任舒凡， 林欣儀， 張婉玲， 王 通

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632）

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease-2019，COVID-19）是一種由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引發(fā)的傳染?。?］，其典型癥狀包括發(fā)燒、干咳、乏力、氣促和肺炎等［2］。COVID-19患者體內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)過度分泌促炎細(xì)胞因子的現(xiàn)象，即細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm）［3］。細(xì)胞因子風(fēng)暴可在COVID-19 患者中誘發(fā)多種器官損傷［4］。研究表明有14%~78%的COVID-19患者可出現(xiàn)肝損傷，表現(xiàn)為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平顯著升高，及血漿白蛋白降低［5-6］。肝細(xì)胞已被證實(shí)是SARSCoV-2的靶細(xì)胞［7］，且多有COVID-19死亡病例表現(xiàn)為肝組織纖維化、輕度炎癥浸潤和線粒體腫脹等［8-9］。但是，SARS-CoV-2引起肝損傷的機(jī)制尚不清楚。

作為抗病毒免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，I 型干擾素（type I interferon， IFN-I）在已被發(fā)現(xiàn)多數(shù)COVD-19患者中顯著上調(diào)［10］。其中，IFN-α可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生以ISG （IFN-stimulated gene）化（ISGylation）為代表的抗病毒免疫應(yīng)答［11］，SARS-CoV-2 所編碼的木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain-like protease， PLpro）已被證明具有去ISG 化（deISGylation）活性，提示SARS-CoV-2 通過PLpro蛋白抵御機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答［12］。

綜合上述研究進(jìn)展，SARS-CoV-2 PLpro（簡稱PLpro）有可能對(duì)IFN-α 應(yīng)答的肝細(xì)胞發(fā)揮作用。因此，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PLpro 的單克隆Huh7 肝細(xì)胞株，并建立了IFN-α 應(yīng)答狀態(tài)下的Huh7 肝細(xì)胞模型，同時(shí)結(jié)合功能蛋白質(zhì)分析和生物學(xué)驗(yàn)證以解析上述科學(xué)問題。

材 料 和 方 法

1 主要細(xì)胞

Huh7 為人肝癌細(xì)胞系，購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；293T為人腎上皮細(xì)胞系，購買于美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞系經(jīng)過支原體檢測，均為支原體陰性。

2 主要試劑

胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自Biological Industries；苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF）購自Sigma-Aldrich；DMEM 培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素溶液、丙酮酸鈉溶液、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自Gibco；感染試劑Lipofectamine 3000、10%Bis-Tris 預(yù)制膠、蛋白質(zhì)電泳緩沖液、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜緩沖液和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜購自Invitrogen；pcDNA3.1-PLpro-3×flag 載體由廣州達(dá)弘生物科技有限公司構(gòu)建；人炎癥相關(guān)細(xì)胞因子檢測試劑盒（cytometric bead array， CBA）購自BD Biosciences；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人ISG15 抗體（2743S）、兔抗人α-Tubulin 抗體（2125S）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體（7074S）購自Cell Signaling Technology；雞源SARS-CoV-1 PLpro 抗體（AB-0602-0250）購 自LifeSensors；重 組 蛋 白IFN-α2（90105-CNAY-20）、兔 抗 人CA2 抗 體（10478-RP02）和 兔 抗 人SCARB1 抗體（11069-T38）購自北京義翹神州科技股份有限公司；兔抗人IRF9 抗體（14167-1-AP）購自Proteintech；兔抗人CD63 抗體（ab134045）和HRP-山羊抗雞抗體（ab6877）購自Abcam；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen；蛋白質(zhì)酶抑制劑購自Roche；RNA 提取試劑盒和胰蛋白酶（質(zhì)譜級(jí)）購自Promega；C18 除鹽柱購自GL Sciences；所用引物由廣州睿博生物技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（SANYO）；超低溫冰箱和細(xì)胞操作安全柜（海爾公司）；流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）；qPCR 儀（Bio-Rad）；蛋白質(zhì)凝膠電泳/轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）；真空冷凍干燥機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

4 主要方法

4.1 細(xì)胞培養(yǎng) Huh7和293T細(xì)胞使用完全DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、0.1 g/L 鏈霉素、100 U/mL 青霉素、10 mg/L環(huán)丙沙星和1 mmol/L 丙酮酸鈉）在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

4.2 SARS-CoV-2 PLpro 慢病毒載體構(gòu)建 載體pcDNA3.1-SARS-CoV-2-PLpro-3×flag 作為模板進(jìn)行PCR，PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收，得到SARS-CoV-2 PLpro 全長序列。將pLVX-EGFPPuro 質(zhì)粒EcoRI 和BamHI 雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。使用T4 DNA 連接酶將兩端含有酶切位點(diǎn)黏端的PLpro 序列與線性的pLVX-EGFP-Puro載體于16 ℃酶連反應(yīng)16 h。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，隨后挑取單克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)，測序驗(yàn)證后使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液質(zhì)粒，獲得SARS-CoV-2 PLpro慢病毒載體。

4.3 SARS-CoV-2 PLpro 穩(wěn)定株構(gòu)建 在293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，將完全DMEM 培養(yǎng)液替換成基礎(chǔ)DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在離心管中加入DNA 溶液（pLVX-EGFP-PLpro-Puro 質(zhì)粒9 μg，pMD2.G 輔助質(zhì)粒3 μg，pSPAX2 輔助質(zhì)粒6μg），與800 μL的基礎(chǔ)DMEM 培養(yǎng)液、27 μL的P3000混合均勻。另一離心管中加入27 μL Lipo3000 和800 μL 基礎(chǔ)DMEM 培養(yǎng)液，室溫下孵育5 min。將兩管混合成一管后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min。將轉(zhuǎn)染液加進(jìn)細(xì)胞液于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h 后更換DMEM 培養(yǎng)液（含10% FBS、1 mmol/L 丙酮酸鈉），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞病毒上清，于230×g離心3 min，0.45 μm 濾器過濾上清液收集于50 mL 離心管中。加入7.8 mL 40% PEG 8000 和3.4 mL 3 mmol/L Na-Cl，于4 ℃保存。24 h 后4 ℃ 、3 200×g離心30 min，去上清后加入1 mL 完全DMEM 培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，分裝后于-80 ℃冰箱長期保存。Huh7 細(xì)胞感染前24 h，以每孔4×105細(xì)胞個(gè)數(shù)的密度鋪于6孔板中，并在細(xì)胞密度約為30%時(shí)感染慢病毒。感染48 h后用嘌呤霉素連續(xù)作用7 d，獲得具有過表達(dá)SARSCoV-2 PLpro 的Huh7 細(xì)胞（PLpro 細(xì)胞）和NC 細(xì)胞，并進(jìn)行單克隆擴(kuò)增。

4.4 建立處于IFN-α 應(yīng)答狀態(tài)的肝細(xì)胞模型 將NC 細(xì)胞或PLpro 細(xì)胞以每孔4×105的密度接種于6孔板中，加入完全DMEM 培養(yǎng)液，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。24 h 后加入3 ng/L 的IFN-α，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，該作用濃度模擬COVID-19 患者體內(nèi)的IFN-α水平［13］。

4.5 RT-qPCR 按照Promega RNA 提取試劑盒的說明書提取總細(xì)胞RNA，用Ⅰ型DNA 酶去除DNA 后將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。八聯(lián)管加入cDNA、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix 和前后引物后進(jìn)行qPCR。

4.6 Western blot 參照本團(tuán)隊(duì)以往的報(bào)道［14-15］，細(xì)胞蛋白質(zhì)以裂解液（含1%的SDS 和1 mmol/L PMSF；加入蛋白酶抑制劑）進(jìn)行裂解后進(jìn)行超聲處理。于4 ℃ 、12 000×g離心30 min，取上清。取20 μg 蛋白質(zhì)在10% Bis-Tris 預(yù)制膠中進(jìn)行Western blot，使用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h。加入ISG15 抗體（1∶1 000）、α-Tubulin 抗體（1∶2 000）、SARS-CoV-1 PLpro抗體（1∶2 500）、CA2 抗體（1∶1 000）和SCARB1 抗體（1∶1 000）、IRF9 抗體（1∶1 000）和CD63 抗體（1∶1 000），于4 ℃垂直搖床過夜孵育。第2 天加入HRP標(biāo)記的兔/雞Ⅱ抗（1∶2 000），室溫孵育1 h 后在顯影儀拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.7 蛋白質(zhì)酶解除鹽 該步驟參考本團(tuán)隊(duì)以往報(bào)道的方法［14-15］。簡要為，取150 μg 蛋白進(jìn)行酶解除鹽，經(jīng)還原、烷基化，于超濾管中進(jìn)行14 h酶解，收集肽段并利用C18脫鹽柱頭除鹽。

4.8 質(zhì)譜分析

4.8.1 數(shù)據(jù)依賴采集質(zhì)譜（data-dependent acquisition mass spectrometry， DDA-MS）建庫 將6 個(gè)樣品的肽段干粉于4 ℃、16 500×g離心5 min 后加入20μL 0.1%（體積比）甲酸重溶，取2 μL 肽段進(jìn)行肽段濃度檢測，其余肽段于4 ℃、16 500×g離心，離心時(shí)間大于30 min。準(zhǔn)備DDA 上樣肽段：每個(gè)樣品取3 μg，共18 μg，根據(jù)肽段的總體積，加入3.5 μL iRT 以及補(bǔ)相應(yīng)的0.1%甲酸至總體積為25 μL，使用Thermo Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀進(jìn)行DDA-MS 分析。每次取3 μg 混合肽段進(jìn)行DDA-MS 分析，一共取4 次，每次進(jìn)行120 min的質(zhì)譜分析。

4.8.2 數(shù)據(jù)非依賴采集質(zhì)譜（data-independent acquisition mass spectrometry， DIA-MS）分 析 準(zhǔn) 備DIA 上樣肽段樣品：6 個(gè)樣品各取9 μL 并加入1 μL iRT，根據(jù)各自的肽段濃度各取3 μg 相應(yīng)的肽段體積，使用Thermo Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀進(jìn)行DIA-MS分析，每個(gè)樣品進(jìn)行120 min的質(zhì)譜分析。

4.8.3 蛋白的鑒定和定量 使用Spectronaut 14.10軟件對(duì)DDA 質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫及DDA 庫建立。完成DDA 建庫后，進(jìn)入Analysis 面版，點(diǎn)擊“Set up a DIA Analysis…”，導(dǎo)入6 個(gè)DIA 的.raw 文件和.fasta 文件，并選擇上述構(gòu)建完成的DDA 庫，設(shè)置參數(shù)后點(diǎn)擊“finish”開始對(duì)DIA樣品進(jìn)行鑒定定量分析。

4.9 生物信息學(xué)分析

4.9.1 差異蛋白質(zhì)的計(jì)算 以表達(dá)差異倍數(shù)（fold change）>1.5 倍且P<0.01 為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins， DEPs）的篩選。

4.9.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 在R studio 4.1.2中進(jìn)行PCA析。

4.9.3 聚類分析 使用MATLAB R2020b 軟件中“clustergram”命令對(duì)DEPs 進(jìn)行層次聚類分析，首先對(duì)樣品定量值進(jìn)行l(wèi)og10 對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換并標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，組內(nèi)距離量度方法（linkage）為離差平方和法（ward）運(yùn)行命令。

4.9.4 ingenuity pathway analysis （IPA） 參考本課題組已報(bào)道的方法使用IPA 中的核心分析模塊進(jìn)行上游調(diào)控因子（upstream regulator analysis）和通路分析［15］。

4.10 cytometric bead array analysis （CBA） 參考本團(tuán)隊(duì)以往的報(bào)道［16］，使用CBA 試劑盒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子進(jìn)行測定，流式細(xì)胞數(shù)據(jù)使用FCAP軟件（3.0.1版本）分析。

4.11 LDH 毒性檢測 根據(jù)LDH 細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞上清，將細(xì)胞上清于400×g離心5 min，去除細(xì)胞沉淀。配制工作液：等體積的乳酸、LDH 和1×INT。將120 μL 細(xì)胞上清加進(jìn)96 孔板中，每孔加入60 μL 工作液。將樣品在室溫下避光孵育30 min，并在490 nm 和630 nm 處測量吸光度（A）值。

4.12 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞經(jīng)PBS 洗滌后用不含EDTA 的胰酶消化，300×g離心5 min 后收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2次，每次300×g離心5 min，棄上清。加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647 和10 μL PI 染料，輕輕混勻后避光室溫反應(yīng)15 min。加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，混勻后放置于冰上，用流式細(xì)胞儀檢測。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8 軟件或R studio（版本4.1.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，使用非配對(duì)Student'st檢驗(yàn)；當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布但不服從方差齊性時(shí)，使用非配對(duì)Student'st'檢驗(yàn)；兩者都不滿足時(shí)，使用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)。P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。條形圖中顯示的所有數(shù)據(jù)均為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）。

結(jié) 果

1 SARS-CoV-2 PLpro具去ISG化活性

本研究共構(gòu)建了3 株可持續(xù)表達(dá)PLpro 蛋白的單克隆細(xì)胞（PLpro1、PLpro2 和PLpro3）和一株僅穩(wěn)轉(zhuǎn)pLVX-EGFP-Puro 的單克隆細(xì)胞（NC），見圖1A。兩組細(xì)胞經(jīng)IFN-α 處理后，NC 組出現(xiàn)了典型的ISG化蛋白條帶，而3 株P(guān)Lpro 單克隆細(xì)胞的ISG 化蛋白條的灰度均較NC 組弱，見圖1B?；叶戎档慕y(tǒng)計(jì)分析表明，PLpro組的ISG化蛋白的灰度值顯著低于NC組（P<0.01），見圖1C。上述結(jié)果表明PLpro 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株可表達(dá)具ISG 化活性的PLpro，提示細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

Figure 1.Characterization of monoclonal cells expressing SARS-CoV-2 PLpro.A： the expression of SARS-CoV-2 PLpro detected by Western blot； B and C ： verification of PLpro deISGylation activity.Mean±SEM.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs NC group.圖1 穩(wěn)定表達(dá)SARS-CoV-2 PLpro蛋白的Huh7單克隆細(xì)胞株的表征

2 差異蛋白質(zhì)組分析

分別以IFN-α 作用于NC 和PLpro 細(xì)胞后，本研究開展了DIA-MS 分析。結(jié)果表明，三次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)中，NC 細(xì)胞組可定量的蛋白質(zhì)數(shù)目分別為5 877、5 863 和5 855 個(gè)，其中交集數(shù)為5 767 個(gè)，占總數(shù)的97%；三次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)中，PLpro 細(xì)胞組可定量的蛋白質(zhì)數(shù)目分別為5 811、5 847 和5 806 個(gè)，其中交集數(shù)為5 671 個(gè)，占總數(shù)的95.6%；所有實(shí)驗(yàn)組可定量交集蛋白數(shù)為5 619 個(gè)（圖2A）。以上述5 619 個(gè)交集定量蛋白質(zhì)進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果表明，PLpro組和NC組在PC1維度能被區(qū)分（圖2B）。統(tǒng)計(jì)分析共獲得149個(gè)DEPs，與NC組相比，PLpro組中有100 個(gè)上調(diào)DEPs 和49 個(gè)下調(diào)DEPs（圖2C）。利用這些DEPs 進(jìn)行層次聚類分析結(jié)果顯示，NC 組和PLpro組可被區(qū)分，表明這些DEPs 具實(shí)驗(yàn)組特異性（圖2D）。

Figure 2.DEPs differentiated the PLpro groups from the NC group.A： Venn diagram of quantified proteins in the NC and the PLpro groups； B： principal component analysis； C： volcano plot depicting the DEPs， significantly up- and down- regulated DEPs in the PLpro groups are shown in red and blue， respectively； D： hierarchical clustering analysis with DEPs.圖2 差異蛋白質(zhì)可有效區(qū)分PLpro和NC組

3 PLpro 可在對(duì)IFN-α 應(yīng)答狀態(tài)的Huh7 肝細(xì)胞中獨(dú)立激活細(xì)胞因子風(fēng)暴效應(yīng)蛋白

以上述149 個(gè)DEPs 開展的IPA 上游分析（upstream analysis）結(jié)果表明，有35個(gè)上游調(diào)控蛋白（upstream regulator）被顯著激活（z-score>1.96），12 個(gè)上游調(diào)控蛋白被顯著抑制（z-score<-1.96）。其中IL-6、IFNG、OSM、IL-13、TNF、CD40LG 和IL-1β 是顯著被激活的上游細(xì)胞因子（圖3A）。

為了驗(yàn)證IPA 和質(zhì)譜分析結(jié)果，本研究對(duì)IPA 預(yù)測的上游因子的4 個(gè)下游DEPs 進(jìn)行了IB 驗(yàn)證，這些DEPs 分別為CA2、SCARB1、CD63 和IRF9（圖3B）。經(jīng)三次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)和灰度分析，結(jié)果顯示PLpro可在IFN-α 應(yīng)答的Huh7 細(xì)胞中顯著上調(diào)IRF9（P<0.05）和SCARB1蛋白（P< 0.01），該變化趨勢與質(zhì)譜分析定量結(jié)果一致（圖3C~3F）。

本研究進(jìn)而檢測了細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 p70 和TNF 共6 種炎癥因子的豐度。結(jié)果表明，在NC 組和PLpro 組分泌的上清中，IL-6、TNF、IL10、IL-12 p70 和IL-1β 的濃度均低于檢出限，僅可檢測出IL-8。經(jīng)細(xì)胞數(shù)量歸一化后，兩組間的IL-8 濃度無顯著差異（圖4A）。以上結(jié)果表明，在對(duì)IFN-α應(yīng)答的Huh7肝細(xì)胞中，PLpro不會(huì)直接上調(diào)上述6種炎癥因子的分泌。

本研究進(jìn)一步使用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)其中的IL-1β、TNF和IL-6三種促炎細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，IL-1β和IL-6mRNA 的表達(dá)量在PLpro 組和NC 組間均無顯著差異（P>0.05，圖4B、4C），而PLpro 組的TNFmRNA 的表達(dá)量顯著低于NC 組（圖4D，P<0.05）。由此可見肝細(xì)胞在IFN-α應(yīng)答狀態(tài)下，PLpro 未促進(jìn)其上述促炎因子的mRNA表達(dá)。

4 PLpro 誘導(dǎo)處于IFN-α 應(yīng)答狀態(tài)的Huh7 細(xì)胞的壞死性細(xì)胞死亡

流式細(xì)胞術(shù)分析表明，無論是NC 組還是PLpro組，對(duì)IFN-α 應(yīng)答的Huh7 肝細(xì)胞的死亡形式主要以壞死為主，這些壞死細(xì)胞表現(xiàn)為Annexin V 和PI雙陽性（圖5A）。從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，PLpro 組的細(xì)胞壞死水平顯著高于NC 組（P<0.01，圖5B）。在培養(yǎng)上清中，PLpro 組的LDH 水平顯著高于NC 組（P<0.01，圖5C）。

Figure 5.Cell death analysis of the IFN-α-responsive Huh7 cells in PLpro and NC groups.A and B： flow cytometric analysis of cell necrosis； C： LDH cytotoxicity assay.Mean±SEM.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs NC group.圖5 PLpro誘導(dǎo)IFN-α應(yīng)答性Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞死亡分析

討 論

SARS-CoV-2 是一種RNA 病毒，其主要攜帶4 種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和16種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（non-structural protein， NSP）［17］。SARS-CoV-2 入侵機(jī)體，會(huì)激活細(xì)胞中IFN-Ⅰ［10，18］。IFN-I 與受體結(jié)合，可通過信號(hào)級(jí)聯(lián)最終誘導(dǎo)IFN 刺激基因（interferon stimulated gene，ISG）轉(zhuǎn)錄，其中ISG15是IFN-I的主要下游基因之一，它可通過泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的序貫作用與靶蛋白質(zhì)結(jié)合，完成蛋白質(zhì)的ISG 化，從而發(fā)揮包括抗病毒等在內(nèi)的多種生物學(xué)效應(yīng)［19］。PLpro 是非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3 最大的結(jié)構(gòu)域［20］，具去ISG 化修飾活性，可干擾IFN-Ⅰ介導(dǎo)的ISG化，削弱IFN-Ⅰ的抗病毒功能［12］。

本研究從處于IFN-α應(yīng)答狀態(tài)的Huh7肝細(xì)胞研究模型入手，以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了PLpro蛋白對(duì)肝細(xì)胞的系統(tǒng)影響。結(jié)果提示PLpro 不但可圍繞IFN 通路發(fā)揮調(diào)控作用，同時(shí)可上調(diào)包括IL-6、IFNγ、OSM、IL-13、TNF、CD40LG 和IL-1β 在內(nèi)的數(shù)種細(xì)胞因子的下游效應(yīng)蛋白。上述細(xì)胞因子中，除了IL-13外，其余皆為已知參與COVID-19相關(guān)細(xì)胞因子風(fēng)暴的促炎細(xì)胞因子［21-23］。在一項(xiàng)對(duì)中國150 名COVID-19 患者的回顧性研究中，作者分析比較了82 例COVID-19治愈病例和68例COVID-19死亡病例的數(shù)據(jù)，顯示IL-6 水平在COVID-19 死亡病例中顯著升高［24］。目前，上述細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的系統(tǒng)炎癥也被證實(shí)與COVID-19患者肝損傷顯著相關(guān)［25-27］。

本研究結(jié)果提示PLpro 在誘導(dǎo)炎癥因子下游效應(yīng)蛋白時(shí)具獨(dú)立性，即PLpro發(fā)揮上述作用時(shí)無需誘導(dǎo)上調(diào)這些炎癥因子。事實(shí)上，這種現(xiàn)象與Tang等［16］的報(bào)道具一定的相似性，該研究觀察到IL-1β可在不需要誘導(dǎo)TNF 表達(dá)的情況下，獨(dú)立在人類滑膜細(xì)胞中誘導(dǎo)上調(diào)TNF 相關(guān)效應(yīng)蛋白。因此，PLpro 這種獨(dú)立誘導(dǎo)過度炎癥應(yīng)答的能力可能對(duì)炎癥因子風(fēng)暴的效應(yīng)起到獨(dú)立的放大作用。

本研究結(jié)果提示PLpro 可誘導(dǎo)處于IFN-α 應(yīng)答狀態(tài)下的Huh7 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壞死。已知過度炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而細(xì)胞死亡會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥的加劇，形成了正反饋回路。兩者的相互作用被稱 為“PANoptosis”［28］。Li 等［29］的 研究表 明，SARSCoV-2 可激活caspase-8 蛋白，并誘發(fā)肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞因子上調(diào)。Li 等［30］的研究表明，SARS-CoV-2 的Spike 蛋白可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平并抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡。Gholizadeh 等［31］的研究表明，在COVID-19患者中，肝酶水平異常的患者LDH水平顯著高于肝酶水平正?；颊?。這與本研究結(jié)果中PLpro組細(xì)胞上清中LDH顯著上調(diào)有一定的可比性。

SARS-CoV-2 PLpro 蛋白已被認(rèn)為是潛在COVID-19 藥物靶點(diǎn)，其中YM155、隱丹參酮和GRL0617等均顯示出對(duì)該蛋白的抑制作用［32］。例如，Shin等［12］的研究表明，GRL0617可通過抑制PLpro蛋白酶活性從而破壞病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病理效應(yīng)，維持IFN通路的活化，減少病毒在感染細(xì)胞中的復(fù)制。

綜上，本研究結(jié)合了功能蛋白質(zhì)組學(xué)策略和生物學(xué)驗(yàn)證的體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示在對(duì)IFN-α 應(yīng)答的Huh7 肝細(xì)胞中，PLpro 蛋白可獨(dú)立促進(jìn)Huh7 肝細(xì)胞的炎癥因子的下游效應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)多度的炎癥應(yīng)答，并誘導(dǎo)Huh7肝細(xì)胞壞死性細(xì)胞死亡。