張豐盛，王 攆，宋少莉，楊 紅，王明偉

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234；

3.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海 200032；

4.上海分子影像探針工程技術(shù)研究中心，上海 200032

近年來(lái)，因?yàn)榫哂袃?yōu)異的選擇性和生物正交性、快速的逆電子需求狄爾斯-阿爾德（inverse electron demand Diels-Alder，IEDDA）反應(yīng)，四嗪（Tetrazine，Tz）/反式環(huán)辛烯（transcyclooctene，TCO）體系在腫瘤預(yù)靶向正電子發(fā)射體層成像（positron emission tomography，PET）/計(jì)算機(jī)體層成像（computed tomography，CT）領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注［1］。研究［2-3］表明，放射性核素標(biāo)記Tz探針和TCO修飾抗體的組合體系表現(xiàn)出良好的腫瘤預(yù)靶向核素顯像效果。在該體系中，核素標(biāo)記的小分子Tz衍生物發(fā)揮探針的作用，是實(shí)現(xiàn)腫瘤預(yù)靶向核素顯像的關(guān)鍵因素之一。為了開(kāi)展腫瘤預(yù)靶向PET/CT或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）/CT研究，目前已經(jīng)報(bào)道了不同核素標(biāo)記的Tz探針，例如從111In（t1/2=2.83 d）標(biāo)記雙吡啶Tz衍生物開(kāi)始［4］，逐漸發(fā)展了99mTc（t1/2=6.02 h）［5］、89Zr（t1/2=78.4 h）［6］、64Cu（t1/2=12.7 h）［7］、18F（t1/2=109.8 min）［8-9］和68Ga（t1/2=68.1 min）［10］等核素標(biāo)記的Tz探針。其中，111In和99mTc適用于SPECT，圖像分辨率較低。其他幾種用于PET/CT的正電子核素中，89Zr和64Cu的半衰期較長(zhǎng)，存在輻射劑量較大、固體靶生產(chǎn)成本較高、可及性較低等局限性。18F是目前使用廣泛的核素之一，具有較為合適的半衰期、經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)成本和可及性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，然而通常的18F標(biāo)記溫度均較高，在標(biāo)記過(guò)程中可能容易破壞Tz結(jié)構(gòu)而使其失去活性［9，11］。比較而言，68Ga是近幾年應(yīng)用日益增加的金屬核素，其半衰期短，輻射劑量較低，由68Ge/68Ga發(fā)生器淋洗而得，較易獲取，成本較低，靈活性大，并且采用螯合方式標(biāo)記68Ga，反應(yīng)條件溫和，標(biāo)記率高［12-13］。因此，68Ga標(biāo)記Tz探針是引人關(guān)注的核素標(biāo)記Tz衍生物之一，在基于Tz/TCO體系的腫瘤預(yù)靶向顯像領(lǐng)域具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

為了探索68Ga標(biāo)記Tz探針在基于Tz/TCO體系的腫瘤預(yù)靶向PET/CT應(yīng)用的可行性，本文選擇Tz探針68Ga-NOTA-Tz為對(duì)象，開(kāi)展其放射性標(biāo)記條件優(yōu)化和包括穩(wěn)定性、生物分布和腫瘤MicroPET/CT在內(nèi)的體內(nèi)外性質(zhì)評(píng)價(jià)研究，為68Ga標(biāo)記Tz衍生物的體內(nèi)生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)策略的應(yīng)用提供直觀的實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

采用德國(guó)Siemens公司的Inveon小動(dòng)物MicroPET/CT機(jī)；德國(guó)Isotope Technologies Garching公司的68Ge/68Ga發(fā)生器；美國(guó)Agilent公司的液相色譜儀1260 Infinity，配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、放射性檢測(cè)器（德國(guó)Raytest公司）和PLRP-S分析柱（5 μm，300 ?，250.0 mm×4.6 mm）；挪威Biosan公司的TS-100金屬浴振蕩器；德國(guó)Sigma公司的3-30K冷凍離心機(jī)；德國(guó)Sartorius公司的BSA124S精密天平；德國(guó)Raytest公司的MiniGita Star放射性薄層色譜掃描儀；上海核所日環(huán)光電儀器有限公司的SN-6110γ放射性免疫計(jì)數(shù)儀。

1.1.2 試劑核素68Ga來(lái)自于68Ge/68Ga發(fā)生器，NOTATz為西安點(diǎn)化生物科技有限公司產(chǎn)品，濃鹽酸（36%～38%）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，無(wú)水乙酸鈉（≥99.0%）購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司，磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate buffer saline，PBS）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，iTLC-SG層析紙購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司，甲醇（99.5%）購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司，乙酸銨（AR）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，HPLC/光譜純乙腈購(gòu)自美國(guó)Tedia公司。

1.1.3 腫瘤細(xì)胞和模型

SMMC-7721人肝癌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，使用含10%胎牛血清（FBS，Gibco）、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%潮濕環(huán)境下培養(yǎng)。5周齡BALB/c正常小鼠（雄性）和BALB/c裸小鼠（雄性）均購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司。消化離心處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，用PBS配制成細(xì)胞懸液。取0.1 mL（1×107個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液，注射到裸小鼠左前肢腋窩皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 68Ga-NOTA-Tz的放射性標(biāo)記條件優(yōu)化

68Ga-NOTA-Tz的放射化學(xué)標(biāo)記路線如圖1所示。為了優(yōu)化其標(biāo)記條件，本文針對(duì)反應(yīng)體系的pH值、溫度、時(shí)間和前體用量等影響因素，設(shè)計(jì)了一系列平行實(shí)驗(yàn)。

圖1 68Ga-NOTA-Tz的放射化學(xué)標(biāo)記路線示意圖

首先用5.0 mL HCl（0.05 mol/L）淋洗68Ge/68Ga發(fā)生器，收集中間2.0 mL68Ga淋洗液。然后，對(duì)于平行的多組反應(yīng)，取多個(gè)反應(yīng)管，分別向其中加入100 μL68Ga淋洗液、一定量醋酸鈉溶液（0.5 mol/L，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值）、一定量的NOTA-Tz水溶液（5 mmol/L），混合均勻，置于金屬恒溫振蕩儀中，加熱一定時(shí)間，進(jìn)行68Ga標(biāo)記反應(yīng)。達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后，停止加熱，取樣點(diǎn)板，用放射性薄層色譜儀分析標(biāo)記率，展開(kāi)劑為醋酸銨溶液（1.0 mol/L）/甲醇（體積比1∶1）混合液。

1.3 68Ga-NOTA-Tz的放射化學(xué)純度分析

為了分析68Ga-NOTA-Tz的放射化學(xué)純度，本文采用了Radio-iTLC和Radio-HPLC兩種方法。對(duì)于Radio-iTLC分析，采用iTLC層析紙，展開(kāi)劑為醋酸銨溶液（1.0 mol/L）/甲醇（體積比1∶1）混合液。對(duì)于Radio-HPLC分析，采用梯度分析方式，流動(dòng)相為水（含0.1%TFA，A）和乙腈（含0.1%TFA，B）混合液。其濃度變化梯度：0～5 min為100%A+0%B，5～10 min為75%A+25%B，10～17 min為33%A+67%B，17～20 min為0%A+100%B，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.4 體外穩(wěn)定性

取100 μL68Ga-NOTA-Tz溶液，分別加入等體積的生理鹽水和FBS，37℃恒溫溫育0.5、1.0、2.0、4.0 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣點(diǎn)板，進(jìn)行RadioiTLC分析，測(cè)定放射化學(xué)純度。

1.5 血漿蛋白結(jié)合率

取新鮮小鼠血液，置于抗凝管內(nèi)，靜置1.0 h后，冷凍離心分離（4 000 r/min，5 min），取上層血漿。取100 μL68Ga-NOTA-Tz溶液（2.0 μCi，1 μCi=3.7×104Bq）和100 μL血漿混勻，于37 ℃恒溫溫育0.5、1.0、1.5 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，超濾離心分離（15 000 r/min，10 min），再用PBS清洗，重復(fù)3次。分離后，用γ計(jì)數(shù)儀分別測(cè)量濾膜上和濾液中的放射性，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。

1.6 脂水分配系數(shù)

取1.0 mL水和1.0 mL正辛醇混合均勻，置于5.0 mL離心管內(nèi)（n=5），再加入68Ga-NOTA-Tz溶液（2.0 μCi），充分混合搖勻，靜置。待混合液完全分層后，分別取100 μL水相和100 μL有機(jī)相，用γ計(jì)數(shù)儀分別測(cè)量水相與有機(jī)相的放射性，計(jì)算脂水分配系數(shù)logP。

1.7 血液半衰期

通過(guò)尾靜脈，將68Ga-NOTA-Tz溶液（30 μCi，200 μL）注射到小鼠體內(nèi)（n=5），于注射后1、3、5、10、15、30、60、90 min取血，稱重，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量血液放射性，計(jì)算每克血液百分注射劑量率（%ID/g）。通過(guò)GraphPad擬合，計(jì)算早期快速分布半衰期和終末緩慢清除半衰期。

1.8 正常鼠生物分布

通過(guò)尾靜脈，將68Ga-NOTA-Tz溶液（40 μCi，200 μL）注射到正常BALB/c小鼠體內(nèi)（n=3）。于注射后5、15、30、60、90 min取血，然后用脫頸方式處死小鼠，解剖并獲取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、膀胱、肌肉、血液、腦和骨等，稱重，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量組織放射性，計(jì)算各組織% ID/g。

1.9 移植瘤模型MicroPET/CT

通過(guò)尾靜脈，將68Ga-NOTA-Tz溶液（100 μCi，100 μL）注射到SMMC-7721移植瘤模型小鼠體內(nèi)（n=3）。于注射后0.5、1.0、1.5 h，使用異氟烷氣體麻醉荷瘤小鼠，進(jìn)行MicroPET/CT顯像，先行CT掃描5 min，再行PET掃描10 min。經(jīng)Inveon軟件重建，獲得MicroPET/CT圖像，勾畫(huà)感興區(qū)，計(jì)算腫瘤、心、膽囊和腎臟等主要器官%ID/g。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26軟件分析處理數(shù)據(jù)。研究數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

2 結(jié) 果

2.1 68Ga-NOTA-Tz的優(yōu)化標(biāo)記條件

2.1.1 反應(yīng)體系pH值對(duì)標(biāo)記率的影響

取0.1 mL68Ga淋洗液，分別添加19、22、25、28 μL乙酸鈉溶液（0.5 mol/L），調(diào)節(jié)pH值為3.8、4.1、4.4、4.6，再加入3.0 μL NOTA-Tz溶液（5.0 m mol/L），在25 ℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)體系pH值對(duì)標(biāo)記率的影響如圖2A所示，pH=3.8時(shí)標(biāo)記率最高，接近60%，而pH=4.1、4.4和4.6時(shí)標(biāo)記率均有不同程度的下降。因此，68Ga-NOTATz的優(yōu)化的標(biāo)記pH值為3.8。

圖2 不同反應(yīng)條件對(duì)標(biāo)記率的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)標(biāo)記率的影響

選擇上述優(yōu)化的pH值，68Ga淋洗液和NOTATz的用量同2.1.1，分別在25、37和45 ℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)溫度對(duì)標(biāo)記率的影響如圖2B所示，25℃時(shí)標(biāo)記率只有55%，37℃時(shí)為71%，45℃時(shí)達(dá)到84%。由此可見(jiàn)，68Ga-NOTA-Tz的標(biāo)記率隨反應(yīng)溫度的升高而升高，并且3個(gè)反應(yīng)溫度之間的標(biāo)記率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，綜合考慮Tz結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性和標(biāo)記率，優(yōu)化的標(biāo)記溫度為45 ℃。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響

選擇上述優(yōu)化的標(biāo)記pH值和溫度，68Ga淋洗液和NOTA-Tz的用量同2.1.1，分別在45 ℃反應(yīng)10、15、20 min。反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響如圖2C所示，反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)標(biāo)記率已經(jīng)達(dá)到91%，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，標(biāo)記率并沒(méi)有明顯變化。因此，綜合考慮標(biāo)記率和68Ga的衰變，優(yōu)化的標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間是10 min。

2.1.4 前體用量對(duì)標(biāo)記率的影響

選擇上述優(yōu)化的標(biāo)記pH值、溫度和時(shí)間，68Ga淋洗液的用量同2.1.1，分別加入1.0、2.0、3.0 μL的NOTA-Tz溶液（5.0 mmol/L），在45 ℃恒溫反應(yīng)10 min。前體用量對(duì)標(biāo)記率的影響如圖2D所示，前體用量5.0 nmol時(shí)標(biāo)記率為81%，而10.0和15.0 nmol時(shí)分別為79%和74%，即增加前體投料并不是提高標(biāo)記率的有利因素。綜合考慮標(biāo)記率和節(jié)約前體用量，優(yōu)化的標(biāo)記前體用量為5.0 nmol。

2.2 68Ga-NOTA-Tz的制備和放射化學(xué)純度分析

如圖3所示，采用上述優(yōu)化標(biāo)記條件制備68Ga-NOTA-Tz，其標(biāo)記率大于95%。經(jīng)RadioiTLC和Radio-HPLC分析，68Ga-NOTA-Tz的放射化學(xué)純度大于95%，無(wú)需額外的純化，可以直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 68Ga-NOTA-Tz的平均標(biāo)記率和放化純度分析

2.3 68Ga-NOTA-Tz的體外性質(zhì)評(píng)價(jià)

圖4A是68Ga-NOTA-Tz的體外穩(wěn)定性曲線，4.0 h內(nèi)其在生理鹽水和FBS中的穩(wěn)定性分別保持在95%和90%以上。這表明68Ga-NOTA-Tz具有良好的體外穩(wěn)定性，有利于后續(xù)的體內(nèi)顯像。68Ga-NOTA-Tz的脂水分配系數(shù)logP為-2.06±0.02，說(shuō)明其親水性較好。68Ga-NOTA-Tz與血漿蛋白結(jié)合率如圖4B所示，在0.5、1.0、1.5 h時(shí)均處在20%～25%，顯示其具有一定的血漿蛋白結(jié)合能力。

圖4 68Ga-NOTA-Tz的體外性質(zhì)

2.4 68Ga-NOTA-Tz的血液半衰期和體內(nèi)生物分布

根據(jù)其血液放射性活度-時(shí)間曲線計(jì)算可知，68Ga-NOTA-Tz在小鼠體內(nèi)的早期快速分布即生物分布半衰期為1.1 min，終末緩慢清除即血液清除半衰期為29.1 min。這說(shuō)明68Ga-NOTA-Tz在動(dòng)物體內(nèi)呈現(xiàn)快速的分布和代謝特征，具有良好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

68Ga-NOTA-Tz的正常動(dòng)物體內(nèi)生物分布如表1所示。注射后5 min，68Ga-NOTA-Tz在心、脾、肺、腎、胃、膀胱、肌肉等大多數(shù)主要組織中的%ID/g均達(dá)到最大值，然后逐漸降低。然而，肝臟%ID/g直到注射后30 min才達(dá)最大值，之后才隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少。比較主要臟器%ID/g的高低可知，在所有的時(shí)間點(diǎn)腎臟%ID/g均最高，其次是肝臟、膀胱，表明68Ga-NOTA-Tz的主要排泄途徑是泌尿系統(tǒng)，其次是肝膽系統(tǒng)，這符合該探針親水性較強(qiáng)的性質(zhì)。同時(shí)，相對(duì)而言，在注射后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)68Ga-NOTA-Tz的血液%ID/g均較高，并且降低較為緩慢，這可能與其具有一定程度的血漿蛋白結(jié)合率有關(guān)。因此，68Ga-NOTA-Tz的體內(nèi)行為表現(xiàn)出全身主要器官均有較高的快速分布、通過(guò)泌尿和肝膽系統(tǒng)排泄、血液清除慢而本底高的特點(diǎn)。

表1 68Ga-NOTA-Tz的正常動(dòng)物體內(nèi)生物分布

2.5 68Ga-NOTA-Tz的腫瘤MicroPET/CT

為了更加直觀且整體地觀察68Ga-NOTA-Tz的全身分布情況，本文開(kāi)展了注射后不同時(shí)間點(diǎn)68Ga-NOTA-Tz的SMMC-7721荷瘤小鼠MircoPET/CT顯像（圖5）。由圖可知，肝、膽、腎臟和膀胱等主要臟器在注射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有很強(qiáng)的放射性信號(hào)，與上述正常鼠生物分布的結(jié)果基本一致，這進(jìn)一步表明68Ga-NOTA-Tz經(jīng)過(guò)泌尿系統(tǒng)和肝膽系統(tǒng)排泄。特別重要的是，68Ga-NOTA-Tz的腫瘤顯像信號(hào)明顯，具有一定的對(duì)比度，能夠區(qū)別周?chē)＝M織，在注射后0.5、1.0、1.5 h時(shí)%ID/gmean分別為1.6±0.11、1.3±0.15和1.3±0.12，表明68Ga-NOTA-Tz能快速分布并長(zhǎng)時(shí)間滯留于腫瘤組織內(nèi)，這有利于其在基于體內(nèi)生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)的腫瘤預(yù)靶向PET/CT領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖5 68Ga-NOTA-Tz的SMMC-7721荷瘤鼠模型MircoPET/CT顯像和分析

3 討 論

為了推動(dòng)基于Tz/TCO體系的生物正交點(diǎn)擊化學(xué)的腫瘤預(yù)靶向顯像策略的基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究，核素標(biāo)記Tz探針的研發(fā)是非常重要的環(huán)節(jié)之一。此類探針的選擇需要考慮核素的類型與Tz結(jié)構(gòu)等兩個(gè)重要方面，其中核素決定了半衰期、輻射劑量和顯像模式，而Tz結(jié)構(gòu)影響其生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)活性和穩(wěn)定性，最終關(guān)系到其水溶性、血液半衰期、生物分布、腫瘤滯留等重要的生物學(xué)性質(zhì)［14-15］。在綜合考慮各種因素的基礎(chǔ)上，本文選擇研發(fā)Tz探針68Ga-NOTA-Tz，開(kāi)展其放射性標(biāo)記條件優(yōu)化和體內(nèi)外性質(zhì)評(píng)價(jià)研究，為68Ga標(biāo)記Tz探針的生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)策略的體內(nèi)應(yīng)用提供直觀的實(shí)驗(yàn)參考。

制備68Ga標(biāo)記探針的常用方法是通過(guò)NOTA等雙功能螯合劑的螯合方式標(biāo)記68Ga，其標(biāo)記條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短及標(biāo)記率高。然而，這種68Ga標(biāo)記方法對(duì)反應(yīng)體系的pH和溫度等標(biāo)記條件較為敏感。因此，為了優(yōu)化建立68Ga-NOTA-Tz的可靠制備方法，本文首先探討了pH值、溫度、時(shí)間和前體用量等4個(gè)主要影響標(biāo)記率的條件實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在反應(yīng)體系pH=3.8、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時(shí)間10 min、前體用量5 nmol等條件下，標(biāo)記率大于95%，無(wú)需進(jìn)一步分離純化，實(shí)現(xiàn)了68Ga-NOTA-Tz的穩(wěn)定可靠制備，為后續(xù)的性質(zhì)評(píng)價(jià)和應(yīng)用提供了保證。

研究［15-16］表明，Tz探針的親水性、藥代動(dòng)力學(xué)、代謝等生化性質(zhì)會(huì)影響其在腫瘤內(nèi)與TCO點(diǎn)擊反應(yīng)，并將最終決定腫瘤預(yù)靶向顯像效果。由此，本文接下來(lái)開(kāi)展了68Ga-NOTA-Tz的體內(nèi)外性質(zhì)評(píng)價(jià)研究。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，68Ga-NOTA-Tz不但具有良好的體外穩(wěn)定性和親水性，而且有適合的生物半衰期，可保證充分的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間來(lái)增加與TCO點(diǎn)擊反應(yīng)。生物分布和SMMC-7721細(xì)胞小鼠移植瘤MircoPET/CT顯示，68Ga-NOTA-Tz雖然主要分布在肝臟、膽囊、腎臟和膀胱等主要代謝器官，但是也能快速而均勻地分布至腫瘤組織，表明其應(yīng)用于基于體內(nèi)生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)的腫瘤預(yù)靶向PET/CT顯像的潛力。

綜上所述，本文通過(guò)優(yōu)化Tz探針68Ga-NOTATz的放射性標(biāo)記條件，建立了其標(biāo)記率高、穩(wěn)定可靠的制備方法，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的穩(wěn)定性和親水性以及快速而均勻的腫瘤分布，顯示出基于體內(nèi)生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)的腫瘤預(yù)靶向PET/CT顯像的應(yīng)用潛力。