尹 鵬, 楊蕓蕓, 趙一凡, 杜 穩(wěn), 李 秋, 彭君建, 劉虎軍

(國家糧食和物資儲備局科學研究院1,北京 100037) (中國計量大學2,杭州 310018) (山東魯花集團有限公司3,萊陽 265200) (江蘇豐尚油脂工程技術有限公司4,揚州 225000)

霉菌在自然界中種類繁多,分布廣泛,是導致糧食、飼料霉腐變質(zhì)的主要因子[1]。真菌毒素是部分霉菌生長過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝物。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計,全球每年有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素污染[2],由此引起農(nóng)產(chǎn)品和飼料的損失達數(shù)百億美元,其中我國是世界上受真菌毒素污染最嚴重的國家之一,每年真菌毒素污染造成的糧油損失數(shù)量較大,經(jīng)濟損失達數(shù)百億美元[3],給糧食安全與人類健康帶來嚴重威脅。因此,研發(fā)包括阻控畜禽中毒的微生態(tài)制劑等在內(nèi)的真菌毒素防控技術和材料具有十分重要的現(xiàn)實意義[4,5]。

微生態(tài)制劑主要由乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、放線菌等幾大類微生物組合而成[6],經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、后加工等工藝制成的生物制劑或活菌制劑。釀酒酵母具有改善畜禽消化道菌群平衡、增強機體免疫力、提供豐富的營養(yǎng)物、無毒、無副作用等大量優(yōu)點,農(nóng)業(yè)部公告第2038號規(guī)定了釀酒酵母及其水解物均可作為發(fā)酵飼料原料,釀酒酵母可作為飼料添加劑。釀酒酵母屬于一種單細胞微生物,其特點是耐酸性較強,屬于兼性厭氧型真菌,含有大量核酸、蛋白質(zhì)和豐富的風味物質(zhì),經(jīng)發(fā)酵、水解、干燥等工藝可獲得酵母提取物、酵母培養(yǎng)物以及酵母水解物等酵母類微生態(tài)制劑。酵母水解物可減少或者替代抗生素在斷奶仔豬飼糧中的使用,這為研發(fā)無抗飼料提供了有力的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持[7]。釀酒酵母水解后,細胞壁中的甘露低聚糖、葡聚糖等成分充分暴露,能夠與真菌毒素有效結合,有效阻止被體內(nèi)吸收。Yiannikouris等[8]研究表明酵母細胞壁可以有效減少大鼠體內(nèi)對AFB1的吸收。朱榮華[9]發(fā)現(xiàn)酵母來源細胞壁的酯化葡甘露聚糖可以有效地吸附玉米赤霉烯酮類真菌毒素。加之酵母水解物在改善牲畜胃腸道菌群平衡和動物飼料適口性、增強禽畜免疫力、無毒可再生、不會造成環(huán)境污染和抗藥性等方面的優(yōu)勢[10],因此酵母水解物對真菌毒素的阻控方面具有重要的應用潛力[11]。

培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件以及各因素之間的交互作用是微生物生長的關鍵,因此在規(guī)?；a(chǎn)之前需要對各個因素進行探索和優(yōu)化。目前針對培養(yǎng)基的優(yōu)化主要采用單因素、正交設計、響應面優(yōu)化等方法[12-15]。但是發(fā)酵過程中各營養(yǎng)成分之間具有復雜非線性,傳統(tǒng)的方法在處理非線性問題時具有一定的局限性。而人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法( Artificial Neural Network,ANN)具備學習能力、自適應能力和自組織能力,通過構建數(shù)學模型并不斷調(diào)整內(nèi)部大部分節(jié)點間互相連接關系表現(xiàn)出一些技能特性,在信號處理、自動控制、模式識別和預測分析方面解決了許多其他機器系統(tǒng)很難處理的問題,能夠反映復雜的非線性關系,具備全局預測能力,BP 算法是神經(jīng)網(wǎng)絡模型中最常用的一種算法[16-18]。

研究以實驗室前期篩選得到的一株性能優(yōu)良的釀酒酵母菌株(ASAG-39)作為出發(fā)菌株,通過單因素實驗對發(fā)酵過程中需要的碳源、氮源以及無機鹽的種類、添加量進行初步篩選,進一步建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡深度學習模型,遺傳算法進行全局尋優(yōu)得到最佳的碳源、氮源以及無機鹽的添加量,預測釀酒酵母發(fā)酵的最大OD600,通過實驗驗證模型的可靠性。同時,研究了釀酒酵母水解物對部分真菌毒素的吸附效果,從而為下一步研發(fā)酵母水解物在真菌毒素阻控方面的新材料和技術提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

釀酒酵母(ASAG-39)由國家糧食和物資儲備局科學研究院實驗室篩選保藏。

酵母粉、蛋白酶:生物試劑;蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米將干粉、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、檸檬酸、玉米赤霉烯酮標準品(Zearalenone,ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品(Deoxynivalenol,DON)、黃曲霉毒素B1標準品(黃曲霉毒素B1,AFB1):分析純;甲醇、乙腈:色譜純。

固體培養(yǎng)基:葡萄糖質(zhì)量分數(shù)2.0%、酵母粉質(zhì)量分數(shù)1.0%、蛋白胨質(zhì)量分數(shù)2.0%、瓊脂質(zhì)量分數(shù)2.0%,115 ℃滅菌質(zhì)量分數(shù)20 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖質(zhì)量分數(shù)2.0%、酵母粉質(zhì)量分數(shù)1.0%、蛋白胨質(zhì)量分數(shù)2.0%,115 ℃滅菌20 min。

初始(發(fā)酵)培養(yǎng)基:葡萄糖質(zhì)量分數(shù)2.0%、酵母粉質(zhì)量分數(shù)1.0%,調(diào)節(jié)初始pH 6.0,115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HPS-400生化培養(yǎng)箱,ISF1-X恒溫搖床,eppendorf 5424R臺式高速離心機,UZ-2450紫外-可見分光光度計,Waters 2495高效液相色譜,熒光檢測器,紫外檢測器,C1810 nm, 5 μm, 4.6 mm×150 mm色譜柱。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

取凍存的釀酒酵母ASAG-39在固體培養(yǎng)基活化,30 ℃條件培養(yǎng)40～72 h。取單一菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基30 ℃、210 r/min培養(yǎng)12 h后,5%的接種量轉(zhuǎn)接至初始培養(yǎng)基中,按照控制變量法依次確定最佳發(fā)酵時間、初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速。

1.3.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

單因素實驗:在已確定的發(fā)酵條件的基礎上,改變單一因素,分別對碳源、氮源及無機鹽種類及添加量進行優(yōu)化。

多因素實驗:在單因素實驗的基礎上,利用軟件Design-expert 8.0.6設計中心組合,測定發(fā)酵結束后發(fā)酵液的OD600。建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型,基于實驗數(shù)據(jù)訓練模型,使其能夠較精確地預測實際值(實驗值),優(yōu)化好的網(wǎng)絡與遺傳算法結合進行尋優(yōu)最佳配方。

1.3.3 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型和遺傳算法

采用反向傳播法建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN)模型,整個模型包括3個層次:輸入層、隱含層、輸出層?；谲浖﨑esign-expert 8.0.6設計中心組合,經(jīng)過實驗獲得的30組數(shù)據(jù)為樣本,randperm函數(shù)打亂數(shù)據(jù)增加數(shù)據(jù)的隨機性,mapminmax函數(shù)歸一化、反歸一化數(shù)據(jù),newff構建初始網(wǎng)絡net,train函數(shù)對神經(jīng)網(wǎng)絡net的數(shù)據(jù)進行訓練。error和R2反映模型的可靠性。

error=abs(output_prediction-output_test)./output_test;R2=(N×sum(output_prediction.×output_test)-sum(output_prediction)× sum(output_test))^2/((N×sum(output_prediction).^2)-(sum(output_prediction)^2)×(N×sum(output_test).^2)-(sum(output_test)^2))。式中:error為相對誤差;R2為擬合系數(shù);output_prediction為模型預測輸出數(shù)據(jù);output_test為實驗數(shù)據(jù);N為訓練數(shù)據(jù)的組數(shù);sum為求和函數(shù)。

將擬合效果較好(R2>0.99,error<0.05)的模型進行下一步遺傳算法尋優(yōu)。遺傳算法是可直接對結構對象進行相關操作,不存在求導和函數(shù)連續(xù)性的限定,具有全局尋優(yōu)的優(yōu)勢。綜合考慮精度、收斂速度以及計算規(guī)模等,將每代染色體種群設為50,在求出所有染色體適應度值之后,通過輪盤選擇法對種群進行選擇,最大迭代次數(shù)100次,采用單點交叉和單點變異,交叉概率為0.5,變異概率為0.08。在此基礎上反歸一化輸出最優(yōu)值以及相應的個體。

1.3.4 OD600測定

菌體OD600的測定:取2 mL的發(fā)酵液于2 mL的離心管中,12 000 r/min離心5 min棄去上清液,用去離子水洗滌菌體2～3次,適當稀釋后用可見-紫外分光光度計測定吸光度OD600。

1.3.5 釀酒酵母水解物制備和體外毒素吸附實驗

釀酒酵母的水解方法[19]:取一定量的干酵母于80～95 ℃水浴,熱激30 s。以酵母干物質(zhì)的質(zhì)量計,加入質(zhì)量分數(shù)1‰～5‰的檸檬酸,在45～55 ℃,200 r/min磁力攪拌反應6～12 h,使其自溶。以酵母干物質(zhì)的質(zhì)量計,添加質(zhì)量分數(shù)1‰～5‰的復合酶,調(diào)節(jié)pH 5～7,在55～65 ℃,200 r/min磁力攪拌使其酶解6～12 h,將其進行冷凍干燥備用。

酵母水解物對毒素吸附:取毒素標品加去離子水制得質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL的ZEN和DON溶以及5 μg/mL的AFB1溶液,pH調(diào)整為7.0,添加不同濃度的酵母水解物,37 ℃吸附2 h,反應結束后在轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min,取上清液1 mL過濾膜,液相色譜檢測其中的毒素含量。

1.3.6 ZEN 、DON、AFB1的檢測[20,21]

ZEN的檢測方法及條件:

流動相:體積分數(shù)50%水,體積分數(shù)50%乙腈;流量:1 mL/min;檢測器:熒光檢測器,激發(fā)波長274 nm,發(fā)射波長440 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

DON的檢測方法及條件:

流動相:體積分數(shù)80%水,體積分數(shù)20%甲醇;流量:1 mL/min;檢測器:紫外檢測器,218 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

AFB1的檢測方法及條件:

流動相:體積分數(shù)50%水,體積分數(shù)50%甲醇;流量:0.8 mL/min;檢測器:熒光檢測器,柱后光化學衍生化,激發(fā)波長360 nm,發(fā)射波長440 nm;柱子溫度:40 ℃;進樣量:10 μL。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

對培養(yǎng)基進行優(yōu)化之前首先進行發(fā)酵條件的選擇,以OD600為測試指標,分別對發(fā)酵時間、pH、溫度以及搖床轉(zhuǎn)速進行優(yōu)化。結果表明最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵時間36 h,發(fā)酵溫度30 ℃,pH 6.0,搖床轉(zhuǎn)速210 r/min,在此基礎上進行培養(yǎng)基單因素優(yōu)化。

2.2 單因素優(yōu)化酵母培養(yǎng)基

碳源不僅為細胞內(nèi)分解代謝提供小分子的碳鏈骨架,同時為細胞代謝提供生命活動所需要的能量。在初始培養(yǎng)基的基礎上,研究了單糖、二糖以及多糖淀粉的添加量對釀酒酵母生物量的影響,通過設置不同濃度的碳源,將最適添加量匯總(表1)。實驗表明,最適合用蔗糖作為釀酒酵母的碳源,當蔗糖、酵母粉、蛋白胨質(zhì)量濃度分別17.5、1.0、2.0 g/100 mL時,OD600值最大為25.8。

表1 不同碳源對酵母生長的影響

氮源是微生物生長過程中蛋白質(zhì)等合成的原料,適當?shù)牡茨軌虼龠M微生物的生長,對該株釀酒酵母培養(yǎng)過程的氮源進行了研究,通過設置不同濃度的氮源,將最適添加量匯總(表2)。實驗表明,酵母粉較蛋白胨更加適合作為氮源,當蔗糖、酵母粉質(zhì)量濃度分別為17.5、10.0 g/100 mL時,OD600值最大為28.92。

表2 不同氮源對酵母生長的影響

無機鹽不僅能夠為微生物的生長提供所需要的微量元素,而且是微生物合成代謝過程中很多酶反應過程的激酶。KH2PO4、MgSO4在酵母生長過程中,均是代謝過程中重要的激酶[17]。因此,對該株釀酒酵母培養(yǎng)基中無機鹽的組分進行優(yōu)化,通過設置不同濃度的無機鹽,將最適添加量匯總(表3)。實驗表明,當蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4質(zhì)量濃度分別為17.5、10.0、0.1、0.6 g/100 mL時,OD600值最大為32.78。

表3 不同無機鹽對酵母生長的影響

2.3 多因素優(yōu)化酵母培養(yǎng)基

微生物發(fā)酵培養(yǎng)基多因素的優(yōu)化一般采用正交實驗、響應面優(yōu)化等方法[6-9]。但由于發(fā)酵過程中各營養(yǎng)成分之間對酵母生長代謝具有高度非線性,即各營養(yǎng)成分在微生物的生化代謝和生長過程中非常復雜,不是簡單的線性影響,因此傳統(tǒng)的正交、響應面方法在處理高度非線性問題方面具有一定的局限性。而BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡能夠反映復雜的非線性關系,具備深度學習和廣泛預測能力,結合遺傳算法可以更加精確推斷最佳培養(yǎng)基配方。模型運行的本質(zhì)是先利用樣本數(shù)據(jù)建立起神經(jīng)網(wǎng)絡模型,然后施加輸入,通過模型運算得到預測結果。

2.3.1 中心組合實驗設計

以提高釀酒酵母的生物量為目標,根據(jù)單因素實驗確定蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4的4個因子,借助Design-expert 8.0.6軟件進行實驗組數(shù)為30的中心組合實驗設計,分別取值培養(yǎng)基組分蔗糖質(zhì)量濃度12.5、15.0、17.5、20.0、22.5 g/100 mL,酵母粉質(zhì)量濃度5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/100 mL,KH2PO4質(zhì)量濃度0、1、2、3、4 g/L,MgSO4質(zhì)量濃度2、4、6、8、10 g/L(表4),按照設計的培養(yǎng)基組成進行實驗,實驗結果匯總見表5。

表4 中心組合設計各因素取值范圍

表5 不同培養(yǎng)基組分的生物量

2.3.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型的建立與遺傳算法優(yōu)化

實驗選擇的BP神經(jīng)網(wǎng)絡的拓撲結構輸入層數(shù)-隱藏層數(shù)-輸出層數(shù)為4-5-1建立初始網(wǎng)絡模型,隨機打亂數(shù)據(jù)之后,選擇前20組數(shù)據(jù)來訓練網(wǎng)絡模型,另外10組數(shù)據(jù)用來驗證模型的可靠性,其中設置參數(shù)學習效率0.1,迭代次數(shù)1 000次。通過20組數(shù)據(jù)訓練模型見圖1a,預測值與實驗值(真實值)之間的相對誤差在5%之內(nèi)。其余10組數(shù)據(jù)對模型進行驗證見圖1b,其預測值與真實值之間的相對誤差5%以內(nèi),且模型運行輸出的擬合系數(shù)R2為0.997,模型可以較好的模擬實驗值,表明該網(wǎng)絡能夠較好模擬培養(yǎng)基組分與生物量之間的關系。

圖1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡學習和預測能力

2.3.3 遺傳算法尋找最優(yōu)解

在模型可靠的基礎上,遺傳算法尋優(yōu)結果見圖2,經(jīng)過運行能夠看出當?shù)?2次左右就能夠達到收斂,此時最佳配方蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4質(zhì)量濃度分別為18.90、8.90、0.05、0.80 g/100 mL,此時生物量OD600能達到38.9。通過實驗進行驗證,按此配方經(jīng)過種子培養(yǎng)、發(fā)酵,測得發(fā)酵液生物量OD600為37.1,偏差為4.6%,在相對誤差5%的范圍內(nèi),與單因素(表3)最大生物量OD60032.78相比增加了13.2%。

圖2 遺傳算法適應度曲線

2.4 酵母水解物對真菌毒素的體外吸附研究

酵母經(jīng)自溶、酶解等處理可以獲得水解物,酵母水解物是一種營養(yǎng)價值高、誘食性強的綠色飼料添加劑,具有良好的促生長、增強免疫、抗氧化、保護腸道等生物活性功能[22]。其中,酵母水解物所含有的細胞壁多糖,能夠與毒素、病毒等病原結合,增強其免疫原性[23]。將該株釀酒酵母經(jīng)水解獲得酵母水解物,在體外研究其對真菌毒素的吸附效果。結果(見圖3)表明,當酵母水解物的質(zhì)量濃度是4、4、8 mg/mL,單位水解物對ZEN、DON和AFB1的削減量達到最大,分別615.4、46.0、434.6 μg/g,該酵母水解物對真菌毒素ZEN和AFB1吸附效果較好。

圖3 酵母水解物對3種毒素的吸附效果

3 結論

對一株釀酒酵母進行了發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,通過模擬腸道內(nèi)中性的水環(huán)境,對其水解物進行了幾種真菌毒素的吸附研究,水解物對ZEN和AFB1吸附性能良好。通過單因素實驗、中心組合實驗設以及人工智能手段,優(yōu)化得到最佳的培養(yǎng)基配方:蔗糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4質(zhì)量濃度分別為18.90、8.90、0.05、0.80 g/100 mL,預測的OD600為38.9,經(jīng)驗證與該配方下實際OD600的37.1偏差4.6%,提高了13.2%,驗證了模型的可靠性。為微生物發(fā)酵過程培養(yǎng)基的精準優(yōu)化提供了一種可靠方法。

酵母細胞壁多糖或改性的細胞壁多糖對部分真菌毒素具有良好吸附效果,酵母水解物是經(jīng)自溶和酶解之后不做進一步的質(zhì)壁分離,直接進行干燥獲得的產(chǎn)品。該物質(zhì)既具備良好的細胞質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì),也具備細胞壁的活性功能。因此,探索釀酒酵母水解物對真菌毒素的體外吸附模擬,該酵母水解物對ZEN和AFB1最大吸附量分別為615.4、434.6 μg/g。

下一步可以繼續(xù)優(yōu)化水解物的吸附性能并開展該株酵母水解物的動物實驗,包括對實驗動物生長性能的影響、對腸道菌群的影響以及對免疫器官的影響,以期獲得該株酵母水解物能夠應用的數(shù)據(jù)參考。