梁得福, 孟維洪, 許慶鵬, 舒 欣, 莊柯瑾,2, 張東杰,3,4

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1,大慶 163319) (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心2,大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室3,大慶 163319) (國家雜糧工程研究技術(shù)中心4,大慶 163319)

膳食營養(yǎng)是關乎機體健康的主要因素,眾多研究表明,膳食可影響機體的免疫功能[1]。膳食結(jié)構(gòu)有著多種組成,但膳食中的主要組成成分是一定的,膳食中一定要包含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等物質(zhì)[2]。機體的免疫調(diào)節(jié)與氨基酸的排列組成息息相關,且膳食中的蛋白質(zhì)也成為了免疫調(diào)節(jié)制劑的研究熱點[3]。膳食中蛋白來源主要分為3類,分別是動物源蛋白、植物源蛋白和海洋類蛋白[4]。動物源蛋白和植物源蛋白易獲取且價格低廉,動物源蛋白主要來源于乳類、肉類和蛋類,植物源蛋白主要來源于糧食作物[5]。糧食作物中蛋白質(zhì)含量較高的是大豆,大豆蛋白的活性功能甚多,如提高免疫力的作用[6]。動物源蛋白中乳液常被添加于膳食中,乳清蛋白是乳液中含量較多的一種蛋白質(zhì),乳清蛋白有益于可調(diào)節(jié)人體機體免疫等功能[7]。

大豆蛋白作為飼料飼喂金黃色葡萄球菌感染的老年小鼠后,可顯著提高機體的免疫球蛋白含量和降低體內(nèi)炎癥因子的濃度,因此大豆蛋白可提高機體的體液免疫功能[8]。劉明美等[9]將大豆蛋白采用灌胃的模式飼喂小鼠28 d,與未飼喂大豆蛋白的小鼠相比,白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和脾臟指數(shù)均顯著性提升,表明大豆蛋白可改善機體的免疫功能。Matsubara等[10]將水解后的乳清蛋白給予小鼠口服21 d,可緩解小鼠的過敏反應,提高了小鼠的免疫能力。在膳食中添加乳清也可有著不同的功效,Buey等[11]研究表明乳清蛋白可降低由脂多糖處理后腸上皮細胞中天然免疫系統(tǒng)TOLL樣受體和脂質(zhì)過氧化的水平,這表明乳清蛋白可以有助于降低機體的炎癥反應。Hellinga等[12]將乳清蛋白與人外周血單核細胞共孵育,結(jié)果表明,乳清蛋白可有助于增加對病原體的先天免疫應答。Kang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白可促進機體內(nèi)NK細胞的活力。Nielsen等[14]對剖腹產(chǎn)的仔豬補充乳清蛋白,可促進仔豬腸道、免疫力和大腦的發(fā)育。

任廣旭等[15]將大豆蛋白、乳清蛋白或雙蛋白在大鼠運動后干預蛋白攝取,鑒定血清中19 種必需氨基酸濃度的變化,結(jié)果表明雙蛋白可發(fā)揮2種蛋白的各自特性,并協(xié)同作用維持血液中氨基酸的穩(wěn)定性。Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白和大豆蛋白混合后給予患者食用可增加機體內(nèi)氨基酸的利用率。因此,大豆-乳清蛋白兩者混合食用后可協(xié)同作用于氨基酸的代謝,但是鮮有研究大豆-乳清蛋白對大鼠免疫功能的影響。實驗將標準飼料、乳清蛋白飼料、大豆蛋白飼料和大豆-乳清蛋白飼料連續(xù)飼喂SD大鼠60 d,通過測評SD大鼠的血清生化指標、免疫球蛋白的質(zhì)量濃度、脾淋巴細胞增殖指數(shù)、自然殺傷細胞活力、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的免疫學指標,評估膳食中添加大豆-乳清蛋白對SD大鼠免疫狀況的影響,從而明確大鼠膳食中添加大豆-乳清蛋白對大鼠免疫的調(diào)節(jié),為大鼠的膳食結(jié)構(gòu)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌性 Sprague Dawley(SD) 大鼠(3 周齡)32只,體重 50～70 g , 購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。實驗大鼠在溫度為(22±1)℃、相對濕度 50%～60%、光照晝夜12 h實驗環(huán)境下循環(huán)適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗,該動物實驗遵守動物保護道德準則和黑龍江八一農(nóng)墾大學動物飼養(yǎng)使用規(guī)則。標準飼料(AIN-93G,CP)、乳清蛋白飼料(Whey protein,WP)大豆蛋白飼料(Glycin max protein,GM)和大豆-乳清蛋白飼料(GM-WP)均委托南通特洛菲飼料科技有限公司制作。

大鼠免疫球蛋白 M(Immunoglobin M,IgM)、免疫球蛋白A(Immunoglobin A,IgA)、免疫球蛋白 G(Immunoglobin G,IgG)檢測試劑盒;生化指標 17 項:尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力(GPT)、總膽汁酸(TBA)、尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、肌酐(CRE)等測試盒。

小鼠淋巴瘤 YAC-1細胞、刀豆蛋白(concanavalin A , ConA)、臺盼藍、RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum , FBS)、CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測試劑盒、胰蛋白酶(比酶活力120 kU/g)。

1.2 儀器與設備

HF-90型 CO2細胞培養(yǎng)箱, Model 680 型酶標儀,DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋,熒光分光光度計,高壓滅菌鍋, HVD-1320潔凈工作臺。

1.3 方法

1.3.1 小鼠的分組與飼料的制備

SD大鼠32只,進行1周的適應性飼養(yǎng)后隨機分為4組,每組8只,每組大鼠按照飼喂標準飼喂不同組分的飼料,采取自由攝食的方式,實驗用標準飼料是美國營養(yǎng)學會的 AIN-93G 大鼠純合日糧標準飼料,WP 飼料、BSP 飼料和黑豆-乳清“雙蛋白”(BS-WP)飼料等氮等能,結(jié)合蛋白粉的營養(yǎng)水平,參照 AIN-93G 標準,飼料詳細配方及分組見表1,連續(xù)飼喂60 d。

表1 飼喂SD大鼠不同組分的飼料配方

1.3.2 血清生化指標和免疫球蛋白分析

對 SD 大鼠進行飼喂 60 d后,稱量體重,麻醉后,采取腹主動脈收集血液。血液樣品靜置 30 min 后,于 4 000 r/min 離心 10 min,按照 16 項生化指標及 IgM/IgA/IgG 試劑盒說明書分別檢測各項指標。

1.3.3 免疫器官指數(shù)的測定

各組大鼠收取血液后處死,分別取出脾臟和胸腺,使用濾紙去除剩余血液,將其置于無菌平皿中分別稱重并記錄,分別按照式(1)和式(2)計算脾臟和胸腺指數(shù)。

(1)

(2)

1.3.4 脾淋巴細胞增殖實驗

無菌條件下將各組 SD 大鼠剖腹,取出脾臟置于盛有 Hank’s 溶液中無菌培養(yǎng)皿中,使用眼科鑷將其剪碎。取無菌注射芯,對置于細胞篩網(wǎng)上的脾臟組織進行碾壓研磨,將制備的脾臟勻漿使用200目的細胞篩網(wǎng)進行過濾,加入 2 mL 的 Hank’s 液將細胞篩網(wǎng)中組織吹洗掉,將收集的脾臟組織懸浮液收集于離心管內(nèi),4 000 r/min 離心 5 min ,棄去上清液。加入 2 mL Hank’s 液重懸脾細胞,再加 3 倍體積的紅細胞裂解液混勻細胞,靜置 3 min,4 000 r/min離心5 min, 棄去上清液。加入5 mL的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液將沉淀重懸成單細胞懸液,吸取適量的細胞懸液與臺盼藍試劑混合計量細胞濃度,使活細胞比例大于95%,并調(diào)整細胞濃度為 2×105個/mL。

將調(diào)整濃度后的細胞懸液分別按照每孔 200 μL的體積接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板,然后每孔加入 20 μL 的 ConA(終質(zhì)量濃度為 5 μg/mL), 混勻每孔內(nèi)的細胞后,將其置于 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,再加入 21 μL 的 CCK-8 溶液,繼續(xù)放置于細胞培養(yǎng)箱中孵育 4 h ,然后取出置于酶標儀中,測定 450 nm 波長處的光密度值。以不添加脾細胞懸液的RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白孔,脾淋巴細胞增殖指數(shù)按照式(3)計算。

(3)

1.3.5 NK細胞活性分析

靶細胞制備:將穩(wěn)定傳代的靶細胞(YAC-1 細胞)培養(yǎng)至對數(shù)生長期,重懸靶細胞調(diào)整濃度為1×104個/mL。效應細胞制備:將 1.3.5 制備的脾細胞懸液調(diào)整濃度為 5×105個/mL。將靶細胞和脾細胞懸液分別吸取 50 μL/孔接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),混勻每孔內(nèi)的細胞,于細胞培養(yǎng)箱孵育24 h,然后每孔添加10 μL的 CCK-8 試劑,繼續(xù)孵育4 h, 取出置于酶標儀中測定450 nm波長處各孔的光密度值。自然殺傷細胞活力按照式(4)計算。

(4)

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆-乳清蛋白對大鼠血清生化指標的影響

由表2可知,CP、WP、GM組大鼠血清GLU、TC、TG、UA、CK-MB和AST的含量顯著高于GM-WP(P<0.05) , GM-WP組大鼠血清TP、GLOB 、ALB、GPT、HDL、LDL、TBA、LDH、TBIL和CRE含量顯著高于CP、WP、GM組(P<0.05), GM-WP組大鼠血清TP質(zhì)量分數(shù)比CP、WP、GM組分別增長了27.24%、21.00%和30.71%, ALB質(zhì)量分數(shù)分別增長了55.08%、29.56%、27.92%, GLOB質(zhì)量分數(shù)分別增長了23.44%、18.33%、29.54%, GPT質(zhì)量分數(shù)分別增長了116.03%、46.66%、60.80%, BUN質(zhì)量分數(shù)分別增長了46.39%、17.57%、9.85%。血清生化指標不僅反映動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,更能體現(xiàn)代謝能力,TP、ALB、GLOB、GPT、BUN在機體蛋白質(zhì)代謝良好時可升高[17],程璞等[18]將含有大豆蛋白的飼料飼喂給仔豬測定生化指標,結(jié)果表明大豆蛋白促進仔豬血清TP、ALB、GLOB、GPT、BUN含量的增加,促進了仔豬機體的免疫力。TC、TG、HDL、LDL與機內(nèi)的脂質(zhì)代謝相關,肖聰麗等[19]對構(gòu)建的高膽固醇HepG2細胞模型表明大豆蛋白可抑制細胞內(nèi)的 TC、TG、HDL、LDL的表達。實驗結(jié)果表明,攝食GM-WP可提高大鼠機體的免疫能力、蛋白質(zhì)代謝能力和肝臟的代謝能力。

表2 飼喂不同組分飼料對SD大鼠血清生化指標的影響

2.2 大豆-乳清蛋白對大鼠血清中免疫球蛋白分泌的影響

GM-WP對大鼠Ig水平的影響如圖1所示,WP、GM組Ig含量與 CP組相比,無顯著性差異,相較于其他組差異顯著,IgG質(zhì)量分數(shù)增加24.48%、21.84%、23.72%, IgA質(zhì)量分數(shù)增加了17.93%、13.13%、12.78%,IgM質(zhì)量分數(shù)增加了3.61%、5.45%、6.48% ,這可以看出GM-WP可促進大鼠免疫球蛋白的分泌,提高機體的免疫能力。Zhang等[20]將分離純化的小分子大豆蛋白治療由環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠,結(jié)果表明大豆蛋白可改善免疫抑制的小鼠血液中免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)水平,這一結(jié)果證實了大豆蛋白是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。Matsukawa等[21]將初乳乳清蛋白口服給山羊3周,研究表明,乳清蛋白可促進免疫球蛋白的分泌。雖有研究表明大豆蛋白或乳清蛋白可促進機體的免疫球蛋白的含量,但是本研究中,WP、GM和CP組無顯著性差異,這可能也是由于實驗中采用的是未分級的大豆蛋白[22],小分子的大豆蛋白更有利于機體的吸收和消化,乳清蛋白口服6周和12周時,與未服用的相比,乳清蛋白在口服12周顯著增加了患者體內(nèi)免疫球蛋白的含量,但是在第6周無變化[23]。GM-WP則可提升大鼠免疫球蛋白水平,是由于大豆與乳清蛋白可協(xié)同釋放氨基酸,也就是蛋白質(zhì)合成的基本單位。

注:相同字母無顯著性,不同字母顯著性差異(P<0.05)。

2.3 大豆-乳清蛋白對大鼠免疫器官指數(shù)的影響

圖2為GM-WP對大鼠免疫器官指數(shù)的影響,由圖2可知,GM-WP組顯著性高于CP、WP和GM組,且WP顯著高于CP和GM組(P<0.05),而CP和GM組無顯著性差異,其中GM-WP組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比CP組顯著性提高67.99%和99.22%,比WP組顯著性提高34.41%和30.66%,比GM組提高72.47%和76.56% .這表明WP和GM-WP均可提高大鼠免疫力,且GM-WP提高大鼠免疫力更為顯著。Takeda等[24]將含有乳清蛋白的人造乳飼喂仔鼠14 d ,仔鼠的脾臟和胸腺指數(shù)均顯著高于對照組,且對仔鼠的脾臟細胞進行蛋白質(zhì)組學分析表明哺乳含有WP的仔鼠脾臟中肽含量相對豐度更高。富校軼等[25]將超濾后的大豆蛋白以不同劑量飼喂小鼠,但大豆蛋白對仔鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無顯著性差異。這也進一步解釋了實驗中只有WP和GM-WP提高了大鼠脾臟和胸腺指數(shù),而GM對大鼠免疫器官無影響。武小亮等[26]將大豆分離蛋白和乳清蛋白混合后干預移植造血干細胞的小鼠,雙蛋白干預的小鼠脾臟和胸腺指數(shù)增加,且能更快地重新建立小鼠的免疫功能,表明了雙蛋白比單一蛋白更有利于機體免疫。

注:相同字母無顯著性,不同字母顯著性差異(P<0.05)。

2.4 大豆-乳清蛋白對大鼠脾淋巴細胞增殖和NK細胞活力的影響

飼喂GM-WP能顯著促進大鼠脾淋巴細胞增殖和NK細胞活力,脾淋巴細胞增殖指數(shù)見圖3a, GM-WP組的脾臟淋巴細胞增殖比CP組上升60.67%、比WP組上升39.71%,比GM組上升16.71%,差異顯著(P<0.05),且GM顯著高于WP組(P<0.05),WP組顯著高于CP組。NK細胞活力結(jié)果如圖3b所示, GM-WP組的NK細胞活力較于CP、WP和GM組提高了17.50%、30.56%、6.77%,差異顯著(P<0.05),但CP、WP和GM組無顯著性差異。Yimit等[27]通過測定食用大豆蛋白的志愿者大腦血流量和血液中的淋巴細胞,明確了大豆蛋白可促進機體內(nèi)淋巴細胞數(shù)量的增加。Kiewiet 等[28]的研究表明乳清蛋白口服后通過流式細胞術(shù)檢測脾臟中的淋巴細胞數(shù)量,乳清蛋白可促進脾臟中的淋巴細胞數(shù)增加。研究結(jié)果表明,WP、GM和GM-WP組均可促進脾臟淋巴細胞數(shù)量的增加。而CP、WP和GM組大鼠的NK細胞活力無顯著性差異,食用乳清蛋白后的1 h以內(nèi)可增強機體的單核細胞和多形核細胞的吞噬活性增強,NK細胞的活性降低,但在食用的1 h以后可增加NK細胞的活性,從而明確了食用乳清可促進機體免疫細胞的活性[29]。盧連華等[30]將低、中、高3個劑量的大豆蛋白腹腔注射大鼠,只有高劑量組顯著性增加了大鼠NK細胞活性。這也解釋了本實驗中乳清蛋白和大豆蛋白組大鼠的NK細胞活力無顯著性增加。

注:相同字母無顯著性,不同字母顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

實驗通過配比膳食中不同來源的蛋白,經(jīng)過60 d飼喂SD大鼠,膳食中蛋白源為GM-WP時,可改善大鼠的血清生化指標,提高免疫球蛋白的分泌,提高免疫器官指數(shù),增強脾淋巴細胞和NK細胞的活力,因此,GM-WP可提高大鼠的免疫能力。