唐莉莉 朱正權(quán) 楊群英 夏海成

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)顱內(nèi)惡性腫瘤,根據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示,腦膠質(zhì)瘤在我國(guó)年發(fā)生率為(5～8)/10萬(wàn),年病死人數(shù)高達(dá)3萬(wàn),5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌,并且呈逐年上升的趨勢(shì)。目前腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療是以最大范圍安全切除腫瘤為主,結(jié)合放療、化療等綜合治療,但其中惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)采用標(biāo)準(zhǔn)治療的5年生存率僅9.8%。影響腦膠質(zhì)瘤綜合治療效果的一個(gè)最重要因素就在于血-腦脊液屏障(blood-brain barrier,BBB),BBB對(duì)抗腫瘤藥物進(jìn)入腦腫瘤組織的限制,使得腦膠質(zhì)瘤的綜合治療效果難以突破。

超聲微泡技術(shù)是一種無(wú)創(chuàng)、靶向、暫時(shí)的增強(qiáng)超聲聚焦區(qū)域BBB對(duì)藥物滲透性的技術(shù),可以快速提高腦實(shí)質(zhì)中的血藥濃度。微泡是一種超聲造影劑,常用于臨床提高超聲圖像分辨力。在超聲波的作用下微泡可發(fā)生空化效應(yīng),增加BBB的通透性,增強(qiáng)藥物遞送效率。同時(shí),微泡也具有良好的搭載能力,大量研究顯示,利用超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB之后,載藥微泡可以在特定位置釋放化學(xué)藥物、基因片段、抗體,甚至可以向腦內(nèi)遞送干細(xì)胞[1～3]。

一、BBB與血-腫瘤屏障

BBB主要由內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接、基膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突構(gòu)成,是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與循環(huán)系統(tǒng)之間的生理屏障。正常情況下,BBB僅允許相對(duì)分子質(zhì)量小于(400～500)kDa、高脂溶性、無(wú)毒性、帶正電的部分小分子物質(zhì)通過(guò),BBB的存在對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和防止血液循環(huán)中有毒有害物質(zhì)的侵入發(fā)揮著重要的作用。在腦膠質(zhì)瘤中,BBB被腫瘤細(xì)胞破壞,其中侵入的膠質(zhì)瘤細(xì)胞代替腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮著類(lèi)似的屏障功能,產(chǎn)生的新脈管系統(tǒng)被稱(chēng)之為血-腫瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)。腦膠質(zhì)瘤的BTB與正常的BBB存在許多不同之處。BTB由高度增殖、形態(tài)異常的腫瘤毛細(xì)血管形成,這些腫瘤血管可能具有跨細(xì)胞蛋白的異常表達(dá)。此外,血管周?chē)煞秩缒[瘤血管上的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突發(fā)生改變,這些異常改變?yōu)檫x擇性開(kāi)放腫瘤中的BTB而不影響正常BBB提供了靶點(diǎn)[4]。

在GBM中,大多數(shù)血管周細(xì)胞是由膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs)分化而來(lái),這些GSCs衍生的周細(xì)胞具有腫瘤特異性基因改變,可將其與正常周細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)[5]。在原位GBM模型中,利用伊布替尼靶向干預(yù)GSCs來(lái)源的周細(xì)胞,可有效破壞BTB的緊密連接,增加血管通透性,并且伊布替尼與BTB穿透性差的藥物協(xié)同作用,可以提高GBM患者的化療效果[6]。

雖然BTB的滲透性高于BBB,但腦膠質(zhì)瘤BTB的異質(zhì)性和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍然可以限制藥物向腦組織滲透[7]。如何開(kāi)放BBB,提高腦膠質(zhì)瘤腫瘤組織中的血藥濃度成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。目前已有多種增強(qiáng)BBB滲透性的方法,例如:高滲溶液、緩激肽受體、藥物脂化修飾、經(jīng)細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散途徑、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)結(jié)合盒外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)流增強(qiáng)遞送、直接向顱腔內(nèi)注射或鼻腔給藥、新型納米顆粒輔助轉(zhuǎn)運(yùn)等,但這些方法均有其使用的局限性并沒(méi)有在臨床上廣泛應(yīng)用[8]。與開(kāi)放BBB的方法比較,超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB具有靶向、暫時(shí)、可逆、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)勢(shì),在增加腦膠質(zhì)瘤BBB滲透性方面具有良好的應(yīng)用前景。

二、超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB的機(jī)制

近年來(lái),超聲微泡技術(shù)對(duì)BBB通透性影響的機(jī)制研究顯示,空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)是所有類(lèi)型超聲增強(qiáng)BBB通透性的基礎(chǔ)機(jī)制。微泡的存在可降低超聲開(kāi)放BBB所需的能量,縮短超聲輻照時(shí)間,降低超聲引起組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)將眾多文獻(xiàn)闡述的機(jī)制總結(jié)如下。

1.空化效應(yīng):當(dāng)一定聲壓的超聲波作用于液體時(shí),液體中微泡空化核發(fā)生振蕩、膨脹、收縮和塌陷,在毛細(xì)血管壁上產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致BBB緊密連接變寬,實(shí)現(xiàn)BBB的開(kāi)放,此時(shí)血管的通透性明顯增加,允許高達(dá)2000kDa的物質(zhì)進(jìn)入大腦微環(huán)境內(nèi)[9,10]?？栈?yīng)包括穩(wěn)定空化和慣性空化。在0.3～3.0W·cm2的低強(qiáng)度超聲作用下,微泡進(jìn)行穩(wěn)定的振蕩,稱(chēng)之為穩(wěn)定空化,這是目前被大多數(shù)研究者認(rèn)為開(kāi)放BBB的主要機(jī)制之一;在>3.0W·cm2強(qiáng)度的超聲作用下,微泡劇烈膨脹、崩塌、破裂,稱(chēng)為慣性空化[11]。慣性空化的微泡突然破裂,在周?chē)后w中產(chǎn)生強(qiáng)烈的微流和微射流,可導(dǎo)致腦組織出血,神經(jīng)元損傷,甚至壞死[12]。在使用超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB時(shí),應(yīng)選擇低強(qiáng)度聚焦超聲(focused ultrasound,FUS),避免慣性空化的發(fā)生。

2.機(jī)械效應(yīng):在微泡活化產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)作用下,BBB的內(nèi)皮細(xì)胞上的機(jī)械敏感性離子通道活化,生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活,周?chē)?xì)胞發(fā)生一系列變化,包括形態(tài)改變、通透性暫時(shí)增加和溶解等,這些效應(yīng)可進(jìn)一步增強(qiáng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收,但同時(shí)也可引起細(xì)胞膜穿孔及紅細(xì)胞外滲等[13]。

3.促進(jìn)內(nèi)吞:內(nèi)皮細(xì)胞小窩(caveolae)是細(xì)胞質(zhì)膜表面的囊狀結(jié)構(gòu),主要介導(dǎo)物質(zhì)跨膜的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),維持BBB的通透性。小窩蛋白(caveolin-1)是BBB血管內(nèi)皮細(xì)胞上caveolae的主要標(biāo)志蛋白。鄧金木等[14]研究發(fā)現(xiàn), FUS微泡技術(shù)可通過(guò)顯著上調(diào)小鼠caveolin-1的表達(dá)水平和caveolae的數(shù)量,來(lái)增強(qiáng)caveolae介導(dǎo)的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)。Pandit等[15]研究也得出了類(lèi)似的結(jié)論,并發(fā)現(xiàn)FUS聯(lián)合微泡作用后,野生小鼠組500kDa的葡聚糖滲漏量較caveolin-1敲除小鼠組增加了3.5倍,但兩組均未觀(guān)察到2000kDa葡聚糖的滲漏,說(shuō)明FUS聯(lián)合微泡可促進(jìn)caveolae對(duì)大分子物質(zhì)的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn),但轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的分子量是有限制的。這種caveolae介導(dǎo)的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可能與其他轉(zhuǎn)運(yùn)途徑協(xié)同誘導(dǎo)BBB的開(kāi)放。

4．抑制外排、減少耐藥作用:P-糖蛋白(permeability-glycoprotein,P-gp),是ATP結(jié)合盒超家族編碼的一類(lèi)跨膜蛋白,是BBB上的最重要的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一,可主動(dòng)將大部分藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出腦組織,減少神經(jīng)毒性物質(zhì)的蓄積,也是BBB上的主要耐藥蛋白之一[16]。該蛋白在BTB和腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上過(guò)度表達(dá),和其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白聯(lián)合作用可導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種治療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。FUS微泡技術(shù)通過(guò)激活c-Jun氨基末端蛋白激酶信號(hào)通路選擇性抑制P-gp轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié),并確定0.5MPa是抑制P-gp表達(dá)且無(wú)組織和血管損傷的最佳FUS參數(shù)[17]。

5.影響細(xì)胞旁途徑:細(xì)胞旁途徑指開(kāi)放相鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接。緊密連接蛋白-5(claudin-5)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden 1,ZO1)是緊密連接的關(guān)鍵性蛋白,在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)。在FUS微泡技術(shù)作用BBB后,claudin-5、ZO1的表達(dá)顯著下降,同時(shí)已表達(dá)的claudin-5不再沿內(nèi)皮細(xì)胞膜聚集,但是24h后觀(guān)察到這些蛋白表達(dá)和移位恢復(fù)正常,說(shuō)明超聲微泡技術(shù)開(kāi)放細(xì)胞旁途徑是可逆的[14]。

三、超聲聯(lián)合微泡技術(shù)開(kāi)放BBB的安全性評(píng)估

2001年,Hynynen等[18]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),靜脈造影劑聯(lián)合頻率為1.63MHz的FUS可無(wú)創(chuàng)、靶向開(kāi)放BBB,在6.3MPa的超聲壓力下兔腦組織可出現(xiàn)血管壁損傷、組織壞死、缺血和細(xì)胞凋亡。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降低聲壓可顯著降低上述不良反應(yīng)。該項(xiàng)研究成果為后續(xù)研究者進(jìn)行大量FUS聯(lián)合微泡開(kāi)放BBB輸送藥物入腦的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。根據(jù)超聲強(qiáng)度高低,FUS分為高強(qiáng)度FUS和低強(qiáng)度FUS。高強(qiáng)度FUS可開(kāi)放BBB,但其明顯的熱效應(yīng)可致組織凝固性壞死[19]。低強(qiáng)度FUS的吸收系數(shù)小,組織損傷輕,熱效應(yīng)不明顯。因此,低強(qiáng)度FUS聯(lián)合微泡技術(shù)能更安全、有效地開(kāi)放BBB。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,低強(qiáng)度FUS聯(lián)合微泡技術(shù)開(kāi)放BBB具有良好的安全性和可逆性,但從理論上推測(cè),不排除BBB過(guò)度開(kāi)放導(dǎo)致并發(fā)癥的可能,如出血、血管源性腦水腫、占位效應(yīng)、神經(jīng)功能缺損、甘露醇等脫水劑外滲導(dǎo)致脫水治療的反跳現(xiàn)象等。

2016年,Carpentier等[20]給予GBM患者運(yùn)用植入型脈沖超聲系統(tǒng)(SonoCloud?)聯(lián)合微泡技術(shù)將卡鉑遞送入腦腫瘤組織,當(dāng)聲壓為1.1MPa時(shí),未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng),在人體試驗(yàn)中證實(shí)了植入型超聲聯(lián)合微泡開(kāi)放BBB具有良好安全性和耐受性。2019年,Mehta等[21]采用磁共振引導(dǎo)聚焦超聲(MR-guided focused ultrasound,MRgFUS)聯(lián)合微泡技術(shù)治療阿爾茨海默病患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT03671889)中,入組的3例患者成功完成了FUS誘導(dǎo)海馬和內(nèi)嗅皮層BBB開(kāi)放,顱腦磁共振(contrast-enhanced magnetic resonance imaging,MRI)上即見(jiàn)周?chē)o脈區(qū)域強(qiáng)化,24h后該強(qiáng)化區(qū)域逐漸消退,期間未觀(guān)察到顱內(nèi)出血和其他不良反應(yīng)。這些研究表明,超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB雖然存在紅細(xì)胞外滲、組織損傷的不良反應(yīng),但通過(guò)控制超聲和微泡參數(shù)在一定范圍內(nèi),這些不良反應(yīng)可以顯著降低甚至規(guī)避。通過(guò)多次復(fù)查MRI證明,這些不良反應(yīng)只存在于BBB開(kāi)放的早期以及靶向區(qū)域。同時(shí),在人體研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺失,證明超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB是安全的。為了安全起見(jiàn),在將FUS確定為常規(guī)臨床程序之前,應(yīng)通過(guò)MRI對(duì)其使用過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

四、超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB在腦膠質(zhì)瘤中應(yīng)用

1.超聲聯(lián)合微泡在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療中的研究:臨床前研究的結(jié)果顯示,通過(guò)超聲微泡技術(shù)開(kāi)放腦膠質(zhì)瘤的BBB產(chǎn)生了良好的藥物遞送效果。Dréan等[22]將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于靜脈輸送卡鉑進(jìn)入GBM荷瘤小鼠模型,發(fā)現(xiàn)卡鉑聯(lián)合FUS微泡技術(shù)可增加腦內(nèi)卡鉑滲透性4.2倍,無(wú)明顯神經(jīng)或全身毒性,提高了小鼠的生存期并顯著延緩腫瘤生長(zhǎng)速度。Wei等[23]利用FUS聯(lián)合微泡靜脈輸送依托泊苷使腦腫瘤組織中依托泊苷濃度增加了8倍,腫瘤體積增長(zhǎng)降低了約45%,中位生存率增加了約30%。Zhang等[24]在膠質(zhì)瘤模型中研究利用低強(qiáng)度脈沖超聲聯(lián)合微泡靜脈遞送兩種不同劑型的紫杉醇,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種制劑的紫杉醇在腦組織中的血藥濃度分別提高了3倍、5倍。Ye等[25]將FUS微泡技術(shù)應(yīng)用于GL261的膠質(zhì)瘤模型,通過(guò)鼻內(nèi)給藥的方式,成功將抗程序性細(xì)胞死亡配體1抗體(anti- programmed cell death-ligand 1 antibody,aPD-L1)輸送入小鼠腦組織內(nèi),并且發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)鼻內(nèi)給藥比較,aPD-L1蓄積量增加3.74倍。

臨床研究也證明超聲微泡技術(shù)開(kāi)放BBB后能夠提高腦膠質(zhì)瘤患者腦實(shí)質(zhì)血藥濃度,增強(qiáng)化療療效,延長(zhǎng)生存時(shí)間,且具有良好的安全性。2019年,Idbaih等[26]發(fā)表的一項(xiàng)顱內(nèi)低強(qiáng)度脈沖超聲裝置(sonocloud-1)聯(lián)合靜脈微泡和卡鉑治療復(fù)發(fā)GBM患者的單中心試驗(yàn)結(jié)果表明,MRI顯示BBB無(wú)破壞或破壞不良(n=8)患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)為2.73個(gè)月,中位總生存期(overall survival,OS)為8.64個(gè)月。BBB明顯開(kāi)放患者(n=11)的PFS中位數(shù)為4.11個(gè)月,OS中位數(shù)為12.94個(gè)月,生存期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且未觀(guān)察到卡鉑相關(guān)神經(jīng)毒性表現(xiàn)。超聲微泡技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究已經(jīng)從開(kāi)放BBB到現(xiàn)在輸送各種藥物入腦組織,相對(duì)分子質(zhì)量也從低分子藥物發(fā)展到高分子藥物(如紫杉醇的相對(duì)分子質(zhì)量為853kDa)甚至抗體。

2.超聲聯(lián)合微泡在腦膠質(zhì)瘤熒光引導(dǎo)手術(shù)中的研究:腦膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),與周?chē)ＤX組織分界不清,手術(shù)切除范圍難以確定。應(yīng)用熒光素鈉(Sodium fluorescein, SF)在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中顯影可以幫助確定腫瘤邊界,在最大范圍保全神經(jīng)功能的前提下,最大范圍切除腫瘤。但在彌漫性星形膠質(zhì)瘤中SF無(wú)法顯影,手術(shù)中難以確認(rèn)腫瘤邊界,容易造成腫瘤切除不足、殘留過(guò)多或擴(kuò)大切除后影響神經(jīng)功能。

腫瘤切除程度與患者預(yù)后有著密切關(guān)系,早期、廣泛切除可延緩彌漫性星形膠質(zhì)瘤的腫瘤進(jìn)展和惡變的時(shí)間。因此,亟需尋找一種能夠安全、有效增加彌漫性星形膠質(zhì)瘤BBB通透性的方法,讓熒光顯影劑能夠進(jìn)入其腫瘤組織中,幫助確定腫瘤邊界。Anastasiadis等[27]給予4例彌漫性膠質(zhì)瘤患者應(yīng)用FUS微泡技術(shù)治療后,在MRI上觀(guān)察到在手術(shù)計(jì)劃切除的區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)新的信號(hào)增強(qiáng)區(qū)域,注射SF后,可以清楚地看到與新的信號(hào)增強(qiáng)區(qū)域一致的黃色熒光信號(hào),與未經(jīng)處理的非增強(qiáng)腫瘤組織比較,FUS微泡技術(shù)處理區(qū)域SF積累量增加了2.2倍(P<0.01),說(shuō)明SF可以在FUS微泡技術(shù)的作用下輔助彌漫性膠質(zhì)瘤術(shù)中顯影,但該研究并未證明新出現(xiàn)的對(duì)比增強(qiáng)區(qū)域開(kāi)放的是BBB還是BTB。診斷超聲在微泡的作用下也可增加BBB的通透性,促進(jìn)BBB對(duì)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。

在一項(xiàng)回顧性研究中,利用SF聯(lián)合超聲造影進(jìn)行手術(shù)的7例低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中,有2例術(shù)中顯影為黃色,5例為粉色,該研究中超聲造影所需的造影劑即為微泡,說(shuō)明在診斷超聲和微泡的作用下,熒光素鈉可進(jìn)入低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織并有助于手術(shù)邊界顯影。由于該研究未提及對(duì)診斷超聲和微泡參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié),可能將微泡爆破時(shí)對(duì)腦組織產(chǎn)生損傷,而且該研究的低級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本數(shù)量少,未能證明診斷超聲聯(lián)合微泡增強(qiáng)通透性的是BBB還是BTB,但給今后該技術(shù)用于開(kāi)放低級(jí)別彌漫性膠質(zhì)瘤的BBB或BTB的研究提供了參考。今后仍需開(kāi)展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)證明該技術(shù)的有效性和安全性。

綜上所述,超聲微泡技術(shù)能夠無(wú)創(chuàng)、靶向、重復(fù)開(kāi)放BBB,能夠?qū)⑺幬锇邢蜻f送至腦組織,在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療方面具有廣泛運(yùn)用前景。由于目前超聲微泡技術(shù)的數(shù)據(jù)多來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),人類(lèi)顱骨對(duì)超聲波的衰減作用,以及動(dòng)物模型與人類(lèi)的生理結(jié)構(gòu)的不同,目前超聲微泡技術(shù)應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的臨床治療最佳參數(shù)尚不明確,還需進(jìn)行更多的大規(guī)模臨床試驗(yàn)予以進(jìn)一步證實(shí)。此外,是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)超聲和微泡參數(shù)靶向開(kāi)放BTB,從而增強(qiáng)SF在彌漫性低級(jí)別膠質(zhì)瘤的術(shù)中腫瘤邊界顯影效果或者增強(qiáng)術(shù)后化療時(shí)腦組織中的血藥濃度,還有待于深入研究。