禹 瑞，楊 璞，崔曉鴿，陳四清

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046）

根皮素主要存在于草莓、梨、蘋果等果蔬中，具有抗菌、抗氧化、降血糖、心血管保護(hù)等活性［1］，可有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［2］，并且毒性極?。?］，具有開發(fā)成護(hù)肝、抗肝癌新藥的潛力。但該成分溶解度為26.51 μg/mL［4］，油水分配系數(shù)（lgP） 為1.22［5］，在胃腸道中容易被破壞［6］，體內(nèi)穩(wěn)定性差，并且它也是多藥耐藥相關(guān)蛋白2 （MRP2）、P-gp 蛋白底物［6］，導(dǎo)致其口服生物利用度僅為8.676%［6］，目前已有膠束［7］、磷脂復(fù)合物［4-5］、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體［8］、醇質(zhì)體［9］等相關(guān)報(bào)道。

前期報(bào)道，脂質(zhì)體囊材主要由磷脂組成，生物相容性高，可增加藥物溶解度、穩(wěn)定性，并促進(jìn)其吸收［10-11］； 磷脂具有保護(hù)肝功能、抗肝癌的協(xié)同作用［12］，可使肝癌高危患者受益，是一種藥輔兩用材料，但前者混懸液儲存穩(wěn)定性較差，而后者在處方中極易發(fā)生氧化［4］。前體脂質(zhì)體可有效解決脂質(zhì)體穩(wěn)定性問題［13-14］，并且儲存方便，故本實(shí)驗(yàn)制備根皮素前體脂質(zhì)體，并考察其體內(nèi)藥動學(xué)，以期為該制劑后續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 AUY220 型電子分析天平（日本島津公司）； 安捷倫1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； Zetasizer Nano Z 型激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）； CD-X15 型實(shí)驗(yàn)室超聲儀（深圳市亦為實(shí)業(yè)有限公司）； HB10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA 公司）； SH-2-001 型磁力攪拌器、HH-1型恒溫水浴鍋、HY-5 型恒溫振蕩器（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）； HM-D12 型氮?dú)獯祾邇x（山東恒美電子科技有限公司）； HS-100 型離心機(jī)（德國THF科學(xué)儀器公司）。

1.2 試劑與藥物 根皮素對照品（批號110366-202009，純度98.2%，中國食品藥品檢定研究院）； 根皮素原料藥（批號191022，純度97.0%，武漢福鑫化工有限公司）。膽固醇（批號20201012，亳州克拉瑪爾生物科技有限公司）； 大豆磷脂（批號20210420，磷脂酰膽堿含量90%，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）； 甘露醇（批號190516，山西錦洋藥用輔料有限公司）； 蔗糖（批號200118，湖南九典制藥股份有限公司）。

1.3 動物 清潔級SD 大鼠，雌雄兼具，體質(zhì)量180～200 g，由河南省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK （豫） 2020-0001，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至220～240 g 時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 根皮素含量測定

2.1.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-水（35 ∶65）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長285 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取根皮素對照品20 mg，置于100 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解定容，得200 μg/mL 貯備液，精密量取適量，流動相依次稀釋至 5、2.5、1、0.1、0.25、0.05 μg/mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝13.152 5X＋0.896 0 （r＝0.999 6），在0.05～5 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取前體脂質(zhì)體約0.1 g（根皮素含量約為1.15 mg），置于10 mL 量瓶中，加入pH 為6.8 的PBS 緩沖液8 mL，固定于振蕩器（100 r/min） 上振蕩至無不溶性顆粒產(chǎn)生，定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取0.5 mL 至50 mL 量瓶中，加流動相（功率250 W） 超聲處理5 min，稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 取0.05、1、5 μg/mL 對照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得根皮素峰面積RSD 分別為0.40%、0.29%、0.46%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，于0、2、6、12、24、48 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得根皮素含量RSD 為0.60%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一份前體脂質(zhì)體，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得根皮素含量RSD 為1.52%，表明該方法重復(fù)性良好。取前體脂質(zhì)體粉末0.05 g，共9 份，分為低、中、高3 組，分別加入貯備液1.5、3、4.5 mL，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得根皮素平均加樣回收率分別為100.79%、99.26%、101.24%，RSD 分別為0.63%、1.16%、0.57%。

2.2 前體脂質(zhì)體制備 采用載體沉積法［14-15］，取根皮素原料藥20 mg 及處方量大豆磷脂、膽固醇，置于圓底燒瓶中，加入20 mL 無水乙醇超聲處理3 min 至溶解澄清，作為有機(jī)相。取處方量載體（乳糖） 過120 目篩，置于茄形瓶中，并固定于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，將有機(jī)相通過導(dǎo)管分3 次加到載體中（以防止載體材料發(fā)生粘連），得混懸液，45 ℃減壓旋蒸除去無水乙醇，即得。臨用前取約0.1 g，加入pH 為6.8 的PBS 緩沖液10 mL 振蕩15 min，過0.45 μm 微孔濾膜，作為混懸液。

2.3 包封率、粒徑、Zeta 電位測定 取前體脂質(zhì)體混懸液2 mL，置于超濾離心管中（截留分子量10 kDa），13 500 r/min 離心15 min，取超濾液，測定游離根皮素量（W1）； 另取2 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定總根皮素量（W0），計(jì)算包封率，公式為包封率＝ ［（W0-W1）/W0］ ×100%。取前體脂質(zhì)體混懸液0.1 mL，加入蒸餾水5 mL，搖勻后取適量至比色皿中，在粒度分析儀上測定其粒徑、PDI； 另取適量至Zeta 電位專用器皿中，測定其Zeta 電位。

職工論壇是院內(nèi)文化的體現(xiàn)。院內(nèi)職工可隨時(shí)在企業(yè)號內(nèi)參與論壇活動，在論壇上發(fā)布一些正能量、學(xué)術(shù)性等的文字、圖片、小視頻等內(nèi)容，增強(qiáng)大家相互學(xué)習(xí)的積極性，提高醫(yī)院的創(chuàng)效能力；此外，院內(nèi)職工還可直接通過企業(yè)號查看及收發(fā)郵件，并提供職工信箱、職工訴求等渠道。

2.4 處方優(yōu)化 采用Box-Behnken 響應(yīng)面法。

固定根皮素用量20 mg，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磷脂與膽固醇比例、脂（磷脂＋膽固醇） 藥比、載（乳糖） 脂比對包封率影響較大，故分別作為自變量X1、X2、X3，因素水平見表1，再以包封率為因變量Y優(yōu)化處方，平行3 次，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n＝3）Tab.2 Design and results of tests （n＝3）

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1picture_figure_titleResponse surface plots for various factors

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 由圖1 可知，最優(yōu)處方為磷脂與膽固醇比例4.82 ∶1，脂藥比16.48 ∶1，載脂比4.2 ∶1，包封率為83.88%，為了便于操作，將其修正為磷脂與膽固醇比例4.8 ∶1，脂藥比16.5 ∶1，載脂比4.2 ∶1。按優(yōu)化處方平行制備3 批樣品，加入水相制成混懸液，按“2.3” 項(xiàng)下方法測定包封率，測得其數(shù)值為83.06%，與預(yù)測值83.88%接近（相對偏差為-0.98%）。再按“2.3”項(xiàng)下方法測得平均粒徑為216.84 nm （圖2），PDI為0.117，Zeta 電位為-22.76 mV （圖3）。另外，前脂質(zhì)體中根皮素含量為1.15%。

圖2 根皮素前體脂質(zhì)體粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of phloretin proliposomes

圖3 根皮素前體脂質(zhì)體Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of phloretin proliposomes

2.6 形態(tài)觀察 取前體脂質(zhì)體混懸液適量，蒸餾水稀釋50 倍，混勻后滴2 ～3 滴至銅網(wǎng)上，鋪展，1.5%磷鎢酸染色，晾干，在透射電鏡 （13 000倍） 下觀察其形態(tài)，結(jié)果見圖4。由此可知，該制劑基本呈球形或橢圓形，并且粒徑小于在激光粒度儀下觀察時(shí)，這是因?yàn)樵谇罢咝柘冗M(jìn)行干燥，失水后其粒徑會變小。

圖4 根皮素前體脂質(zhì)體透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron microscopy image of phloretin proliposomes

2.7 體外釋藥研究 參考文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道，取前體脂質(zhì)體粉末適量（根皮素含量均為8 mg），加入5 mL 模擬胃液制成混懸液，置于透析袋中（截留分子量8 ～12 kDa），扎緊； 另取8 mg，直接分散于溶出介質(zhì)中。設(shè)定介質(zhì)為1 000 mL 模擬胃液，溫度為37 ℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速為75 r/min，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、18 h各取樣5 mL，并及時(shí)補(bǔ)充5 mL 空白介質(zhì)，0.45 μm 微孔濾膜過濾，測定累積釋放度，同法考察在模擬腸液中的釋藥情況，結(jié)果見圖5。由此可知，原料藥在模擬胃液、模擬腸液中的累積釋放度分別為15.17%、9.89%，而前體脂質(zhì)體分別提高至90.24%、64.60%。

2.8 晶型分析 取根皮素、空白輔料（不含藥物，輔料比例同前體脂質(zhì)體）、物理混合物（藥物與輔料比例同前體脂質(zhì)體）、根皮素前體脂質(zhì)體粉末適量，進(jìn)行X 射線粉末衍射 （XRPD） 分析，設(shè)定掃描范圍 （2θ） 為3° ～45°，掃描速度為4°/min，結(jié)果見圖6。由此可知，原料藥在6.9°、9.7°、14°、27.3°等處出現(xiàn)特征晶型峰； 物理混合物中仍可見根皮素晶型峰，表明簡單混合未使原料藥晶型發(fā)生變化； 前體脂質(zhì)體圖譜中僅見空白輔料晶型峰，原料藥特征晶型峰均消失，表明它轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形物質(zhì)［16-17］。

2.9 穩(wěn)定性研究 取前體脂質(zhì)體及其混懸液適量，置于恒溫恒濕箱中（溫度25 ℃，相對濕度55%），于0、15、30、45、60、75、90 d 取樣，測定包封率，結(jié)果見圖7。由此可知，混懸液在60 d 時(shí)包封率降低至10%以下，而前體脂質(zhì)體仍在80%以上，表明后者穩(wěn)定性良好。

圖7 不同時(shí)間點(diǎn)根皮素前體脂質(zhì)體及其混懸液包封率（n＝3）Fig.7 Encapsulation efficiencies of phloretin proliposomes and their suspension at different time points （n＝3）

2.10 體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.10.1 分組、給藥與采血 取根皮素及其前體脂質(zhì)體粉末適量，加入pH 為6.8 的PBS 緩沖液振蕩15 min 制成藥液 （根皮素質(zhì)量濃度5 mg/mL）。12 只大鼠隨機(jī)分為2 組，禁食過夜，按40 mg/kg劑量灌胃給藥，其中根皮素采血點(diǎn)為0.25、0.5、1、1.5、1.75、2、3、4、5、6、8 h，其前體脂質(zhì)體采血點(diǎn)為0.25、0.5、1、1.25、1.5、2、3、5、6、8、12 h，采血量均約為0.25 mL，置于肝素浸潤離心管中，3 500 r/min 離心2 min。

2.10.2 血漿樣品處理 參考文獻(xiàn)［4，6］ 報(bào)道，將血漿樣品置于37 ℃水浴中解凍，精密吸取0.1 mL至空白離心管中，加入1 mL 乙腈密封后渦旋5 min，4 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液至離心管中，45 ℃氮?dú)獯蹈桑?.1 mL 乙腈復(fù)溶，12 000 r/min 離心5 min，取10 μL 上清液。

2.10.3 線性關(guān)系考察 取根皮素對照品適量，空白血漿制成質(zhì)量濃度分別為1 600、800、400、200、100、20 ng/mL 的血漿對照品溶液，按“2.10.2” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.323 6X＋14.28（r＝0.996 5），在20 ～1 600 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.10.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、灌胃給藥12 h后血漿樣品、血漿對照品溶液（20 ng/mL） 適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖8，可知根皮素分離度理想，表明該方法專屬性良好。取20、400、1 600 ng/mL 血漿對照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得根皮素峰面積RSD 分別為6.60%、7.18%、5.32%，表明該方法日內(nèi)精密度良好； 同法每天測定1 次，連續(xù)6 d，測得根皮素峰面積RSD 分別為8.04%、5.43%、6.19%，表明該方法日間精密度良好。取同一份血漿樣品，按“2.10.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得根皮素峰面積RSD 為3.68%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一份血漿樣品，在溫度25 ℃、相對濕度55%下于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得根皮素峰面積RSD 為6.01%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20、500、1 500 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得根皮素平均加樣回收率分別為94.10%、92.53%、97.85%，RSD 分別為5.16%、7.61%、6.08%。

圖8 根皮素HPLC 色譜圖Fig.8 HPLC chromatograms of phloretin

2.10.5 結(jié)果分析 血藥濃度-時(shí)間曲線見圖9，再采用DAS 2.0 軟件中的非房室模型計(jì)算主要藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4。由此可知，與原料藥比較，前體脂質(zhì)體tmax縮短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度增加至2.44 倍，而t1/2無明顯變化（P＞0.05）。

圖9 根皮素血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）Fig.9 Plasma concentration-time curves for phloretin（n＝6）

表4 根皮素主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for phloretin （±s，n＝6）

表4 根皮素主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for phloretin （±s，n＝6）

注： 與根皮素比較，**P＜0.01。

參數(shù)單位根皮素根皮素前體脂質(zhì)體tmaxh1.78±0.281.18±0.22*t1/2h3.72±0.663.51±0.72 Cmaxng·mL-1503.49±152.771 190.61±355.94**AUC0～tng·mL-1·h1 303.26±174.783 186.11±550.34**AUC0～∞ng·mL-1·h1 384.50±188.393 292.74±578.81**

3 討論

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，包封率隨著膽固醇比例增加先升后降，可能是由于適量膽固醇可增加脂質(zhì)體穩(wěn)定性、包封率，但其用量過大時(shí)會引起膜超負(fù)荷［18］，導(dǎo)致包封率反而降低，最終選擇磷脂與膽固醇比例3 ∶1 ～6 ∶1 進(jìn)行優(yōu)化。脂藥比對脂質(zhì)體包封率也有較大影響，脂質(zhì)（膽固醇＋磷脂） 用量過小時(shí)不能有效包裹藥物，導(dǎo)致包封率較低，而過大時(shí)會導(dǎo)致材料浪費(fèi)，最終選擇10 ∶1 ～20 ∶1 進(jìn)行優(yōu)化。載體用量過低時(shí)，前體脂質(zhì)體重建困難［19］，而過高時(shí)其本身形成的冰晶會破壞脂質(zhì)體，導(dǎo)致包封率降低［20］，最終選擇2 ∶1 ～6 ∶1 進(jìn)行優(yōu)化。另外，磷脂本身具有保護(hù)肝功能、抗肝癌的協(xié)同作用［12］，可作為“藥輔合一” 材料［21］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根皮素前體脂質(zhì)體在模擬胃液中的累積釋放度高于模擬腸液中，可能是一方面前體脂質(zhì)體在前者中的穩(wěn)定性不佳［21］，原料藥釋放更容易，而另一方面原料藥在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定［6］，影響了在模擬腸液中的累積釋放度； 前體脂質(zhì)體tmax顯著縮短，可能與其釋藥速率較快有關(guān)［22］； 前體脂質(zhì)體Cmax、相對生物利用度升高，可能是由于它可降低原料藥粒徑，從而促進(jìn)后者溶出［15，20］；前體脂質(zhì)體增加了原料藥在胃腸液中的穩(wěn)定性，提高了其進(jìn)入血液循環(huán)的量。另外，無定形藥物往往具有更高的吸收程度［7，11］； 藥物粒徑較小時(shí)可增加與胃腸道的接觸面積，從而便于吸收［11，22］。但普通脂質(zhì)體在胃腸道中的穩(wěn)定性不高，并且外排蛋白（MRP2、P-gp） 的外排作用［6］最終影響了根皮素Cmax、相對生物利用度的提高程度。今后，將對脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾以增加其穩(wěn)定性［23］，從而更有利于吸收。