米澤威 楊會(huì)江 徐 婕

臨床上治療腫瘤常以綜合治療為原則,常用的腫瘤治療方法包括手術(shù)、化療、放療等。然而,常規(guī)的治療方法并未有效提高腫瘤患者的生存期,腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因,因此,尋找腫瘤的新型治療方法是亟待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。近年來(lái),免疫療法已成為多種惡性腫瘤的潛在治療方法,這為腫瘤的治療打開(kāi)了新的思路。其中,過(guò)繼性細(xì)胞療法是腫瘤免疫療法中耀眼的新星,在推進(jìn)免疫療法的進(jìn)展中做出了不可磨滅的貢獻(xiàn),尤其是嵌合抗元受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor engineered T cells,CAR-T)療法。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(recombinant receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)是一個(gè)被公認(rèn)的非常有潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。基于此,本文將對(duì)ROR1 CAR-T療法在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展做一綜述,以期更全面地評(píng)估ROR1 CAR-T療法的實(shí)際療效,為ROR1 CAR-T的改善設(shè)計(jì)提供參考依據(jù),進(jìn)一步推動(dòng)ROR1 CAR-T療法的臨床應(yīng)用。

一、ROR1靶點(diǎn)的引入

過(guò)繼性細(xì)胞療法是指將人體內(nèi)有抗腫瘤活性的細(xì)胞分離出來(lái),在體外對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)、修飾、培養(yǎng),再回輸給患者,達(dá)到抗腫瘤目的的免疫療法。其中CAR-T療法在血液腫瘤治療中表現(xiàn)驚艷,成為領(lǐng)域內(nèi)唯一被FDA批準(zhǔn)上市的細(xì)胞產(chǎn)品[1]。隨后,越來(lái)越多的過(guò)繼性細(xì)胞療法向?qū)嶓w瘤發(fā)起沖擊。近年來(lái),已有多個(gè)CAR-T治療項(xiàng)目成功應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肉瘤、肺癌、胃癌等實(shí)體腫瘤的治療[2～6]。大量文獻(xiàn)報(bào)道,ROR1在多種腫瘤組織中特異性高水平表達(dá),在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá);同時(shí),ROR1在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥、抑制細(xì)胞凋亡等方面都發(fā)揮著重要作用,已逐漸成為腫瘤治療藥物靶標(biāo)[7,8]。近年來(lái),美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)兩款新藥用于治療ROR1+的惡性腫瘤,分別是生物制藥公司Precigen的自體CAR-T療法結(jié)合PD-1阻斷劑而成的PRGN-3007以及JUNO Therapeutics研發(fā)的一款自體ROR1 CAR-T療法JCAR024,目前后者已處于臨床一期研究階段。

ROR1是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體家族成員之一,屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶家族。ROR1含有兩種亞型,分別是完整的細(xì)胞膜受體型和截短型變異體,后者又主要分為無(wú)胞外結(jié)構(gòu)的膜結(jié)合型ROR1和只含胞外結(jié)構(gòu)的可溶型ROR1。由于可溶型ROR1在血清中的表達(dá)量很低或檢測(cè)不到,且與疾病進(jìn)展無(wú)關(guān),因此筆者默認(rèn)研究的是完整結(jié)構(gòu)的膜結(jié)合型ROR1。ROR1編碼基因共2814bp,位于染色體1p31.3,ROR1膜蛋白由937個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量約為105 kDa。人源ROR1由一個(gè)胞外的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig)、兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(FZD)、近膜kringle結(jié)構(gòu)域、單次跨膜結(jié)構(gòu)以及一個(gè)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(TKD)、兩個(gè)絲/蘇氨酸富集結(jié)構(gòu)域(S/TRD)和一個(gè)脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域(PRD)組成[9]。ROR1在生物種間高度保守,人與鼠的ROR1氨基酸序列同源性可達(dá)97%。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),ROR1在脂肪組織、胰腺、肺、少量B前體細(xì)胞中低表達(dá),在其他正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá),而在多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá),如慢性淋巴細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞白血病、邊緣區(qū)淋巴瘤等血液腫瘤以及肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、三陰性乳腺癌等實(shí)體腫瘤[10]。雖然腫瘤治療中理想的治療靶點(diǎn)是僅在腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen,TSA),但目前發(fā)現(xiàn)的幾乎所有靶點(diǎn)均是腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen,TAA),ROR1便是屬于TAA類(lèi)。即便如此,越來(lái)越多的研究顯示,ROR1 CAR-T療法在多種腫瘤治療中都取得了理想療效。ROR1 CAR-T療法首先需要收集患者的外周血并提取T淋巴細(xì)胞,將T淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行刺激擴(kuò)增并通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)入特定的CAR基因,構(gòu)建成靶向特異性的CAR-T(如靶向ROR1+的ROR1 CAR-T),再將質(zhì)檢合格的CAR-T在體外擴(kuò)增至合適數(shù)量后回輸給患者,在患者體內(nèi)行使其被設(shè)定的腫瘤殺傷作用[11]?，F(xiàn)階段,靶向ROR1的免疫療法已成為腫瘤治療的新發(fā)展趨勢(shì)。

二、ROR1 CAR-T療法在多種腫瘤中的研究進(jìn)展

鑒于ROR1在多種腫瘤組織中特異性高水平表達(dá),是癌癥的潛在治療靶點(diǎn),ROR1 CAR-T對(duì)ROR1+腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用和較高的安全性,現(xiàn)對(duì)ROR1 CAR-T療法在多種腫瘤中的研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)闡述[12]。

1.白血病:ROR1 CAR-T療法自開(kāi)發(fā)起最先便是用于治療血液腫瘤,如白血病等,并已取得了較為理想且成熟的臨床前實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]。早期,Hudecek等[14]在臨床試驗(yàn)中將特異性ROR1 CAR-T靶向ROR1+B型急性淋巴細(xì)胞白血病,產(chǎn)生了前所未有的抑癌效果。在此基礎(chǔ)上,利用靶向ROR1胞外Ig-like/FZD的mAb 2A2制備2A2 CAR-T,并截短其間隔域,獲得對(duì)ROR1+腫瘤的識(shí)別。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),利用靶向ROR1 Ig-like和FZD上的一個(gè)獨(dú)立表位的兔抗人ROR1 mAb R12制備R12 CAR-T,與2A2 CAR-T比較時(shí),展現(xiàn)出了更高的親和性[15];而且針對(duì)體內(nèi)ROR1+B細(xì)胞淋巴瘤和體外多種上皮性腫瘤都表現(xiàn)出了很好的反應(yīng)活性[16];隨后,通過(guò)改造與修飾R12 CAR-T的空間間隔,明顯地提升其對(duì)ROR1+腫瘤的識(shí)別及擴(kuò)大T淋巴細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[17]。此外,Thomas Kipps等[18]在發(fā)表于PNAS的研究中指出,癌基因ROR1僅在慢性淋巴細(xì)胞性白血病的B淋巴細(xì)胞中表達(dá),在正常組織中不表達(dá),該基因與其他原癌基因共同作用會(huì)加速小鼠的慢性淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)病進(jìn)程,并在動(dòng)物模型中成功證實(shí)ROR1 CAR-T療法對(duì)白血病的良好療效?，F(xiàn)階段由慢性淋巴細(xì)胞白血病的全球研究基金會(huì)聯(lián)盟牽頭開(kāi)展的ROR1 CAR-T療法應(yīng)用于白血病的治療已進(jìn)入臨床一期,社會(huì)多方都在熱切關(guān)注這項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)的實(shí)際療效。

2.三陰性乳腺癌:三陰性乳腺癌預(yù)后差、耐藥性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高,而治療手段又非常有限。近年來(lái),有研究者研發(fā)出新型CAR-T療法針對(duì)三陰性乳腺癌表現(xiàn)出前所未有的效果,有望打破三陰性乳腺癌的治療格局。陳玥等[12]利用構(gòu)建的ROR1 CAR-T,在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)針對(duì)陽(yáng)性靶細(xì)胞MDA-MB-231,在2∶1、4∶1、8∶1的效靶比條件下,CAR-T組中釋放的γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)均高于對(duì)照組。但CAR-T與陰性靶細(xì)胞共培養(yǎng)后,IFN-γ幾乎沒(méi)有釋放,即使在高效靶比(8∶1)時(shí)釋放量也很少,酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)也產(chǎn)生較少,證明ROR1 CAR-T對(duì)于ROR1陽(yáng)性的三陰性乳腺癌細(xì)胞具有特異性的殺傷作用,并且脫靶性的危險(xiǎn)較小。

西雅圖華盛頓大學(xué)Jennifer Specht博士團(tuán)隊(duì)則利用ROR1 CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了人體試驗(yàn),該研究納入了7例ROR1表達(dá)超過(guò)20%的三陰性乳腺癌患者。在接受5個(gè)劑量水平的ROR1 CAR-T療法過(guò)程中,并未出現(xiàn)明顯的劑量限制性毒性。只有1例患者出現(xiàn)了三級(jí)細(xì)胞因子釋放綜合征,經(jīng)地塞米松和托珠單抗治療后反應(yīng)迅速,沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)毒性或細(xì)胞因子釋放綜合征或腫瘤溶解綜合征或任何與ROR1表達(dá)相關(guān)的其他毒性。該研究的治療結(jié)果令人欣喜,經(jīng)ROR1 CAR-T療法后,患者生存期持續(xù)延長(zhǎng),2例患者病況穩(wěn)定,分別維持了15周和19周,其中1例患者在病況穩(wěn)定一段時(shí)間后又接受了第2次ROR1 CAR-T回輸,腫瘤明顯縮小。目前還沒(méi)有任何其他后續(xù)治療方案的療效超過(guò)ROR1 CAR-T療法。

3.肉瘤:患有轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性和(或)難治性肉瘤的患者通常預(yù)后較差,迫切需要新的有針對(duì)性的治療方法。研究顯示,ROR1在肉瘤細(xì)胞系(11/15)中有很高的表達(dá)率,這些肉瘤細(xì)胞系包括尤文肉瘤、骨肉瘤、肺泡或胚胎性橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤。Huang等[19]利用Sleeping Beauty系統(tǒng)將來(lái)源于8名志愿者的免疫細(xì)胞構(gòu)建ROR1 CAR-T,發(fā)現(xiàn)其對(duì)肉瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,并且以抗原特異性方式產(chǎn)生高水平的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-13(interleukin-13,IL - 13),而來(lái)源于3個(gè)肉瘤患者的ROR1 CAR T響應(yīng)肉瘤的刺激并釋放顯著量的IFN-γ。研究發(fā)現(xiàn),ROR1 CAR-T可顯著降低小鼠骨肉瘤模型中的腫瘤生長(zhǎng)率,延長(zhǎng)小鼠壽命,證實(shí)ROR1可作為利用Sleeping Beauty構(gòu)建的CAR-T有效靶點(diǎn),并且這種CAR-T有可能會(huì)在高危肉瘤患者的治療中起到重要作用。

Berger等[20]利用獼猴構(gòu)建的骨肉瘤靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型來(lái)評(píng)估ROR1 CAR-T的治療效果,結(jié)果顯示ROR1 CAR-T具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用,并且對(duì)低表達(dá)ROR1的B前體細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰腺和肺無(wú)毒性作用,具有良好的安全性,是骨肉瘤理想的免疫治療方法。此外,由于目前大多數(shù)CAR-T靶點(diǎn)都屬于TAA類(lèi),為避免“on-target off-tumor”毒性,Srivastava等[21]設(shè)計(jì)了一種邏輯門(mén)控ROR1 CAR-T。在改善后的設(shè)計(jì)中,CAR-T僅消除同時(shí)表達(dá)抗原A和B的腫瘤。針對(duì)抗原A合成的Notch受體可誘導(dǎo)針對(duì)特異性抗原B的CAR表達(dá),通過(guò)整合多種信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能,從而可以更精確地區(qū)分腫瘤組織和正常組織。這種新型設(shè)計(jì)的ROR1 CAR-T已被證明能夠很好地治療尤文肉瘤,此項(xiàng)目目前正在進(jìn)行臨床招募(NCT02706392),表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4.卵巢癌:卵巢癌作為一種早期較難檢測(cè)、晚期致死率高、復(fù)發(fā)性高的腫瘤,傳統(tǒng)的治療手段尚不能滿(mǎn)足目前的醫(yī)療需求,在婦科惡性腫瘤中,卵巢癌被稱(chēng)為“沉默殺手”。近年來(lái),CAR-T療法的問(wèn)世,讓人們看到了“治愈”的希望。在利用傳統(tǒng)CAR-T療法治療各種惡性腫瘤的同時(shí),科學(xué)家也在致力于通過(guò)前期基因工程技術(shù),多維度提高CAR-T療法的療效。來(lái)自Fred Hutchinson癌癥研究中心的科學(xué)家設(shè)計(jì)了一種生物相容性良好的多孔網(wǎng)狀鎳鈦薄膜,可高效裝載CAR-T,并能在植入部位觸發(fā)它們快速擴(kuò)增。研究者將ROR1 CAR-T置于膜的兩側(cè),使其被吸收到材料中,在應(yīng)用于卵巢癌小鼠臨床前模型時(shí),驚喜地發(fā)現(xiàn)此薄膜可準(zhǔn)確定位至腫瘤病灶上,并促進(jìn)嵌入的抗癌淋巴細(xì)胞快速擴(kuò)增,使得腫瘤組織中CAR-T密度比傳統(tǒng)的靜脈注射T淋巴細(xì)胞高232倍,能有效消除小鼠腫瘤、延長(zhǎng)生存期,并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,此金屬薄膜安全可靠,周?chē)慕M織或器官也沒(méi)有出現(xiàn)壞死[22]。新型改善技術(shù)的出現(xiàn),無(wú)疑讓CAR-T療法如虎添翼。

5.肺癌:肺癌是發(fā)生率和病死率增長(zhǎng)最快、對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,將CAR-T療法應(yīng)用于治療肺癌是諸多研究者的奮斗目標(biāo)。Wallstabe等[23]在研究中利用ROR1 CAR-T治療肺癌A549細(xì)胞系和肺癌三維模型,結(jié)果顯示ROR1 CAR-T具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。而Srivastava等[24]通過(guò)在KP鼠肺癌模型中引入ROR1基因,建立KP-ROR1鼠(高表達(dá)ROR1),系統(tǒng)研究CAR-T療法在肺癌治療中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROR1 CAR-T的浸潤(rùn)性較差并且存在功能性失調(diào)。于是他們進(jìn)行聯(lián)合療法的嘗試,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在注射奧沙利鉑和ROR1 CAR-T 1天后,再注射抗PD-L1抗體,可顯著提高ROR1 CAR-T在病灶處的富集,顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步將聯(lián)合療法用于臨床試驗(yàn),結(jié)果顯示,同時(shí)注射奧沙利鉑和ROR1 CAR-T的肺癌患者,T淋巴細(xì)胞水平顯著上升、巨噬細(xì)胞水平顯著下降,此趨勢(shì)在治療203天后仍舊顯著,表明奧沙利鉑的使用在臨床上可以有效提高T淋巴細(xì)胞在病灶處的富集。目前三聯(lián)療法的臨床應(yīng)用仍在進(jìn)行中,但現(xiàn)有結(jié)果已足以說(shuō)明,聯(lián)合療法可顯著增強(qiáng)ROR1 CAR-T療法的抗肺癌效果。

除上述已開(kāi)展的利用ROR1 CAR-T療法治療白血病、三陰性乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、肺癌之外,由于ROR1在肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等實(shí)體瘤中同樣特異性高表達(dá),因此將ROR1 CAR-T療法用于治療此類(lèi)癌癥將是今后持續(xù)探討的研究方向。

三、展 望

CAR-T療法是有別于包括抗體藥物、抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugate,ADC)、重組蛋白等在內(nèi)的傳統(tǒng)生物藥物的新型治療手段,具有“活的藥物”的特性,其治療深度和持續(xù)性是上述傳統(tǒng)生物藥物不具備的。ADC代表性藥物的緩解率為60%,未來(lái)可能需要聯(lián)合其他療法進(jìn)行治療;而CAR-T代表性藥物bb2121和LCAR-B38M的緩解率分別為94%和100%?？贵w介導(dǎo)的抗腫瘤藥物只能殺死細(xì)胞表面抗原高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞,而CAR-T可以有效殺死細(xì)胞表面抗原表達(dá)量較低的腫瘤細(xì)胞,反應(yīng)深度更深。此外,CAR-T在治療過(guò)程中會(huì)在患者體內(nèi)大量擴(kuò)增,相對(duì)傳統(tǒng)的生物藥物,具有起效快速、緩解率高和緩解時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。

與傳統(tǒng)的利用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性CAR靶向ROR1靶點(diǎn)不同的是,現(xiàn)階段針對(duì)ROR1 CAR-T技術(shù)的研究已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注如何通過(guò)改善CAR前期設(shè)計(jì)、多方法聯(lián)合應(yīng)用等提高ROR1 CAR-T的實(shí)際療效。比如邏輯門(mén)控ROR1 CAR-T技術(shù),它通過(guò)雙特異性靶標(biāo),精確CAR-T的靶向性,降低對(duì)正常低表達(dá)ROR1細(xì)胞的損傷性;又比如Fred Hutchinson癌癥研究中心研發(fā)的多孔網(wǎng)狀鎳鈦薄膜,利用該膜高效裝載CAR-T,使得腫瘤組織中CAR-T密度比傳統(tǒng)的靜脈注射法提高了232倍;再比如Stanley R. Riddell等嘗試的聯(lián)合療法,通過(guò)將ROR1 CAR-T與成熟的臨床藥物、經(jīng)典的腫瘤治療方法聯(lián)合,評(píng)估不同方法的實(shí)際療效,尋找ROR1 CAR-T療法的更高效使用方法。Cho等[25]設(shè)計(jì)的通用型CAR-T,通過(guò)在ScFv與穿膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域間插入一個(gè)可調(diào)控的亮氨酸,使得抗原結(jié)合區(qū)可以任意地更換成各種ScFv,提高了CAR-T療法的靈活性。目前關(guān)于ROR1 CAR-T療法在腫瘤免疫治療中的研究已進(jìn)入新的階段,不僅在治療的腫瘤類(lèi)型上更加豐富,在CAR-T技術(shù)的改善設(shè)計(jì)上也日漸完善,從而多方面推動(dòng)了ROR1 CAR-T療法的臨床應(yīng)用。

綜上所述,ROR1靶點(diǎn)是CAR-T療法中新的嘗試,致力于提供更強(qiáng)效、可耐受、易獲得的免疫療法,解決疾病標(biāo)準(zhǔn)療法無(wú)法應(yīng)對(duì)的復(fù)發(fā)及其他難治問(wèn)題,為患者的臨床治療帶來(lái)新的希望。