任曉麗,范玉營,皇甫和平,王 軍,靳雙星,劉 云,石冬梅*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院,鄭州 450046;2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,哈爾濱 150030)

犬乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床上最常見的惡性腫瘤之一,主要發(fā)生在未進行卵巢子宮未切除的雌性犬,8歲以上的犬多發(fā),每10萬例犬中約有476例為惡性乳腺腫瘤,發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升的趨勢,轉移是造成患犬死亡的主要原因[1-2]。目前,臨床上犬乳腺腫瘤的治療主要采用手術切除、激素治療、化學療法和放射治療相結合的方式,但由于治療選擇方式有限、腫瘤病理學類型復雜性、多重耐藥和易轉移復發(fā),影響治療效果[3]。因此,篩選犬乳腺腫瘤的分子靶標用于早期診斷、治療或癌癥進展監(jiān)測具有重要的臨床意義。

miRNA作為轉錄后基因調控因子,參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段,如腫瘤增殖、分化、侵襲、血管生成、轉移、凋亡和耐藥性等,正在成為各種類型癌癥的預測、診斷、預后和治療靶點的潛在的非侵入性細胞和分子生物標志物[4-6]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-502(cfa-miR-502或miR-502)在犬乳腺腫瘤組織中表達上調,與犬乳腺腫瘤的發(fā)生、轉移密切相關,發(fā)揮促癌作用[7]。其他研究顯示,Osaki等[8]對SNP(犬乳腺癌細胞系)和犬的正常乳腺組織miRNA assay結果顯示有291種不同的差異表達的miRNAs,發(fā)現(xiàn)miR-502在SNP細胞中高表達,表達差異5.994 5倍。但miR-502對犬乳腺腫瘤細胞的作用機制尚不清楚。RBMS1最初被認為是一種c-Myc基因單鏈結合蛋白,參與調節(jié)DNA復制、轉錄、凋亡和細胞周期進程[9],也可以通過調節(jié)靶向mRNA的穩(wěn)定性和翻譯來調節(jié)癌癥進展[10-11]。在腫瘤組織中,不同miRNA通過不同的靶基因而發(fā)揮作用,因此,探討miR-502與犬乳腺腫瘤的關系,及與抑癌基因RBMS1之間是否存在調控關系,對研究犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制以及作為治療靶點的潛力提供理論基礎。本試驗主要研究miR-502和RBMS1在犬乳腺腫瘤細胞中的表達,及miR-502是否通過靶調控RBMS1基因影響犬乳腺腫瘤細胞增殖、遷移及EMT中的作用,旨在為犬乳腺腫瘤診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與培養(yǎng)基 犬乳腺腫瘤細胞CHMp和CHMm細胞,分別從12歲的患惡性乳腺腺癌的雌性雜種犬的原發(fā)病灶和轉移病灶中(胸腔積液)分離培養(yǎng)出來,由東北農(nóng)業(yè)大學外科實驗室饋贈;犬乳腺正常乳腺組織,來源于乳腺腫瘤切除手術中的腫瘤旁正常乳腺組織(經(jīng)病理組織學確認為正常乳腺組織結構),手術遵守東北農(nóng)業(yè)大學實驗動物倫理委員會(SRM-11)制定標準,并取得犬主人簽名的知情同意書。DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司;Matrigel購自Corning公司、Opti-MEM、胎牛血清、青鏈霉素和胰蛋白酶購自Gibco公司。

1.1.2 試劑 二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol購自美國Invitrogen公司;RIPA裂解液、增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物有限公司;逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA 熒光定量檢試劑盒(SYBR Green)、U6(RNU6B)引物購自北京天根生化科技有限公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;miR-502模擬劑(mimic)和陰性對照(negative control,NC)、miR-502抑制劑(inhibitor)和陰性對照(negative control,NC)購自上海吉瑪生物技術有限公司;熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司;增強型ECL發(fā)光液購自上海天能生物有限公司;上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細胞遷移標志物基質金屬蛋白酶2(MMP2)、增殖標志物增殖細胞核抗原(PCNA)抗體購自北京博奧森生物有限公司;間質細胞標志物波形蛋白(vimentin)、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自沈陽萬類生物有限公司;所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 犬乳腺腫瘤轉移細胞系CHMm和犬乳腺原發(fā)腫瘤細胞系CHMp細胞分別用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,置于37 ℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞融合度在80%左右時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,每2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞進行試驗,使用Lipofectamine 2000試劑進行細胞轉染,按照試劑盒說明書要求將mimic NC、miR-502 mimic、miR-502 inhibitor、inhibitor NC轉入細胞。

1.2.2 RNA的提取及qRT-PCR檢測 利用TRIzol法提取各試驗細胞和組織中總RNA,Nanodrop分光光度計測定總RNA的純度、濃度和完整性,根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA);此外,根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為miRNAs的cDNA第一鏈,以snRNAU6作為內(nèi)參,miR-502引物設計由北京天根生物有限公司完成,參考miRNAs熒光定量試劑盒說明書利用qRT-PCR檢測miR-502的表達。miR-502、E-cadherin、vimentin和GAPDH等引物序列詳見表1。使用ABI熒光定量PCR儀進行擴增,反應體系20 μL,反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40個循環(huán),計算各基因的相對表達量,其中U6和GAPDH作為內(nèi)參對照,采用2-ΔΔCt法計算miR-502和相關基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8試驗 取對數(shù)生長期的CHMm細胞接種于96孔板,培養(yǎng)12 h后,轉染miR-502 mimic/inhibitor及其對照組(NC),分別于轉染后24、48、72 h進行CCK-8檢測,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)1 h。應用酶標儀檢測450 nm波長下的每孔的吸光度值(OD)。

1.2.4 細胞遷移試驗 取經(jīng)轉染miR-502后的各試驗組細胞,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸各組細胞,計數(shù)使細胞密度為4×105·mL-1,分別取100 μL細胞懸液加入24孔內(nèi)的Transwell小室上室內(nèi),下室加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)12 h,用鑷子小心取出Transwell小室,用無鈣的PBS液清洗3次,甲醇固定30 min,用0.1%結晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦去上層未遷移細胞,PBS洗3次,在倒置顯微鏡下拍照觀察細胞。

1.2.5 細胞侵襲試驗 24孔內(nèi)的Transwell小室上室內(nèi)加入50 μL基質膠培養(yǎng)基混合物,37 ℃孵育1 h使其凝固,其他同“1.2.4”。

1.2.6 Western blot檢測 收取處理48 h后的miR-502轉染組及其對照組的細胞,用預冷的PBS洗滌2次。RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白,BCA法測定其上清液中的蛋白質濃度,進行SDS-PAGE電泳80 V 30 min,120 V 60 min,然后濕轉至PVDF膜上,在含5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,蛋白條帶分別用一抗(anti-rabbit-E-cadherin,1∶750;anti-rabbit-vimentin,1∶500;anti-rabbit-MMP2,1∶750;anti-rabbit-PCNA;1∶500;anti-rabbit-GAPDH,1∶1 000)進行4 ℃孵育過夜,PBS液漂洗3次,山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗HRP(1∶2 000)室溫孵育2 h,TPST液漂洗3次后,加入ECL化學發(fā)光液顯影,曝光,以GAPDH作為內(nèi)參,應用凝膠成像軟件掃描,通過Image J軟件分析蛋白條帶的灰度帶。

1.2.7 雙熒光素酶報告試驗miR-502與RBMS1的靶向關系 通過TargetScan 8.0軟件等預測miR-502與RBMS1之間存在互補的核苷酸序列。將含有miR-502結合位點RBMS1 3′-UTR序列克隆至熒光素酶報告基因質粒中,構建RBMS1野生型(RBMS1 3′-UTR WT)和突變型(RBMS1 3′-UTR MUT)載體,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書將miR-502 mimic/NC、pMIR-REPORT-3′UTR或pMIR-REPORT-con質粒以及Renilla luciferase pRL-TK內(nèi)對照質粒共轉染至CHMm細胞中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,按照熒光酶試劑盒說明書步驟檢測轉染細胞的熒光素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 miR-502和RBMS1在犬乳腺腫瘤細胞中的轉錄水平

qRT-PCR檢測犬乳腺腫瘤細胞中miR-502和RBMS1轉錄情況,結果如圖1所示,與正常乳腺組織相比,CHMm細胞中miR-502的轉錄顯著上調,差異極顯著(P<0.01),miR-502在CHMp中轉錄上調,差異顯著(P<0.05);而RBMS1在 CHMm細胞中轉錄水平顯著下調,差異極顯著(P<0.01),CHMp細胞中RBMS1的轉錄下調,差異顯著(P<0.05)。

與對照組比較,*. P<0. 05,**. P<0. 01,下圖同Compared with control group, *. P<0. 05,**. P<0. 01, the same as below圖1 miR-502和RBMS1在犬乳腺腫瘤細胞和正常乳腺組織中的轉錄Fig.1 Relative transcription of miR-502 and RBMS1 in canine mammary tumor cells and normal mammary gland tissues

2.2 miR-502轉染細胞模型的驗證

構建miR-502 mimic/inhibitor的犬乳腺腫瘤細胞轉染模型,利用qRT-PCR檢測miR-502 mimic和miR-502 inhibitor的轉染效果,與對照組(miR-NC)相比,轉染miR-502 mimic 48 h后,CHMm和CHMp細胞中miR-502的轉錄水平顯著增強(P<0.01);反之,轉染miR-502 inhibitor 48 h后,CHMm和CHMp細胞中miR-502的轉錄水平顯著降低(圖2)。

A. CHMp細胞; B. CHMm細胞A. CHMp cells; B. CHMm cells圖2 犬乳腺腫瘤細胞轉染miR-502后的轉錄檢測Fig.2 Measurement of miR-502 transcription in canine mammary tumor cells after transfection of miR-502 mimic/inhibitor

2.3 轉染miR-502后對犬乳腺腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響

轉移是影響患犬預后不良的主要因素,基于前面的試驗結果,miR-502在CHMm的轉錄水平顯著高于CHMp,選擇CHMm細胞進行后續(xù)試驗。為明確轉染miR-502后是否影響CHMm細胞增殖、遷移和侵襲,采用CCK-8和Transwell試驗檢測轉染miR-502對CHMm細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。CCK-8試驗結果顯示,轉染miR-502 mimic后,與對照組(mimic NC)相比,CHMm細胞的活力顯著升高(P<0.01);反之,轉染miR-502 inhibitor后,與對照組(inhibitor NC)相比,CHMm細胞的活力顯著降低(P<0.01),如圖3A;Transwell結果表明,轉染miR-502 mimic后,與對照組(mimic NC)相比,CHMm細胞的遷移和侵襲能力顯著升高;轉染miR-502 inhibitor后,CHMm細胞的遷移和侵襲能力較對照組顯著降低(圖3B);結果表明,轉染miR-502后可以調控犬乳腺腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

A.轉染miR-502 mimic后促進CHMm細胞增殖,轉染miR-502 inhibior抑制細胞增殖; B. 轉染miR-502 mimic后促進CHMm細胞遷移和侵襲,轉染miR-502 inhibior抑制細胞遷移和侵襲(200×)A. Transfection of miR-502 mimic promoted the proliferation of CHMm cells, whereas miR-502 inhibitor suppressed the proliferation of CHMm cells; B. The migration and invasion of CHMm cells were increased by transfection of miR-502 mimic, but suppressed by the transfection of miR-502 inhibitor (200×)圖3 轉染miR-502后對犬乳腺腫瘤CHMm細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effects of miR-502 transfection on the proliferation, migration and invasion of canine mammary tumor CHMm cells

2.4 轉染miR-502后對犬乳腺腫瘤細胞EMT相關基因的影響

腫瘤細胞遷移能力與細胞發(fā)生EMT有關。為明確miR-502抑制CHMm細胞遷移的作用是否與調控EMT有關,利用qRT-PCR檢測轉染miR-502后犬乳腺腫瘤細胞EMT相關基因的轉錄情況,結果顯示(圖4),與mimic NC組相比,轉染miR-502 mimic后顯著下調CHMm中上皮細胞標志物E-cadherin mRNA的相對轉錄水平(P<0.01),上調CHMm中間質標志物vimentin、MMP2、PCNAmRNA的相對轉錄水平(P<0.01),差異極顯著。反之,與inhibitor NC組相比,轉染miR-502 inhibitor后顯著上調上皮細胞標志物E-cadherin mRNA的相對轉錄水平(P<0.01),顯著下調間質標志物vimentin、MMP2、PCNAmRNA的相對轉錄水平(P<0.01),下調PCNAmRNA的相對轉錄水平(P<0.05)。

A. E-鈣黏蛋白; B. 波形蛋白; C. 基質金屬蛋白酶2; D. 增殖細胞核抗原 A. E-cadherin; B. Vimentin; C. MMP2; D. PCNA圖4 轉染miR-502對犬乳腺腫瘤CHMm細胞EMT相關基因轉錄的影響Fig.4 Effects of miR-502 on transcription of EMT-related mRNA in canine mammary tumor CHMm cells

2.5 轉染miR-502后對犬乳腺腫瘤細胞EMT相關蛋白的影響

Western blot方法檢測E-cadherin、vimentin、MMP2、PCNA蛋白表達含量的結果如圖5所示,轉染miR-502 mimic后CHMm細胞中E-cadherin蛋白的相對表達量顯著低于mimic NC組(P<0.01),而vimentin和MMP2蛋白的相對表達量顯著高于mimic NC組(P<0.01),PCNA 蛋白的相對表達量高于mimic NC組(P<0.05);反之,與inhibitor NC組相比,轉染miR-502 inhibitor后顯著升高CHMm中E-cadherin 蛋白的相對表達量(P<0.01),顯著降低vimentin和MMP2蛋白的相對表達量(P<0.01),降低PCNA蛋白的相對表達量(P<0.05)。上述結果提示,轉染miR-502后調控犬乳腺腫瘤CHMm細胞的EMT。

2.6 miR-502靶向負調控RBMS1表達

miRNA主要通過調節(jié)生物靶標發(fā)揮調控作用,利用生物信息學軟件如miRDB、miRbase和Targetscan 8.0在線數(shù)據(jù)庫初步預測分析RBMS1 3′-UTR可能為miR-502的候選靶標,miR-502和RBMS1 mRNA之間存在互補結合位點(圖6A、6B和6D);qRT-PCR試驗結果顯示,與miR-NC組比較,miR-502 mimic組細胞中的RBMS1 mRNA相對轉錄水平顯著降低,反之,miR-502 inhibitor組的RBMS1 mRNA相對轉錄被明顯的上調(P<0.01)(圖6C);進一步通過雙熒光酶試驗報告基因結果顯示,與miR-NC組相比,miR-502與RBMS1 3′-UTR WT載體共轉染細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),而與miR-502與RBMS1 3′-UTR MUT載體共轉染細胞的熒光素酶活性無顯著改變(圖6E),結果表明,miR-502可以直接靶向結合RBMS1 的3′-UTR,調控RBMS1的表達。

A、B、D. 利用miRDB、miRbase和Targetscan 8.0在線數(shù)據(jù)庫預測分析RBMS1 3′-UTR和miR-502的序列; C. qRT-PCR檢測miR-502 mimic、miR-502 inhibitor對RBMS1 mRNA轉錄的影響; E. 雙熒光素酶報告試驗驗證miR-502與RBMS1的靶向關系A, B, D Using miRDB, miRbase, and Targetscan 8.0 online databases to predict and analyze the sequences of RBMS1 3′-UTR and miR-502; C. qRT-PCR was used to detect the effects of miR-502 mimic and miR-502 inhibitor on the transcription of RBMS1 mRNA; E. Verification of the targeting relationship between miR-502 and RBMS1 using dual luciferase reporter assay圖6 miR-502與RBMS1的靶向關系Fig.6 Targeting relationship between miR-502 and RBMS1

3 討 論

乳腺腫瘤由于其發(fā)病率高、治療方法有限及預后不良,已經(jīng)成為全世界主要的公共衛(wèi)生問題[12]。犬與人類共享生活環(huán)境,犬與人乳腺腫瘤在發(fā)生、臨床表現(xiàn)、診斷與治療反應等方面具有相似之處,可作為研究乳腺腫瘤的模型[13-14]。迄今為止,乳腺腫瘤的診斷與治療仍存在局限性,迫切需要進一步了解乳腺腫瘤發(fā)病機制,發(fā)現(xiàn)一些新穎的診斷標志物。

miRNA是一類調控基因表達的非編碼單鏈小RNA,長度約含22個堿基的核苷酸,并可控制多種腫瘤細胞的功能,一些異常表達的miRNA影響人和犬乳腺腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移等生物學功能,可作為腫瘤性疾病診斷、預后和治療靶點的潛在生物標志物[5,15]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA的差異表達與犬乳腺腫瘤的進展有關,如miR-124在犬乳腺腫瘤細胞中表達降低,miR-124通過靶向CDH2 3′-UTR區(qū)抑制犬乳腺腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)IRAK2被證明是miR-497的一個功能靶點,miR-497在犬乳腺癌細胞低表達,過表達miR-497能通過IRAK2/NF-κB軸抑制犬乳腺癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡。miR-502位于染色體Xp11.23,是miRNA-500家族的成員,在許多不同的惡性腫瘤組織發(fā)揮作用,如人食管鱗狀細胞癌、骨肉瘤、乳腺癌、膀胱癌等[18-21]。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)miR-502在乳腺癌組織中的表達顯著低于癌旁組織,且miR-502通過靶向組蛋白甲基轉移酶(SET domain containin lysine methyltransferase,SET8)抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和EMT。Xu等[18]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,miR-502在食管鱗狀細胞癌中表達上調,這種上調通過PI3K/AKT信號通路促進TE1細胞的增殖和抑制細胞凋亡。與此研究結果相似,在本試驗中,與正常乳腺組織相比,犬乳腺腫瘤原發(fā)CHMp和轉移CHMm細胞中miR-502表達上調,其中CHMm中miR-502表達最高,因此選定CHMm細胞進行下一步的生物功能學試驗,通過細胞轉染在CHMm細胞中干擾miR-502的表達,過表達miR-502后,增強CHMm細胞的增殖、遷移及侵襲能力,反之,抑制miR-502后,細胞的增殖、遷移及侵襲能力被抑制。相比miR NC組,miR-502 mimic可從基因和蛋白水平下調上皮細胞標志物E-cadherin的表達,上調CHMm細胞增殖標志物PCNA、細胞遷移標志物MMP2和間質細胞標志物vimentin的表達,轉染miR-502 inhibitor相反。上述結果表明miR-502通過調控犬乳腺腫瘤CHMm細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT,提示miR-502可為犬乳腺腫瘤的診斷、治療提供潛在的靶點。

miRNA主要通過與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)結合,抑制翻譯或增加mRNA降解來調節(jié)轉錄后基因表達,為進一步研究miR-502在犬乳腺腫瘤中發(fā)揮作用的下游靶基因,通過在線生物信息學網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn),RBMS1是miR-502的潛在靶基因,具有特異性結合位點。先前的一些研究表明,RBMS1在各種惡性腫瘤類型中低表達,如前列腺癌組織和細胞中mRNA表達水平低于正常的前列腺細胞和組織,過表達RBMS1抑制前列腺癌細胞的增殖、克隆形成及遷移,人前列腺癌中過表達miR-106b顯著降低RBMS1蛋白的表達,RBMS1作為miR-106b的潛在靶標[11];RBMS1在結腸癌肝轉移的病人來源的異種移植小鼠模型中表達顯著降低,敲低RBMS1促進轉移能力增加,而恢復其表達會減弱轉移性肝定植[22]。小鼠卵巢顆粒細胞(ovarian granulosa cell,OGC)和卵母細胞中miR-383可通過影響RBMS1 mRNA的穩(wěn)定性抑制RBMS1作用,進而抑制c-Myc對GC雌二醇的釋放作用[23]。本研究證實犬乳腺腫瘤細胞CHMm和CHMp中RBMS1的表達顯著低于正常犬乳腺組織,轉染 miR-502 mimic后可明顯下調CHMm中RBMS1 mRNA的表達,反之,抑制miR-502可使RBMS1表達上調,此外,進一步證實miR-502可以通過RBMS1發(fā)揮調節(jié)作用,通過雙熒光素報告基因試驗驗證了miR-502通過結合到RBMS1 mRNA 3′-UTR,轉染miR-502 mimic后顯著降低CHMm中野生型RBMS1熒光載體的熒光素酶活性,而對突變型RBMS1熒光載體的熒光素酶活性沒有明顯的變化,結果表明,miR-502可以靶向負調控RBMS1的表達,但miR-502通過調控RBMS1的表達影響犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制還需進一步深入研究。

4 結 論

miR-502在犬乳腺腫瘤細胞CHMm和CHMp中表達上調,發(fā)揮癌基因的作用,促進CHMm細胞增殖、遷移及EMT,且miR-502靶向調控RBMS1基因的表達。