高溫脅迫下黑龍江茴魚幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)變化及轉(zhuǎn)錄組表達特征

豐超杰，劉霞飛，張穎，呂偉華，韓世成，張永泉，許式見，馬波*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076；3.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；4.杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司，浙江 衢州 324000)

溫度是影響魚類生長、代謝過程中最重要的環(huán)境脅迫因子之一[1]。魚類作為變溫動物，由于缺乏自身體溫調(diào)節(jié)機制，水溫可直接或間接影響魚類正常生命活動[2]。溫度變化可引起魚類機體新陳代謝、免疫應(yīng)答等生命活動發(fā)生紊亂，從而引發(fā)疾病甚至死亡[3]。近年來，隨著全球氣候變暖，夏季連續(xù)高溫對魚類的生長存活產(chǎn)生了諸多不良影響，研究者開始廣泛關(guān)注魚類應(yīng)對高溫或熱脅迫下的生理調(diào)控機制[4]。對細鱗鮭(Brachymystaxlenok)[5]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[6]、哲羅鮭(Huchotaimen)[7]及虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[2]等冷水性魚類的研究表明，急性溫度變化可引起魚類機體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致肝臟、鰓及腸等器官組織損傷并失去生理調(diào)節(jié)功能。

RNA測序(RNA-Seq)又稱轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，指在生物的某一發(fā)育時期或特定條件下組織或細胞所轉(zhuǎn)錄的全部RNA，包括mRNA和非編碼RNA[8]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已在羅非魚(Oreochromismossambicus)[9]、虹鱒[10]和細鱗鮭[11]等多個水生生物中得到廣泛應(yīng)用，從分子水平上解釋了這些魚類在特定生存環(huán)境條件下的生理調(diào)控機制。

黑龍江茴魚(Thymallusarcticusgrubei)隸屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)茴魚屬(Thymallus)，主要分布于中國黑龍江、牡丹江、烏蘇里江及松花江等流域[12]。黑龍江茴魚肉質(zhì)細嫩、味道鮮美且營養(yǎng)豐富，是黑龍江省特有的經(jīng)濟物種。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染及棲息地被破壞等因素影響，黑龍江茴魚的野生資源量急劇下降，已被列入《中國瀕危動物紅皮書魚類》[13]。作為冷水性魚類，黑龍江茴魚對外界環(huán)境水溫變化較為敏感，尤其是全球環(huán)境變暖的大趨勢下，高溫脅迫對其正常生理代謝產(chǎn)生較大的負面影響。目前，盡管在國內(nèi)已開展了黑龍江茴魚人工繁殖[14]及種質(zhì)鑒定[15]等研究工作，但有關(guān)黑龍江茴魚應(yīng)對高溫脅迫的分子調(diào)控機制尚未見報道。肝臟在魚類的物質(zhì)代謝、免疫防御等生命活動中扮演著極為重要的角色。本研究中，探究了在持續(xù)高溫脅迫下黑龍江茴魚幼魚肝臟組織的病理變化及轉(zhuǎn)錄組表達特征，以期為探索黑龍江茴魚在高溫脅迫下的響應(yīng)機制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑龍江茴魚幼魚采集自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海試驗基地。選取健康狀況良好、體表無明顯外傷且個體相近的黑龍江茴魚幼魚240尾，體長為(5.25±0.25)cm，體質(zhì)量為(1.73±0.23)g。試驗魚置于全自動溫控循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d，期間光暗比為12 h∶12 h，水溫為(11±0.5)℃，pH為(6.91±0.08)，溶解氧≥6 mg/L。每天換水一次，每次換水量為總體積的20%。每天8：00和17：00各投喂1次，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%～3%。試驗前禁食24 h，試驗期間不投喂。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 基于課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江茴魚分別在8、11、14、17 ℃不同溫度的循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖30 d時，17 ℃組魚的體長和體質(zhì)量增長緩慢且死亡率較高，為11 ℃組的兩倍多。為此，本試驗中設(shè)置11 ℃對照組(control，C)和17 ℃高溫組(heat，H)，每個處理組設(shè)置3個平行，每個平行放養(yǎng)40尾魚。以1 ℃/h的升溫速率進行升溫，直至達到目標溫度。在達到目標溫度后的1、6、12、24、48 h對高溫組和對照組分別進行采樣，從每組隨機取18尾，即每個平行取6尾。使用麻醉劑(MS-222)麻醉后，從每個平行取3尾魚的肝臟組織混合后，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序；每個平行余下3尾魚的肝臟組織于Bouin氏液中固定，48 h后轉(zhuǎn)入體積分數(shù)為70%的乙醇中保存，用于組織結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.2 肝臟石蠟切片制作 取固定后的肝臟組織樣品分別經(jīng)過流水沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋等處理后進行切片，制作成厚度為5～6 μm的組織切片，HE染色后用中性樹脂封片，在Nikon(Eclipse Ci-L)光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序 為了減少個體之間的差異，各處理組轉(zhuǎn)錄組測序設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。使用Trizol試劑從解凍黑龍江茴魚肝臟組織混合樣品中分別提取RNA，采用Aglient 2100生物分析儀系統(tǒng)，檢測各RNA樣品的純度、濃度及完整性等。轉(zhuǎn)錄組測序由歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司(上海)完成，利用Illumina HiSeq 2500平臺進行高通量測序。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、組裝測序及基因功能注釋

為了保證信息分析的準確性，對原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行過濾后，采用Trinity軟件Paired-end的拼接方法得到Transcript序列，根據(jù)序列同源性及長度，挑選出最長的一條作為Unigenes；之后再利用CD-HIT軟件聚類去冗余得到一套最終的Unigenes，以此作為后續(xù)分析的參考序列。利用Diamond軟件對Unigene進行NR、KOG、GO、Swiss-Prot、eggNOG及KEGG數(shù)據(jù)庫比對(E<10-5)，篩選具有最高序列同源性的蛋白，從而得到功能注釋信息。利用HMMER 3.0軟件在Pfam數(shù)據(jù)庫中進行Unigenes功能分析。

1.2.5 差異基因的表達和聚類分析 采用RSEM軟件中bowtie 2獲取每個樣本中比對到Unigenes上的clean reads數(shù)，同時采用Express軟件計算Unigenes的表達量(FPKM值)。利用DESeq2軟件包對各個樣本基因的counts數(shù)目進行標準化處理，分析基因表達水平。為了控制假陽性率，將P<0.05且|log2(fold change)|>1作為顯著性差異基因的篩選標準，并對不同養(yǎng)殖時間得到的差異基因進行聚類分析。

1.2.6 差異基因的富集分析 對差異基因進行GO富集分析，對其功能進行描述(結(jié)合GO注釋結(jié)果)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway分析(結(jié)合KEGG注釋結(jié)果)，并用超幾何分布檢驗方法計算每個Pathway條目中差異基因富集的顯著性。

1.2.7 qPCR驗證 為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，在轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中選取6個差異基因進行實時熒光定量PCR。使用與轉(zhuǎn)錄組測序同批次的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的cDNA，稀釋后每個樣本設(shè)置3次重復(fù)試驗，以β-actin為參考基因。使用NCBI Primer BLAST設(shè)計引物(表1)。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性 3 min；95 ℃下變性 5 s，60 ℃下退火 15 s，72 ℃下延伸 30 s(收集熒光)，共進行40個循環(huán)；最后在72℃下再延伸2 min。用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

表1 引物及序列Tab.1 Primers and sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示。利用熒光定量PCR儀系統(tǒng)軟件分析PCR結(jié)果，計算基因相對表達量(2-ΔΔCt)，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化

對兩組黑龍江茴魚幼魚的肝臟組織結(jié)構(gòu)進行觀察，光鏡下對照組魚的肝臟肝板結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，肝細胞質(zhì)均勻，細胞核呈規(guī)則圓形，位于細胞中央，肝血竇形態(tài)正常，分布于肝細胞之間(圖1A)。高溫17 ℃組，隨著脅迫時間的延長，肝臟表現(xiàn)出不同程度及形式的損傷，與對照組相比，在脅迫1 h時，肝細胞結(jié)構(gòu)比較清晰，未見其他明顯變化(圖1B)；在脅迫6 h時，肝臟基本結(jié)構(gòu)無明顯異常，胞核呈圓球形，位于細胞中央，但有極少量的肝細胞核萎縮變形(圖1C)；在脅迫12 h時，少量肝細胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，肝細胞核萎縮程度加重，位于細胞邊緣，肝血竇間隙收縮(圖1D)；在脅迫24 h時，肝細胞形狀不規(guī)則，肝細胞核萎縮變性加劇，較多肝細胞空泡化，肝血竇不清晰(圖1E)；在脅迫48 h時，肝臟組織結(jié)構(gòu)進一步被破壞，細胞間界限雜亂模糊，大量肝細胞出現(xiàn)空泡化及細胞核萎縮，嚴重的甚至出現(xiàn)溶解(圖1F)。

A—肝臟(對照組)；B—肝臟(17 ℃高溫脅迫1 h)；C—肝臟(脅迫6 h)；D—肝臟(脅迫12 h)；E—肝臟(脅迫24 h)；F—肝臟(脅迫48 h)。VS—空泡；PN—核固縮；CV—中央靜脈；LC—肝細胞；BC—紅細胞；HS—肝血竇。A—liver (control group)；B—liver (17 ℃ temperature stress for 1 h)；C—liver (stress for 6 h)；D—liver (stress for 12 h)；E—liver (stress for 24 h)；F—liver (stress for 48 h).VS—cavitation；PN—nuclear condensation；CV—central vein；LC—hepatocytes；BC—red blood cell；HS—hepatic sinusoid.圖1 高溫脅迫下黑龍江茴魚的肝臟結(jié)構(gòu)(HE×400)Fig.1 Liver histological structure of Thymallus arcticus grubei under high temperature stress

2.2 測序數(shù)據(jù)組裝

對黑龍江茴魚幼魚肝臟組織的30個樣本進行測序，共獲得214.44 Gbp的clean data，過濾后各樣本中的有效數(shù)據(jù)量分布為6.82～7.50 Gbp。去除低質(zhì)量、冗余及接頭序列后，各樣本平均GC含量為49.45%，Q30堿基分布為93.48%～96.06%，說明測序質(zhì)量較好，可為后續(xù)的組裝提供可靠的原始數(shù)據(jù)(表2)。原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(PRJNA907151)。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.2 Summary of RAN-seq data

采用Trintiy軟件對clean reads進行組裝，共獲得的Unigenes總數(shù)目為106 347條 reads，N50長度為2 262 bp，序列平均長度為1 268.96 bp，最長序列為58 563 bp，最短序列為301 bp(表3)。

表3 轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果統(tǒng)計Tab.3 Statistics of transcript splicing results

利用bowtie 2將clean reads比對到Unigenes，總比對率為88.08%～89.94%，多位點比對率為29.94%～32.35%，單一位點比對率為56.94%～59.30%(表4)。這表明，拼接數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，可進一步進行注釋與富集分析。

表4 Reads與Unigenes比對結(jié)果統(tǒng)計Tab.4 Comparison results statistics of reads and Unigenes

2.3 轉(zhuǎn)錄組注釋

為獲得Unigenes全面信息，將全部Unigenes(106 347個)分別在7個公共數(shù)據(jù)庫中進行序列比對。從表5可見，在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(NR)被注釋的Unigene序列數(shù)最多，有59 039個，其次是GO、eggNOG和經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swissprot)，分別有36 876、46 437、41 177個Unigenes獲得功能注釋，Pfam和蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(KOG)分別有33 058和30 154個Unigenes被注釋，而KEGG數(shù)據(jù)庫被注釋的Unigenes序列數(shù)最少，只有15 077個。

表5 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Tab.5 Database annotation results

將拼接所得的 Unigene與NR蛋白數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，相似序列所占比例前5的物種分別有虹鱒、大西洋鮭(Salmosalar)、褐鱒(Salmotrutta)、鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)和銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)等，均為鮭科魚類(表6)。

表6 NR注釋top 10物種分布Fig.6 Top 10 species distribution in NR notes

2.4 差異基因的表達與聚類

使用DESeq對差異基因進行分析，以P<0.05且|log2(fold change)|>1作為閾值來篩選差異基因。結(jié)果顯示，隨脅迫時間的延長，差異基因的數(shù)量呈先升高后下降的趨勢，且在各時間段下調(diào)的差異基因(DEGs)數(shù)均多于上調(diào)的DEGs。在脅迫24 h時，差異基因數(shù)顯著高于其他4個時間點，差異基因數(shù)量為7 148個，包括3 653個上調(diào)基因與3 495個下調(diào)基因(圖2(d))；脅迫1 h時，有602個差異基因，包括180個上調(diào)基因與422個下調(diào)基因(圖2(a))；脅迫6 h時，有921個差異基因，包括206個上調(diào)基因與715個下調(diào)基因(圖2(b))；脅迫12 h時，有1 203個差異基因，包括399個上調(diào)基因與804個下調(diào)基因(圖2(c))；脅迫48 h時，有1 022個差異基因，包括321個上調(diào)基因與701個下調(diào)基因(圖2(e))。

圖2 差異基因火山圖Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes

為了驗證各處理組3個生物學(xué)重復(fù)DEGs的可靠性，對各處理組差異基因進行聚類熱圖分析。結(jié)果顯示，高溫組(H)和對照組(C)在不同高溫脅迫時間的差異基因分別聚類，同組樣本不同重復(fù)的表達相似(圖3)。

圖3 差異基因聚類圖Fig.3 Cluster map of differentially expressed genes

2.5 差異基因的GO富集

將DEGs比對到GO數(shù)據(jù)庫進行功能分類，結(jié)果顯示，隨著脅迫時間的延長，富集到GO數(shù)據(jù)庫的DEGs數(shù)呈先升高后下降的趨勢(圖4)，在脅迫24 h時DEGs數(shù)最多(2 786個)，其中935個基因上調(diào)，1 851個基因下調(diào)，且隨脅迫時間的延長，差異表達下調(diào)基因均多于上調(diào)基因(圖4(d))。在不同脅迫時間下，DEGs富集到GO三大類別(BP、CC和MF)中，其中生物過程(BP)的DEGs數(shù)量最多，主要由代謝過程、細胞過程、生物調(diào)控和單生物過程組成；富集在細胞成分(CC)的DEGs數(shù)量次之，主要由細胞膜、細胞組分和細胞器組成；富集在分子功能(MF)的基因數(shù)量最少，主要由催化活性和細胞結(jié)合組成(圖4)。

圖4 GO富集分析結(jié)果(前 30)Fig.4 Go enrichment analysis(top 30)

DEGs隨高溫脅迫時間的延長，在BP中，脅迫前期(1～6 h)糖酵解過程、絲氨酸合成甘氨酸過程、碳水化合物代謝過程和基因表達過程等顯著富集；脅迫中期(12～24 h)脂蛋白脂質(zhì)氧化和細胞合成過程顯著富集；脅迫后期(48 h)基因表達過程和糖酵解過程顯著富集。在CC中，脅迫前期吞噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及線粒體呼吸鏈復(fù)合物顯著富集；脅迫中期細胞外基質(zhì)和溶酶體腔顯著富集；脅迫后期核糖體和吞噬囊泡顯著富集。在MF中，脅迫前期ATP結(jié)合、連接酶活性、氨基酸結(jié)合及核糖體結(jié)構(gòu)成分顯著富集；脅迫中期肌球蛋白結(jié)合、肝素結(jié)合和絲氨酸酶活性顯著富集；脅迫后期ATP結(jié)合、核糖體結(jié)合和連接酶活性顯著富集(圖4)。

2.6 差異基因的KEGG通路富集

將DEGs比對到KEGG數(shù)據(jù)庫進行富集(P<0.05且q<0.05)，結(jié)果顯示，脅迫1 h時，差異基因共富集到170個通路中，其中，顯著富集的通路有37個，糖酵解/糖異生(ko00010)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(ko04141)及p53信號通路(ko04115)等通路顯著富集(圖5(a))；脅迫6 h時，差異基因共富集到264個通路，其中，顯著富集的通路有47個，糖酵解/糖異生(ko00010)、核糖體(ko03010)及吞噬體(ko04145)等通路顯著富集(圖5(b))；脅迫12 h時，差異基因共富集到253個通路，其中，顯著富集的通路有46個，糖酵解/糖異生(ko00010)、乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)及核糖體(ko03010)等通路顯著富集(圖5(c))；脅迫24 h時，差異基因共富集到329個通路，其中，顯著富集的通路有30個，蛋白質(zhì)消化吸收(ko04974)、ECM受體(ko04512)及吞噬體(ko04145)等通路顯著富集(圖5(d))；脅迫48 h時，差異基因共富集到238個通路，其中，顯著富集的通路有26個，乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝(ko00270)及糖酵解/糖異生(ko00010)等通路顯著富集(圖5(e))。

圖5 KEGG顯著富集結(jié)果(前 20)Fig.5 KEGG significant enrichment results(top 20)

DEGs在脅迫前期(1～6 h)，糖酵解/糖異生(ko00010)、乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)、果糖與甘露糖代謝(ko00051)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝(ko00270)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(ko04141)和核糖體(ko03010)等通路顯著富集；在脅迫中期(12～24 h)，蛋白質(zhì)消化吸收(ko04974)、ECM受體(ko04512)、抗原加工與呈遞(ko04612)、AMPK信號通路(ko04152)及乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)等通路顯著富集；在脅迫后期(48 h)，乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)、糖酵解/糖異生(ko00010)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝(ko00270)、PPAR信號通路(ko03320)和抗原加工與呈遞(ko04612)等通路顯著富集(圖5)。在急性高溫脅迫過程中，隨著脅迫時間的延長，差異基因主要在免疫應(yīng)激和能量代謝等調(diào)控過程中顯著富集。這表明，黑龍江茴魚幼魚肝臟組織產(chǎn)生了大量參與調(diào)控代謝和應(yīng)激等相關(guān)的活動過程。

2.7 RT-qPCR驗證

隨機選擇6個差異基因，利用RT-qPCR相對定量法檢測高溫組與對照組幼魚不同養(yǎng)殖時間下的差異基因表達情況。結(jié)果顯示，隨著養(yǎng)殖時間的延長，黑龍江茴魚幼魚的HSP70、HSP90a、DNAJA2及CASP9 mRNA表達水平總體上呈上調(diào)的趨勢，而GAPDH和MDH1的mRNA表達水平則呈下調(diào)的趨勢，其變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，表明測序結(jié)果可靠(圖6)。

圖6 qPCR檢測RNA-Seq結(jié)果Fig.6 Validation of RNA-Seq data using qPCR

3 討論

3.1 溫度脅迫對魚類肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟(或肝胰腺)是魚類進行物質(zhì)代謝和免疫防御的重要樞紐之一，在溫度脅迫過程中，肝臟對于機體減少或免受熱應(yīng)激的傷害具有極其重要的作用[16]。研究表明，高溫脅迫會引起魚類肝臟組織結(jié)構(gòu)變化，以及肝細胞空泡化、細胞核偏移和細胞溶解等，造成肝臟基本功能受損，進而導(dǎo)致機體代謝紊亂并損害健康[17]。周彥靜等[18]通過電鏡觀察虹鱒肝臟組織發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)高溫脅迫下肝臟出現(xiàn)淤血、肝竇不清晰、肝細胞水泡變性甚至溶解。張思敏等[19]對許氏平鲉(Sebastesschlegelii)高溫處理12 h后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高溫處理組肝細胞雜亂分布，肝細胞出現(xiàn)空泡化及細胞核萎縮，嚴重的甚至出現(xiàn)溶解，表明高溫導(dǎo)致魚類肝臟細胞受損。本研究中，高溫脅迫下黑龍江茴魚幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了明顯的病理損傷，在17 ℃高溫脅迫12～48 h時，其肝臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同程度的核萎縮變形及空泡化現(xiàn)象，且在脅迫48 h時部分肝細胞出現(xiàn)溶解，這與虹鱒和許氏平鲉在高溫脅迫下肝組織病變癥狀相似。這表明，在17 ℃急性高溫脅迫下，黑龍江茴魚幼魚肝臟組織在脅迫12 h時已經(jīng)受到微弱損傷，隨著脅迫時間的延長肝臟組織損傷持續(xù)加劇。

3.2 溫度脅迫對魚類應(yīng)激反應(yīng)的影響

維持蛋白質(zhì)的功能構(gòu)象對于機體抵抗各種環(huán)境應(yīng)激至關(guān)重要。魚類在急性高溫脅迫下機體細胞許多酶和蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)被破壞，使蛋白質(zhì)變性和錯誤折疊，形成對機體細胞有害的物質(zhì)[20]。分子伴侶在蛋白質(zhì)合成的折疊、組裝及對變性蛋白質(zhì)的修復(fù)和降解等過程中起著重要作用[21]。本試驗中，差異基因顯著富集在核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工及抗原加工與呈遞等蛋白質(zhì)合成與降解通路上。核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運及修飾的細胞器，抗原加工與呈遞是清除、降解變性蛋白質(zhì)的重要生理過程[22]。富集在以上通路中的差異基因主要為熱休克蛋白家族基因(HSPs)。

研究表明，HSPs在高溫脅迫下大量表達，以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和提高機體應(yīng)激耐受性。魏亞麗等[20]對高溫下尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)進行轉(zhuǎn)錄組分析時發(fā)現(xiàn)，參與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解過程的HSP70和HSP90表達顯著上調(diào)，進而維持細胞穩(wěn)態(tài)。對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白具有高度的調(diào)節(jié)作用，在急性熱脅迫下，HSP70和HSP90均顯著上調(diào)表達[10]。在短期急性高溫脅迫下，細鱗鮭肝臟中HSP70基因上調(diào)表達，隨脅迫時間的延長，因肝臟組織受損HSP70基因表達顯著下調(diào)[11]。張晨光等[23]研究證實，急性高溫脅迫下，翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)肝臟HSP70和HSP90基因相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢，分別于脅迫12 h和24 h時升至最高值，在脅迫后期由于肝臟氧化損傷較嚴重，引發(fā)免疫水平降低，從而引起基因表達顯著下調(diào)。本研究中，黑龍江茴魚幼魚在17 ℃溫度脅迫下，熱休克蛋白家族基因HSP40、HSP70和HSP90的mRNA均顯著上調(diào)表達，隨脅迫時間的延長，HSPs基因表達量呈先升高后下降的趨勢，并于脅迫24 h時達最高值，與上述研究結(jié)果一致。推測可能是因為熱休克蛋白對細胞的保護作用只能在一定時間范圍內(nèi)，在短期的急性高溫脅迫下，可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量HSPs蛋白提高機體耐受性，以應(yīng)對高溫脅迫對細胞的損傷；隨著脅迫時間的延長，機體內(nèi)平衡被打破，肝臟組織損傷程度加劇，使HSPs基因表達量顯著降低，合成的分子伴侶蛋白不足以修復(fù)損傷并維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，對肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，在脅迫48 h時損傷最嚴重，而在轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)差異基因數(shù)在脅迫24 h時最高，這可能與肝臟組織在脅迫24 h后損傷程度加劇有關(guān)。

3.3 溫度脅迫對魚類能量代謝的影響

溫度變化可能對魚類機體新陳代謝過程產(chǎn)生影響，在一定的溫度范圍內(nèi)，魚類需消耗更多的能量以抵抗溫度脅迫帶來的壓力[24]。對草魚(Ctenopharyngodonidella)在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫對精氨酸與脯氨酸代謝、脂肪酸代謝及糖酵解/糖異生等代謝過程有顯著影響[25]。對細鱗鮭在急性高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組研究也發(fā)現(xiàn)，與代謝過程相關(guān)的酶基因下調(diào)表達，進而抑制能量代謝過程[11]。許氏平鲉在急性高溫脅迫下，高溫組的MDH和NADH等代謝相關(guān)基因表達下調(diào)，糖代謝過程受抑[26]。紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)在熱脅迫下，富集在能量代謝途徑上的差異基因表達出現(xiàn)下調(diào)[27]。與上述研究結(jié)果一致，本研究中，表達下調(diào)的差異基因(MDH、GAPDH和GRHPR)主要富集在代謝途徑中的糖酵解/糖異生、果糖與甘露糖代謝、乙醛酸與二羧酸代謝及半胱氨酸與蛋氨酸代謝等代謝通路，表明在17 ℃高溫下，黑龍江茴魚幼魚機體能量代謝水平受阻。而尼羅羅非魚[20]和胡瓜魚(Osmerusmordax)[28]在高溫脅迫后，其代謝水平明顯上調(diào)，這可能是由于魚類種類的差異在受到溫度脅迫后存在不同的適應(yīng)機制。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，差異基因通過富集在代謝信號通路上，相互作用共同應(yīng)答高溫脅迫，如PPAR和AMPK信號通路。研究表明，PPAR信號通路與動物免疫和代謝有關(guān)，在脂質(zhì)氧化過程中具有重要作用[29]。對大黃魚(Larimichthyscrocea)在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，差異基因顯著富集到PPAR信號通路中，調(diào)控糖和脂肪代謝[30]。在高溫脅迫下，大口黑鱸(Micropterussalmoides)呼吸頻率加快，耗氧量增加，肝糖原或脂肪被大量氧化分解，從而造成肝細胞空泡化，甚至細胞核萎縮[31]。本試驗中，黑龍江茴魚幼魚在17 ℃高溫脅迫12 h后，表達上調(diào)的差異基因富集在AMPK和PPAR信號通路，此結(jié)果與對大黃魚和大口黑鱸的研究結(jié)果一致。推測此時機體能量可能處于比較低的水平，通過增加對脂肪酸的氧化分解來補充能量，進而維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這與本試驗中黑龍江茴魚幼魚肝臟細胞在脅迫12 h后出現(xiàn)不同程度的核萎縮變形及空泡化結(jié)果一致。

4 結(jié)論

1)在17 ℃高溫脅迫下，黑龍江茴魚幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)隨脅迫時間的延長損傷程度加劇，說明高溫脅迫能引起黑龍江茴魚幼魚肝臟組織受損。因此，在黑龍江茴魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)密切關(guān)注溫度的變化，降低高溫脅迫對魚體生理機能的影響。

2)黑龍江茴魚幼魚肝臟中響應(yīng)急性高溫脅迫的差異基因主要富集在能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)過程相關(guān)的通路上。