體Viha 10和從斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)孵化場分離出的噬菌體Viha 8分別裂解了70%和68%所測試的100株哈維弧菌菌株，而兩者的混合物可裂解94%的哈維弧菌菌株；養(yǎng)殖水中投入2×106PFU/mL(plaque forming units，PFU)的噬菌體處理，使斑節(jié)對蝦幼蝦的存活率超過85%[71]。從夏威夷海水中分離到抗珊瑚弧菌和抗管狀弧菌的5個噬菌體，其中，單個噬菌體處理可以保護牡蠣幼體免受珊瑚弧菌和管狀弧菌的感染，有效降低了幼蟲的死亡率，并呈劑量依賴性；用致死劑量的珊瑚弧菌攻毒6 d后，5個噬菌體的混合物可將美洲牡蠣(Crassostreavirginica)和太平洋牡蠣的幼體死亡率降低91%[72]。

總體來說，生物防治技術(shù)在各種水產(chǎn)動物弧菌病防治中被廣泛研究，體內(nèi)外試驗均證明，其可通過殺死或抑制弧菌并刺激宿主免疫反應(yīng)等顯著提高養(yǎng)殖動物的存活率。此外，同一防控類型的不同防控技術(shù)，如不同的益生菌、植物(提取物)及噬菌體之間可以復(fù)合使用，且不同的防控類型，如益生菌與益生元、益生菌與植物提取物等之間可以聯(lián)合使用，同一防控技術(shù)可能呈現(xiàn)劑量依賴性，但目前主要停留在理論基礎(chǔ)研究上，有效的成果轉(zhuǎn)化和商業(yè)化效率較低。

4 存在問題及展望

弧菌病危及全球水產(chǎn)業(yè)，由于多種因素影響(如弧菌的異質(zhì)性、適應(yīng)能力及在海洋環(huán)境中普遍存在的特性)，弧菌病防治已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)持續(xù)面臨的問題。基于抗生素治療弧菌病的環(huán)境不友好性及疫苗使用的局限性等，良好的管理措施和潛在的生物防治方法是降低水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失和確保本行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最佳途徑。目前，正在探索的生物防治方法，主要包括使用益生菌(益生元、后生元、合生元)、藥用植物和噬菌體，然而，選擇使用的方法將取決于養(yǎng)殖方式、養(yǎng)殖規(guī)模、感染水平、有效性和經(jīng)濟成本等因素。盡管每種方法都有顯而易見的優(yōu)勢，但仍然存在一些缺陷和知識空白，包括作用機制、作用模式，對水產(chǎn)動物和環(huán)境可能產(chǎn)生的毒性，以及它們在實際養(yǎng)殖系統(tǒng)中應(yīng)用的可行性。這些知識是生物防治方法被推廣和商業(yè)化所必需考量的，因此，未來可從以下方面重點開展研究。

4.1 加強生物防治技術(shù)作用機制的基礎(chǔ)研究

疾病的發(fā)生是病原、環(huán)境和宿主相互作用的結(jié)果。生物防治方法不僅可改善養(yǎng)殖環(huán)境，還可刺激宿主免疫系統(tǒng)。針對病原方面，主要集中在對病原菌的抑制和消殺方面，但具體的抑制機制如阻斷附著位點及競爭營養(yǎng)和能量的研究較少。同時，病原菌毒力基因的存在與表達決定其毒力作用的發(fā)揮。因此，深入研究生物防治技術(shù)的作用機制，尤其是該技術(shù)對群體感應(yīng)和水平基因轉(zhuǎn)移等的作用機制，是建立毒力控制技術(shù)的基礎(chǔ)，可為生物防治技術(shù)的建立提供重要理論支持。

4.2 建立生物防治技術(shù)標準和技術(shù)體系

未來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的方向是精準化、標準化和集成化作業(yè)。目前的研究更多是針對單一生物防治技術(shù)的防治原理和防治效果的解析。不同防治方法間的協(xié)同、拮抗作用，以及劑量依賴性和時間依賴性等都不甚清楚。因此，在明晰生物防治作用機制和作用效率的基礎(chǔ)上，需要進一步探究不同生物防治技術(shù)間的復(fù)合、混合作用效果，并確定最佳作用劑量、作用時機和作用時間等動力學(xué)參數(shù)，建立一套生物防治的標準和體系，以擴展生物防治技術(shù)的使用范圍，增強生物防治技術(shù)的作用效果。

4.3 加快推進生物防治技術(shù)體系的商業(yè)化

生物防治具有使用廣譜性和安全性的特點，是最具應(yīng)用前景的水產(chǎn)疾病防治手段。目前，生物防治多集中于基礎(chǔ)研究和小范圍的應(yīng)用示范層面，為促進生物防治的應(yīng)用，以增效降本、環(huán)境友好為原則，亟待加快推進生物防治商業(yè)化體系的探索，進一步實現(xiàn)生態(tài)化的水產(chǎn)疾病防控，為實現(xiàn)中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展提供重要技術(shù)支撐。