基于基因組survey 數(shù)據(jù)的疣吻沙蠶微衛(wèi)星特征分析及多態(tài)標(biāo)記開發(fā)

楊 尉，司圓圓，許瑞雯，陳興漢

陽(yáng)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 陽(yáng)江 529566

疣吻沙蠶 (Tylorrhynchusheterochaetus) 又名疵吻沙蠶，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門、多毛綱、葉須蟲目、沙蠶科，俗稱禾蟲、流蜞，在中國(guó)東南沿海河口地區(qū)的泥沙質(zhì)淺灘或稻田中廣泛分布[1-2]。作為一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的多毛類，其味道鮮美且營(yíng)養(yǎng)豐富，是中國(guó)廣東、廣西、福建、香港、澳門及東南亞各地獨(dú)具特色的水產(chǎn)品，素有“水中冬蟲夏草”之美譽(yù)[2-3]。更重要的是，疣吻沙蠶與水稻具有天然的共生關(guān)系，發(fā)展疣吻沙蠶稻田綜合種養(yǎng)模式可顯著增加水稻種植的經(jīng)濟(jì)效益[4]?！八?疣吻沙蠶”生態(tài)綜合種養(yǎng)技術(shù)正日趨成熟，自2021 年起連續(xù)3 年入選廣東省農(nóng)業(yè)主推技術(shù)，在助力鄉(xiāng)村振興、保障國(guó)家糧食安全等方面應(yīng)用潛力巨大。然而，疣吻沙蠶具有生境狹窄、種群地理隔離、群體恢復(fù)力低等物種特性，受棲息地破壞、過(guò)度捕撈、環(huán)境污染等因素的影響其自然種群呈逐年衰退的趨勢(shì)，在有些地區(qū)甚至已經(jīng)絕跡[4-5]。在突破疣吻沙蠶全人工繁殖技術(shù)的基礎(chǔ)上，近年已實(shí)現(xiàn)其苗種的規(guī)?；嘤鲳B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及技術(shù)的革新培育了大量的人工繁育群體，但因遺傳育種研究的滯后，疣吻沙蠶種質(zhì)開始出現(xiàn)生長(zhǎng)性能及抗逆性下降等退化現(xiàn)象[4]。為建立疣吻沙蠶資源管理策略并促進(jìn)其可持續(xù)開發(fā)利用，特別是避免常年的產(chǎn)業(yè)化增養(yǎng)殖引起遺傳結(jié)構(gòu)單一化，防止人工繁育群體污染自然種群，有必要采用分子手段科學(xué)地分析及評(píng)估其種質(zhì)現(xiàn)狀，揭示種群遺傳多樣性水平與遺傳結(jié)構(gòu)，并以此指導(dǎo)新品種的培育與遺傳改良研究。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)疣吻沙蠶的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、生活史、繁殖生物學(xué)、增養(yǎng)殖技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)與活性成分分析等方面[3,5]。Chen 等[5-6]完成了疣吻沙蠶線粒體基因組測(cè)序，并基于線粒體COI 序列分析了7 個(gè)地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)，除此之外，遺傳學(xué)相關(guān)的研究鮮有報(bào)道；分子遺傳信息的匱乏制約了疣吻沙蠶資源保護(hù)利用研究的深入開展。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、基因組覆蓋廣泛等優(yōu)點(diǎn)[7]，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，已廣泛應(yīng)用于譜系鑒定、親緣關(guān)系檢測(cè)、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位等領(lǐng)域[8]?；蚪Msurvey 是利用高通量測(cè)序技術(shù)實(shí)施小片段、低深度測(cè)序，然后基于Lander-Waterman 模型進(jìn)行k-mer 分析，并根據(jù)k-mer 頻率和深度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果評(píng)估物種基因組的大小與復(fù)雜程度等關(guān)鍵特征[9]?；蚪Msurvey 不僅能為全基因組測(cè)序及高質(zhì)量組裝提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)無(wú)參考基因組序列的物種而言，利用基因組survey 數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記是當(dāng)前最高效的策略之一，較傳統(tǒng)方法具有效率高、周期短、成本低的優(yōu)勢(shì)[9]?；蚪M微衛(wèi)星鑒定研究在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中已廣泛開展，篩選的標(biāo)記獲得了良好的遺傳分析效果。例如，張永德等[9]在卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 基因組survey 數(shù)據(jù)中檢測(cè)到190 121 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)并成功開發(fā)了多態(tài)分子標(biāo)記，為全基因組測(cè)序與組裝、漁業(yè)資源保護(hù)利用及良種選育奠定了基礎(chǔ)；上官清等[10]分析了斑鱧 (Channamaculata) 基因組微衛(wèi)星特征，并篩選到20 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)用于群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，為該物種的遺傳監(jiān)測(cè)、親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)資源養(yǎng)護(hù)及管理提供了技術(shù)支持。

本研究對(duì)疣吻沙蠶基因組進(jìn)行低深度高通量測(cè)序，通過(guò)k-mer 分析預(yù)測(cè)基因組大小、雜合度和重復(fù)比例等信息，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)初步組裝后搜索組裝序列中的微衛(wèi)星位點(diǎn)，分析其特征與分布規(guī)律，初步驗(yàn)證標(biāo)記的有效性和多態(tài)性，以期指導(dǎo)基因組精細(xì)圖譜的繪制，并為群體遺傳學(xué)研究提供可靠的標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

疣吻沙蠶采集自陽(yáng)江市廣東陽(yáng)海農(nóng)業(yè)技術(shù)發(fā)展有限公司疣吻沙蠶增養(yǎng)殖試驗(yàn)基地(111°55'23"E、21°49'16"N) 保種的越南海防群體。用于基因組測(cè)序的疣吻沙蠶幼體用適量無(wú)菌水洗滌3 次，解剖后剪取體壁肌肉組織裝入2 mL 凍存管，液氮速凍后置于-80 ℃保存。微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性驗(yàn)證群體的30 尾個(gè)體經(jīng)無(wú)菌水洗滌后，解剖剪取體壁肌肉組織，置于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇中在-20 ℃下保存。

1.2 基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

運(yùn)用苯酚-氯仿法提取疣吻沙蠶基因組DNA，經(jīng)1.0% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整度后，用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì) (ThermoFisher，美國(guó)) 檢測(cè)濃度和純度。利用Covaris 超聲波破碎儀將基因組DNA 片段化，篩選合適長(zhǎng)度的DNA片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、添加測(cè)序接頭、純化及PCR 擴(kuò)增等步驟建立350 bp 小片段文庫(kù)。測(cè)序文庫(kù)經(jīng)Qubit 2.0 (ThermoFisher，美國(guó)) 和Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent，美國(guó)) 檢測(cè)濃度和插入片段大小后，用Illumina HiseqTMX Ten 平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序?；蚪M測(cè)序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控和過(guò)濾后，用GCE 1.0.0[11]軟件對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行k-mer 分析。運(yùn)用SOAPdenovo 2.01[12]軟件，選擇k-mer=41 將有效數(shù)據(jù)組裝至contig 和scaffold 級(jí)別，并統(tǒng)計(jì)GC 含量和覆蓋深度等信息。

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)搜索與引物設(shè)計(jì)

使用MISA (Microsatellite identification tool) 軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)在長(zhǎng)度大于500 bp 的序列中搜索微衛(wèi)星位點(diǎn)。運(yùn)行參數(shù)為：重復(fù)基序長(zhǎng)度1～6 bp，單堿基重復(fù)次數(shù)≥12 次，二堿基重復(fù)次數(shù)≥6 次，三堿基、四堿基重復(fù)次數(shù)≥5 次，五堿基、六堿基重復(fù)次數(shù)≥4 次；將間隔區(qū)域長(zhǎng)度小于100 bp 的相鄰微衛(wèi)星歸為1 個(gè)復(fù)合型位點(diǎn)?；谖⑿l(wèi)星側(cè)翼序列，用Primer 5[13]批量設(shè)計(jì)引物，主要參數(shù)為：引物長(zhǎng)度18～27 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物100～300 bp，退火溫度(Tm) 55～65 ℃，GC 含量40%～60%，正、反向引物退火溫差≤5 ℃；盡量避免出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體、錯(cuò)配和引物二聚體；每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)生成3～5 對(duì)候選引物。隨機(jī)選取50 對(duì)微衛(wèi)星引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的驗(yàn)證與篩選

使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒從疣吻沙蠶體壁肌肉組織中提取基因組DNA。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，正、反向引物 (10 μmol·L-1) 各0.5 μL，DNA 模板(15 ng·μL-1) 1.0 μL，2×PCR Mix 10 μL，用超純水補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)由Bio-Rad My Cycler Thermal Cycler (Bio-Rad，美國(guó)) 完成，運(yùn)行程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物先進(jìn)行1.5% (w) 瓊脂糖凝膠電泳分析，參照預(yù)期片段大小篩選出有效擴(kuò)增引物。有效擴(kuò)增引物加熒光接頭后 (正向引物5'端添加FAM 熒光素)，在30 尾疣吻沙蠶個(gè)體的基因組DNA 中擴(kuò)增以驗(yàn)證其多態(tài)性。PCR 產(chǎn)物送至上海翼禾應(yīng)用生物技術(shù)有限公司用3730XL 測(cè)序分析儀 (Applied Biosystems，美國(guó)) 進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，使用GeneMapper 3.2 軟件 (Applied Biosystems，美國(guó)) 進(jìn)行基因分型。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016 軟件完成微衛(wèi)星位點(diǎn)分布特征信息的統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。微衛(wèi)星發(fā)生頻率=含微衛(wèi)星的序列總數(shù)/序列總數(shù)×100%；微衛(wèi)星出現(xiàn)頻率=微衛(wèi)星總數(shù)/序列總數(shù)×100%；微衛(wèi)星豐度(個(gè)·Mb-1)=微衛(wèi)星總數(shù)/序列總長(zhǎng)度[14]。用GenAlEx 6.5 軟件[15]計(jì)算等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度 (Ho)、期望雜合度 (He)、多態(tài)信息含量 (PIC)。用Genepop 在線軟件 (https://genepop.curtin.edu.au/) 檢驗(yàn)位點(diǎn)間的連鎖不平衡及群體的哈迪-溫伯格平衡 (Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，并用Bonferroni 法對(duì)顯著性閾值進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 疣吻沙蠶的基因組survey 測(cè)序

低深度高通量測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后共獲得57.48 Gb 有效數(shù)據(jù)，堿基錯(cuò)誤率為0.05%，Q20 和Q30 分別為95.56%和89.70%，表明基因組測(cè)序質(zhì)量較高 (表1)。對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行k-mer 分析(k=17)，結(jié)果顯示在深度為57 時(shí)出現(xiàn)主峰值(圖1)，總k-mer 為44 257 233 158，排除錯(cuò)誤k-mer的誤差影響后得到修正的基因組大小為759.53 Mb，雜合率為1.41%，重復(fù)序列比例為45.92%。選擇k-mer=41 將有效讀段初步組裝至contig 和scaffold 水平，最終獲得的contig 總長(zhǎng)度為821 637 022 bp，最大長(zhǎng)度為84 713 bp，N50 為548 bp；scaffold 總長(zhǎng)度為840 375 821 bp，最大長(zhǎng)度為89 326 bp，N50 為662 bp。

表1 疣吻沙蠶基因組 survey 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of genomic survey sequencing data of T.heterochaetus

圖1 疣吻沙蠶基因組 k-mer 種類頻率分布Fig.1 Frequency distribution of k-mer species in genome of T.heterochaetus

2.2 疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星位點(diǎn)特征

用MISA 軟件在109 881 條組裝序列中檢測(cè)到130 216 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，長(zhǎng)度共計(jì)2 341 179 bp；微衛(wèi)星發(fā)生頻率5.04%，出現(xiàn)頻率5.97%，分布豐度為154.9 個(gè)·Mb-1。疣吻沙蠶微衛(wèi)星位點(diǎn)以單堿基和二堿基重復(fù)最為豐富，分別有45 582 和42 298 條，各占35.00%和32.48%；其次是三堿基重復(fù) (18 782條)，占14.42%；六堿基數(shù)量最少，僅占2.44%(圖2)。微衛(wèi)星序列的重復(fù)數(shù)范圍為4～56 拷貝，主要集中在4～18 拷貝，重復(fù)19 次及以上的有3 703 條，僅占3.50%；單堿基重復(fù)以12～16 次最常見 (40 706條，89.30%)，二堿基重復(fù)集中在6～18 次 (42 035條，99.38%)，三堿基重復(fù)以5～12 次為主 (18 526條，98.64%)，四堿基重復(fù)以5～10 次為主 (12 173條，98.91%)，而五堿基和六堿基重復(fù)主要為4～8 次 (共11 176 條，99.37%) (圖2—圖3)。

圖2 疣吻沙蠶基因組 6 種類型微衛(wèi)星的數(shù)量與比例Fig.2 Number and proportion of six motif types of microsatellite loci in genome of T.heterochaetus

圖3 疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)分布特征Fig.3 Distribution pattern of microsatellite repeat number in genome of T.heterochaetus

疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星共包含320 種重復(fù)基序類型：?jiǎn)螇A基2 種、二堿基4 種、三堿基10 種、四堿基31 種、五堿基91 種、六堿基182 種。單堿基重復(fù)基序拷貝數(shù)集中在12～15 次，以C/G 為主，占比58.02%；二堿基重復(fù)拷貝數(shù)多為6～10 次，以AT/AT 最為豐富，占比62.38%，其次是AC/GT(27.37%)、AG/CT (10.22%)，而CG/CG 數(shù)量稀少(0.02%)；在三堿基重復(fù)中，拷貝數(shù)多為5～12 次，占比最高的是AAT/ATT，有6253 條 (33.29%)，其次是ATC/GAT (32.15%)，而CCG/CGG 數(shù)量最少，僅占0.06%；四堿基拷貝數(shù)多為5～8 次，優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序是AAAT/ATTT，有3567 條 (28.98%)，其次是AATC/GATT (14.08%)、ACTC/GAGT(9.60%)、ATCC/GGAT (7.38%)；五堿基、六堿基拷貝數(shù)集中在4～7 次，優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序分別是AAAAT/ATTTT (17.07%) 和AACCCT/AGGGTT (11.73%)(圖4)。

2.3 疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星位點(diǎn)長(zhǎng)度特征

根據(jù)重復(fù)序列長(zhǎng)度可將微衛(wèi)星位點(diǎn)分為兩類：一類是長(zhǎng)度達(dá)20 bp 及以上的高度多態(tài)I 型，另一類則是長(zhǎng)度介于12～19 bp 的中度多態(tài)II 型[16]。疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星位點(diǎn)的長(zhǎng)度分布區(qū)間為12～336 bp，I 型微衛(wèi)星位點(diǎn)有43 240 條，占33.21%，剩余的II 型位點(diǎn)占66.79%；絕大部分I 型微衛(wèi)星位點(diǎn)的長(zhǎng)度為20～39 bp，超過(guò)50 bp 的位點(diǎn)僅占0.51% (圖5-a)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在I 型微衛(wèi)星位點(diǎn)中，二、三、四、五堿基是最主要的重復(fù)類型，占85.92%，在后續(xù)多態(tài)標(biāo)記的篩選中有較高的開發(fā)價(jià)值(圖5-b)。

圖5 疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布特征注：a.不同長(zhǎng)度區(qū)間微衛(wèi)星數(shù)量及比例；b.不同類型微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布特征。Fig.5 Distribution pattern of length of microsatellite loci genome of T.heterochaetusNote: a.Number and percentage of microsatellite loci at different length intervals; b.Length distribution of the six motif types of microsatellite loci.

2.4 疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記驗(yàn)證篩選

使用Primer 5 成功對(duì)37 370 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)了引物。隨機(jī)選取50 個(gè)位點(diǎn)合成引物并進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，共獲得41 對(duì) (82%) 有效擴(kuò)增引物，表明MISA 軟件鑒定的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高有效性。多態(tài)性篩選結(jié)果顯示，15 個(gè) (30%) 微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物表現(xiàn)出穩(wěn)定且可重復(fù)的多態(tài)性 (表2，圖6)。在30 尾疣吻沙蠶中，15 對(duì)引物共檢測(cè)到87 個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)5.800，等位基因頻率為0.060～0.400，其中ThGM021 位點(diǎn)的等位基因數(shù)最少 (Na=2.000)，ThGM004 位點(diǎn)的等位基因數(shù)最多(Na=12.000)。Ne為1.164～6.713，平均值為3.328；Ho為0.050～0.879，平均值為0.487；He為0.141～0.789，平均值為0.561；PIC 為0.136～0.776，平均值為0.511 (表3)。在15 個(gè)位點(diǎn)中，8 個(gè)屬高度多態(tài)性位點(diǎn) (PIC＞0.5)，5 個(gè)屬中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25＜PIC≤0.5)，2 個(gè)屬低度多態(tài)性位點(diǎn) (PIC≤0.25)，表明該群體的遺傳多樣性較豐富。經(jīng)Bonferroni 校正后，有3 個(gè)位點(diǎn) (ThGM006、ThGM011、ThGM040) 偏離HWE，其中ThGM040 屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)。各位點(diǎn)間無(wú)連鎖不平衡現(xiàn)象。

表2 疣吻沙蠶 15 對(duì)多態(tài)微衛(wèi)星引物信息Table 2 Information of 15 polymorphic microsatellite loci in genome of T.heterochaetus

表3 15 個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)在疣吻沙蠶群體中的遺傳特征Table 3 Genetic characteristics of 15 polymorphic microsatellite loci in a T.heterochaetus population

圖6 部分多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的毛細(xì)管電泳分型結(jié)果Fig.6 A set of polymorphic microsatellite loci visualized by high-resolution capillary electrophoresis

3 討論

3.1 疣吻沙蠶基因組基本特征

不同物種間基因組的大小和復(fù)雜程度有明顯差異，會(huì)直接影響到測(cè)序策略的選擇及基因組的組裝效果。因此，進(jìn)行全基因組測(cè)序前須先評(píng)估物種基因組的基本特征。疣吻沙蠶基因組survey 測(cè)序及k-mer 分析估計(jì)其基因組為759.53 Mb，遠(yuǎn)大于水蛭 (Helobdellarobusta)[17]和寬體金線蛭 (WhitmaniaPigra)[18]等所有已報(bào)道的蛭綱物種，也較多毛綱的海蠕蟲 (Capitellateleta)[17]、歐文蟲 (Owenia fusiformis)[19]、巨型管蟲 (Riftiapachyptila)[20]、Lamellibrachialuymesi[21]的大；與寡毛綱通俗腔蚓(Metaphirevulgaris)[22]及多毛綱搓稚蟲 (Streblospio benedicti)[23]的大小 (約0.7 Gb) 相當(dāng)；但明顯小于安德愛勝蚓 (Eiseniaandrei)[24]、赤子愛勝蚓 (E.fetida)[25]，以及多毛綱的旋鰓蟲(Spirobranchuslamarcki)[26]和深海管蟲 (Paraescarpiaechinospica)[27](1.0～1.3 Gb)。物種間基因組大小的差異性在一定程度上與重復(fù)序列比例的高低有關(guān)。疣吻沙蠶基因組的重復(fù)序列比例 (45.92%) 低于旋鰓蟲[26]和深海管蟲[27]，但顯著高于海蠕蟲[17]、巨型管蟲[20]，以及所有已公布的蛭綱動(dòng)物 (重復(fù)比例均低于34%)[15-18]；其基因組雜合率 (1.41%) 與安德愛勝蚓[24]和赤子愛勝蚓[25]相當(dāng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于L.luymesi(0.60%)[21]、搓稚蟲 (0.29%)[23]與深海管蟲 (0.63%)[27]，是目前已報(bào)道的雜合率最高的多毛類。此外，組裝的contig和scalffold 總長(zhǎng)分別為821 637 022 和840 375 821 bp，N50 分別為548 和662 bp，提示過(guò)高的雜合率會(huì)造成組裝序列長(zhǎng)度大于預(yù)估基因組大小，并導(dǎo)致顯著偏低的N50 指標(biāo)[28]。綜上所述，疣吻沙蠶基因組屬?gòu)?fù)雜基因組類型，繪制染色體級(jí)別高質(zhì)量全基因組圖譜應(yīng)優(yōu)先考慮“PacBio+Illumina+Hi-C”策略。該研究數(shù)據(jù)為后續(xù)全基因組測(cè)序與組裝提供了基礎(chǔ)資料。

3.2 疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星分布特征

水生動(dòng)物基因組中單堿基重復(fù)微衛(wèi)星占優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象較少，已報(bào)道的有中華絨螯蟹 (Eriocheirsinensis)[29]、鯉 (Cyprinuscarpio)[30]、脊尾白蝦 (Exopalaemoncarinicauda)[31]和胡鯰 (Clariasbatrachus)[32]。在疣吻沙蠶基因組中檢測(cè)到 130 216 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，位點(diǎn)數(shù)量隨重復(fù)基序堿基數(shù)的增加而迅速減少，單堿基重復(fù)微衛(wèi)星最豐富 (35.00%)，其次為二堿基重復(fù) (32.48%)、三堿基重復(fù) (14.42%)，這與以二堿基或三堿基為優(yōu)勢(shì)類型的魚[9,33-35]、蝦[36-37]、貝類[38]明顯不同，特別是與親緣關(guān)系較近的蛭類、寡毛類相比也表現(xiàn)出較大差異。寬體金線蛭[39]、天錫杜拉蚓 (Drawidagisti)[40]基因組中三堿基重復(fù)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，主要基序類型分別是AAT、ATA 和ATT、AAT。王斌等[41]對(duì)4 種蛭類的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)微衛(wèi)星占優(yōu)勢(shì)，在寬體金線蛭中甚至高達(dá)68.00%。作為最特殊的微衛(wèi)星重復(fù)類型，三堿基重復(fù)微衛(wèi)星可形成復(fù)雜的環(huán)-折疊構(gòu)型來(lái)穩(wěn)定DNA 結(jié)構(gòu)，從而更有利于轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的解旋和蛋白質(zhì)識(shí)別[33]。此外，疣吻沙蠶轉(zhuǎn)錄組中二堿基AT/TA 重復(fù)基序頻率 (32.19%) 最高，單堿基A/T 重復(fù)類型(21.17%)其次，之后是三堿基AGC/GCT (29.06%) 基序 (未發(fā)表數(shù)據(jù))，表明微衛(wèi)星類型特征在轉(zhuǎn)錄組和基因組水平上存在差異，類似的差異性在圓鰭魚 (Cyclopteruslumpus)[42]、凡納濱對(duì)蝦[36,43]、寬體金線蛭[39,41]中也被證實(shí)。不同物種表現(xiàn)出不同的微衛(wèi)星優(yōu)勢(shì)類型分布規(guī)律，可能與其進(jìn)化水平有關(guān)。

疣吻沙蠶基因組微衛(wèi)星核心區(qū)集中在4～18 拷貝，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，微衛(wèi)星數(shù)量呈顯著降低趨勢(shì)，這可能與重復(fù)單元長(zhǎng)度的不斷增加使得微衛(wèi)星穩(wěn)定性降低或基序高頻次重復(fù)導(dǎo)致更高的突變率有關(guān)[44]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，二堿基至六堿基微衛(wèi)星重復(fù)單元中A/T 含量顯著高于G/C 含量，即微衛(wèi)星序列表現(xiàn)出明顯的A/T 堿基優(yōu)勢(shì)，這與許多水生動(dòng)物如脊尾白蝦[31]、凡納濱對(duì)蝦[36]、蝦夷扇貝 (Mizuhopectenyessoensis)[38]、寬體金線蛭[39]及舊金山灣鹵蟲 (Artemiafranciscana)[45]中的研究結(jié)果一致。早期觀點(diǎn)認(rèn)為，微衛(wèi)星富含A/T 的原因可能是由于CpG 甲基化后的C 易脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)門，導(dǎo)致G/C 比例不斷縮小，而突變的A/T 堿基類型相應(yīng)增多[33]；后來(lái)卻發(fā)現(xiàn)這也可能與微衛(wèi)星位點(diǎn)的產(chǎn)生方式，即與DNA 的復(fù)制滑動(dòng)存在一定關(guān)系[29,46]。微衛(wèi)星富含A/T 的原因可能是A/T 含量高則Tm值降低，其序列容易發(fā)生DNA 解鏈，并通過(guò)復(fù)制滑動(dòng)機(jī)制和重組機(jī)制產(chǎn)生高A/T 含量的重復(fù)類型的概率更高[38]。

3.3 疣吻沙蠶微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及其遺傳分析效果

微衛(wèi)星是重要的分子遺傳學(xué)研究工具，開發(fā)多態(tài)標(biāo)記是其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)方法相比，基于高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記更具優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是標(biāo)記開發(fā)的重要資源。然而與轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星相比，基因組微衛(wèi)星的多態(tài)性往往更高且分布更廣泛，可獲得更優(yōu)的基因組覆蓋率[42]。Temnykh 等[16]認(rèn)為長(zhǎng)度≥20 bp 的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性較高，長(zhǎng)度10～20 bp 的為中等多態(tài)性，小于10 bp 的多態(tài)性低。在疣吻沙蠶基因組中共篩選到43 240 條序列長(zhǎng)度≥20 bp 的I 型微衛(wèi)星位點(diǎn)，占比超過(guò)33%，遠(yuǎn)高于其轉(zhuǎn)錄組序列中20%的I 型位點(diǎn)比例 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。挑選50 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行有效性及多態(tài)性驗(yàn)證，有41 個(gè) (82%)位點(diǎn)的引物可擴(kuò)增出特異性條帶，其中15 個(gè) (30%)表現(xiàn)出穩(wěn)定且可重復(fù)的多態(tài)性。疣吻沙蠶基因組多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選成功率與卵形鯧鲹[9]、凡納濱對(duì)蝦[36]、寬體金線蛭[39]中的結(jié)果相當(dāng)。由此可見，疣吻沙蠶微衛(wèi)星標(biāo)記篩選成功率較高，獲得的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有良好的開發(fā)潛力，是豐富且可靠的標(biāo)記資源。

用微衛(wèi)星標(biāo)記開展群體遺傳分析時(shí)，一般認(rèn)為有效等位基因數(shù)越接近觀測(cè)等位基因數(shù)，群體等位基因分布就越均勻；然而在實(shí)際分析中，通常會(huì)將全部條帶視為有效等位基因，無(wú)效等位基因過(guò)剩便會(huì)造成等位基因分布不均[47]。從疣吻沙蠶基因組篩選的15 個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，僅3 個(gè)位點(diǎn)(ThGM021、ThGM035、ThGM041) 的等位基因數(shù)接近有效等位基因數(shù)，提示大部分位的等位基因分布不均，這可能是因?yàn)轵?yàn)證群體的樣本容量偏小引起了主效等位基因的缺失[9]。有研究表明，群體的最小樣本容量一般與遺傳分析選用的參數(shù)有關(guān)。利用He、PIC 以及香農(nóng)指數(shù)等評(píng)估遺傳多樣性時(shí)，群體樣本容量達(dá)到27 便能使分析結(jié)果接近總體水平的95%；但選擇Na時(shí)，樣本容量則需達(dá)到52 以上[48]。疣吻沙蠶的群體樣本量為30，故而選擇He、PIC 可更好地評(píng)價(jià)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性。15個(gè)位點(diǎn)的平均Ho(0.487)、平均He(0.561)和平均PIC (0.511)共同表明，疣吻沙蠶驗(yàn)證群體具有較豐富的遺傳多樣性，這與Chen 等[5]利用COI 標(biāo)記的分析結(jié)果并不完全一致，可能是因?yàn)槲⑿l(wèi)星屬于核標(biāo)記，多態(tài)性更高且受選擇性作用更小，其揭示遺傳變異的靈敏度高于線粒體標(biāo)記。通常認(rèn)為，PIC 越接近1，則群體雜合個(gè)體的比例越大、多態(tài)性越高：PIC＜0.25 為低度多態(tài)性，0.25≤PIC＜0.5 為中度多態(tài)性，PIC≥0.5 為高度多態(tài)性[47]。在15 個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，僅2 個(gè)為低度多態(tài)性，其余13 個(gè) (86.7%) 均為高度或中度多態(tài)性。因此，基于疣吻沙蠶基因組序列篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性高且遺傳信息豐富，可為群體遺傳分析、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、分子育種研究提供優(yōu)質(zhì)工具。

4 結(jié)論

疣吻沙蠶基因組屬于高雜合、高重復(fù)的復(fù)雜基因組，其微衛(wèi)星位點(diǎn)的類型豐富且具備較好的多態(tài)性潛能，可作為有效資源用于微衛(wèi)星標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)，對(duì)種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與保護(hù)利用、種群遺傳學(xué)以及分子育種研究具有實(shí)際價(jià)值。