小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B通過調控PI3K/Akt通路誘導胃癌細胞凋亡*

敖嘉怡， 葉連寶， 馬宇昕， 褚夫江， 周 暢△

（1廣東藥科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，廣東 廣州 510006；2廣東藥科大學藥學院藥物化學系，廣東 廣州 510006；3廣東藥科大學基礎醫(yī)學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006）

胃癌是一種常見的起源于胃粘膜上皮細胞的惡性腫瘤，其在惡性腫瘤中全球發(fā)病率居第五位、死亡率居第四位［1］。進展期胃癌患者難以通過外科手術等手段進行根治性治療，目前主要治療方案仍是聯(lián)合化療，但有效的化療藥物種類較少且易出現(xiàn)毒副作用。而傳統(tǒng)細胞毒性藥物對胃癌治療效果已達到瓶頸，分子靶向藥物與其相比具有低毒、高效等特點，因此近年來開發(fā)新型分子靶向藥物成為胃癌研究熱點之一。小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 是一種由本課題組前期以來那替尼（neratinib）和新型細胞間充質-表皮轉化因子（cellular mesenchymal-epithelial transition factor， c-Met）抑制劑MET-2 ［spiro（indoline-3，4'-piperidine）-2-ones］作為先導結構設計合成的氨基嘧啶類化合物，體外活性實驗證實A2B 對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）具 有 雙 重 抑 制 作用［8］，但該藥物在胃癌治療中的抗癌效應及分子機制尚未明確。研究表明EGFR、HER2 及c-Met 的高表達與胃癌預后不良有關［2-3］，而磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/Akt）信號通路為EGFR、HER2 及c-Met三者共同作用的下游通路［4-6］，該通路的異常激活能夠抑制腫瘤細胞凋亡。本項工作擬以EGFR 及HER2 高表達的人胃癌細胞SGC-7901 為主要研究對象，以EGFR、HER2 及c-Met 為作用靶點，聚焦PI3K/Akt信號通路及腫瘤細胞凋亡途徑，探討A2B抗胃癌的作用及相關分子生物學機制，為研發(fā)治療胃癌的新型小分子酪氨酸激酶抑制劑提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 試劑 胎牛血清購自TOCYTO；RPMI-1640 培養(yǎng)液、PBS 緩沖液購自Gibco；0.25%胰蛋白酶購自BI；青、鏈霉素雙抗溶液購自HyClone；CCK-8 試劑盒購自Glpbio；二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma；Beyo-Click? EdU-488 細胞增殖檢測試劑盒、SDS-PAGE 快速配膠試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）均購自上海碧云天生物技術有限公司；EGFR 抗體、HER2 抗體、c-Met 抗體、B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體、caspase-3/p17/p19 抗體、PI3K 抗體和山羊抗兔Ⅱ抗購自Proteintech；山羊抗鼠Ⅱ抗購自上海泊灣生物技術有限公司；Akt 抗體和p-Akt 抗體購自常州市祥泰生物技術有限公司；小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 由本課題組葉連寶教授前期設計合成，已獲得專利授權［7］。

1.2 儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher；酶標儀購自Bio-Rad；化學發(fā)光成像與分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；BD FACSCalibur 流式細胞儀購自BD。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC-7901 由本實驗室保存，在含10%胎牛血清、1%青、鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640 培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每兩天換液一次，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期人胃癌細胞SGC-7901 制備成5×104/mL 單細胞懸液，以每孔100 μL 接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后根據(jù)分組更換新鮮培養(yǎng)液。分組為對照組（正常培養(yǎng)組）、不同濃度（2.5、5、10、20、40、80、100 和160 μmol/L）的A2B 實驗組和僅添加培養(yǎng)液的空白組，每組4 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h 后，每孔加入含10 μL CCK-8 溶液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2~3 h，酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度（A）值，以空白孔調零，計算細胞相對活力，并使用SPSS 軟件計算IC50值。細胞相對活力（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。實驗重復3 次。

2.3 平板集落形成實驗檢測細胞集落形成能力將處于對數(shù)生長期SGC-7901 細胞以每孔1×103接種于6孔板中，待細胞貼壁后去除原培養(yǎng)液，分為4組：對照（control）組（細胞正常培養(yǎng)組）、溶劑組（vehicle組，用含0.08% DMSO 培養(yǎng)液處理細胞）和A2B （10和20 μmol/L）實驗組，后續(xù)實驗分組情況同此描述。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，10 d 后終止培養(yǎng)。經4%多聚甲醛固定細胞15 min 后，結晶紫染色10 min，隨后使用流水清洗并晾干拍照記錄，于倒置顯微鏡下計算大于50個細胞的集落數(shù)，實驗重復3次。

2.4 EdU 細胞染色實驗檢測細胞增殖情況 EdU細胞染色實驗［17］使細胞DNA 標記上熒光探針，增殖的細胞呈現(xiàn)綠色熒光，Hoechst 33342 染液使活細胞的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光。取對數(shù)生長期SGC-7901細胞以每孔2×104接種于24孔板中，細胞貼壁后隨機分為4 個實驗組。藥物處理24 h 后去除一半原培養(yǎng)液，更換為含EdU 的新鮮培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。終止培養(yǎng)后根據(jù)試劑盒中說明書進行后續(xù)實驗，通過熒光倒置顯微鏡拍照，采用ImageJ 軟件對EdU+細胞及活細胞計數(shù)，實驗重復3次。

2.5 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率Annexin V-FITC/PI 雙染法［18］可用于檢測細胞凋亡情況，其中Annexin V-FITC 可以染色早期凋亡細胞，呈現(xiàn)綠色熒光；PI可以染色壞死細胞或晚期凋亡細胞，呈現(xiàn)紅色熒光。取對數(shù)生長期SGC-7901 細胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿，細胞貼壁后隨機分為4 個實驗組。藥物處理24 h 后用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集全部細胞，制備成3×105/mL的單細胞懸液，用預冷的PBS 洗滌1~2 次，細胞沉淀中加入200 μL Annexin VFITC 結合液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，室溫避光孵育15~20 min，隨后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

2.6 JC-1 染色法檢測細胞線粒體膜電位變化 JC-1 染色法［19］可通過JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變檢測線粒體膜電位的下降情況。細胞接種及給藥同2.5，藥物處理24 h 后用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細胞，PBS 洗滌1~2 次后用0.5 mL 完全培養(yǎng)液重懸細胞，隨后加入0.5 ml JC-1染色工作液，充分混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育25 min。孵育結束后，40.2×g、4 ℃離心3 min，去除培養(yǎng)液后用1×JC-1染色緩沖液洗滌2 次，最后用400 μL 1×JC-1 染色緩沖液重懸細胞，并使用流式細胞儀檢測JC-1 紅綠熒光比例，實驗重復3次。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達情況 細胞接種及給藥同2.5，藥物處理24 h后用胰蛋白酶消化收集全部細胞，預冷的PBS 洗滌細胞1~2 次，加入適量的裂解液置于冰浴中裂解20 min，利用細胞超聲破碎儀超聲8 s，共2~3次，低溫高速離心機中4 ℃、9 558.7×g離心10 min 后收集上清液，用BCA 定量試劑盒進行蛋白定量后加入5×上樣緩沖液高溫變性。每組取20~30 μg 蛋白進行SDS-PAGE，然后低溫轉膜至0.22 μm PVDF 膜，TBST 洗膜1~2 次，每次5 min，5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，按照說明書比例用抗體稀釋液稀釋Ⅰ抗/Ⅱ抗，加入Ⅰ抗于4 ℃環(huán)境中孵育過夜；Ⅰ抗孵育結束后，TBST 洗膜10 min×3 次，室溫下加入Ⅱ抗孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次；置于ECL 顯影液中顯影，并利用化學發(fā)光成像與分析系統(tǒng)拍照記錄，最后用ImageJ軟件分析灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

利用GraphPad Prism 9.0 或SPSS Statistics 26.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，利用單因素方差分析（oneway ANOVA）檢驗各組間差異，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 A2B對人胃癌細胞SGC-7901及正常胃粘膜細胞GES-1活力的影響

利用CCK-8 法于24、48 和72 h 檢測A2B 作用于人胃癌細胞SGC-7901 的IC50值分別為26.85、19.58和12.24 μmol/L（圖1A）。同時檢測了A2B作用于正常胃粘膜細胞GES-1 24 h 后的IC50值為48.68 μmol/L（圖1B），通過擬合曲線換算A2B 作用于胃癌細胞24 h 的IC50濃度下，GES-1 細胞相對活力為72.84%?？紤]到后續(xù)其他細胞功能學實驗細胞存活狀態(tài)，故將后續(xù)部分實驗條件設定為10 和20 μmol/L A2B 作用于SGC-7901細胞24 h。

Figure 1.The viability of SGC-7901 cells （A） and GES-1 cells （B） was decreased after treatment with A2B （CCK-8 assay）.Mean±SD.n=3.圖1 A2B抑制人胃癌細胞SGC-7901及正常胃粘膜細胞GES-1的活力

2 A2B 對人胃癌細胞SGC-7901 中EGFR、HER2及c-Met蛋白表達的影響

Western blot 實驗結果顯示，與溶劑（vehicle）組相比，A2B （10 μmol/L）組中EGFR和HER2蛋白表達量顯著減少（P<0.01），而c-Met蛋白表達量無顯著變化，A2B （20 μmol/L）組中EGFR、HER2 及c-Met 蛋白表達量均顯著減少（P<0.01），見圖2。

Figure 2.A2B down-regulated the protein expression of EGFR， HER2 and c-Met in SGC-7901 cells.The protein expression levels of EGFR， HER2 and c-Met in SGC-7901 cells treated with 10 and 20 μmol/L A2B for 24 h were measured by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs vehicle group； △P<0.05， △△P<0.01 vs A2B （10 μmol/L） group.圖2 A2B下調人胃癌細胞SGC-7901中EGFR、HER2和c-Met蛋白的表達水平

3 A2B對人胃癌細胞SGC-7901增殖能力的影響

EdU 染色實驗結果顯示，與vehicle 組相比，A2B（10 μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中EdU+細胞比例顯著減少且活細胞數(shù)也逐漸減少（P<0.01）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組中EdU+細胞比例下降更為顯著（P<0.01），見圖3A。平板集落形成實驗結果顯示，與vehicle 組相比，A2B（10μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中集落數(shù)顯著減少（P<0.01），見圖3B。

Figure 3.Effect of A2B on the proliferation of SGC-7901 cells.A： the numbers of EdU+ cells were decreased after treatment with 10 and 20 μmol/L A2B for 24 h （EdU staining， scale bar=100 μm）； B： SGC-7901 cells showed weak proliferation ability with fewer colony counts after treatment with 10 and 20 μmol/L A2B for 24 h in the plate colony formation assay.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs vehicle group； △△P<0.01 vs A2B （10 μmol/L） group.圖3 A2B對人胃癌細胞SGC-7901增殖能力的影響

4 A2B對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染法結果顯示，與vehicle組相比，A2B （10 μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中細胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組的細胞凋亡率增加更為顯著（P<0.01），見圖4A。JC-1 染色法結果顯示，與溶劑（vehicle）組相比，A2B （10 μmol/L）組和A2B（20 μmol/L）組中JC-1 綠色熒光比例顯著增加（P<0.01）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組的JC-1 綠色熒光比例增加更為顯著（P<0.05），見圖4B。利用Western blot 檢測凋亡相關蛋白，與溶劑組相比，A2B （10 μmol/L）組中caspase-3 表達量顯著減少（P<0.05），A2B （20 μmol/L）組中Bax/Bcl-2 和cleaved caspase-3 表達量顯著增加且caspase-3 表達量顯著減少（P<0.05）；與A2B （10 μmol/L）組相比，20 μmol/L A2B 對Bax/Bcl-2 和caspase-3 的調控更加顯著（P<0.05），見圖4C。

5 A2B 對 人 胃 癌 細 胞SGC-7901 中PI3K/Akt 信 號通路蛋白表達的影響

Western blot 結果顯示，與vehicle 組相比，A2B（10 μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中p-Akt/Akt 比值均顯著減少（P<0.05）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組中p-Akt/Akt 比值減少更為顯著（P<0.05），見圖5。

Figure 5.A2B down-regulated the ratio of p-Akt/Akt in SGC-7901 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs vehicle group； △P<0.05 vs A2B （10 μmol/L） group.圖5 A2B下調人胃癌細胞SGC-7901中p-Akt/Akt比值

討 論

目前，臨床上胃癌治療應用的分子靶向藥物主要分為單克隆抗體、小分子抑制劑和抗體偶聯(lián)藥物。分子靶向藥物可通過阻斷腫瘤細胞異?；罨男盘柾坊蛞种七^表達的靶標，從而達到抗腫瘤的目的［16］。

小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 是一種含有螺環(huán)結構的氨基嘧啶類化合物，由來那替尼和新型c-Met抑制劑MET-2作為先導結構設計合成。前期實驗結果已證實A2B 對野生型EGFR 和HER2 的抑制效果與來那替尼抑制效果相當［8］，但其對胃癌細胞的作用及分子機制尚不清楚。本研究通過體外實驗驗證了A2B 能夠抑制人胃癌細胞SGC-7901增殖。CCK-8實驗結果顯示A2B 呈時間-濃度依賴性抑制SGC-7901 細胞活力，且對正常胃粘膜細胞GES-1 活力影響小于SGC-7901 細胞。EdU 細胞染色實驗和平板集落形成實驗結果都進一步證實了A2B 能顯著抑制SGC-7901細胞的增殖能力。

EGFR、HER2及c-Met同屬于酪氨酸激酶受體家族，是近年來胃癌分子靶向藥物的“明星靶點”。Fu等［9］研究表明丹皮酚能夠顯著下調HER2，抑制NFκB 信號通路的激活，從而抑制SGC-7901 細胞增殖、誘導細胞凋亡。作為合成A2B 的先導結構，來那替尼能夠選擇性抑制HER2 和EGFR 的表達，而MET-2是一種新型c-Met 抑制劑。研究表明EGFR 抑制劑的耐藥機制與MET基因擴增有關［20］，故基于來那替尼與MET-2 的結構優(yōu)化或許可打破EGFR 抑制劑的耐藥。本研究通過Western blot 實驗檢測到10μmol/L A2B 能夠顯著下調EGFR 和HER2 蛋白表達水平，而20 μmol/L A2B 能夠同時下調EGFR、HER2及c-Met蛋白表達水平。以上結果說明，在分子生物學基礎上A2B 對EGFR、HER2 及c-Met 的靶向作用與其藥物設計目標一致。

細胞凋亡屬于細胞程序性死亡的一種，細胞凋亡調控與胃黏膜組織的癌變過程存在聯(lián)系［10］。內源性線粒體途徑是細胞凋亡發(fā)生的途徑之一，其早期標志性事件是線粒體膜電位的破壞。Li 等［19］研究表明中草藥花椒提取物可通過破壞人肝癌細胞的線粒體膜電位，激活細胞線粒體凋亡途徑、抑制腫瘤細胞增殖。本研究通過AnnexinV-FITC/PI 雙染法和JC-1染色法證實了A2B 實驗組中SGC-7901 細胞凋亡率增加且細胞線粒體膜電位降低?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax 同屬于Bcl-2 家族，研究表明通過調控兩者蛋白表達能夠激活caspase-9、caspase-3 及其下游底物PARP 進而誘發(fā)細胞凋亡［11，14］。本研究結果顯示經A2B 處理后SGC-7901 細胞中caspase-3蛋白表達水平下調，Bax/Bcl-2 比值及cleaved caspase-3蛋白表達水平上調，進一步說明A2B能夠激活SGC-7901細胞中線粒體凋亡途徑，誘導細胞凋亡。

PI3K/Akt 信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，抑制PI3K/Akt信號通路的異常激活能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡和自噬［12-13，15］。同時PI3K/Akt信號通路是EGFR、HER2和c-Met三者共同作用的下游通路［4-6］。本研究檢測到經A2B 處理后SGC-7901 細胞中Akt 磷酸化水平顯著降低，同時影響了PI3K/Akt信號通路下游線粒體途徑中Bax 和Bcl-2 的表達，表明A2B 可能通過抑制SGC-7901細胞中PI3K/Akt信號通路激活誘導細胞凋亡。

綜上所述，本研究以小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 為切入點，驗證了A2B 在人胃癌細胞SGC-7901中能夠同時抑制EGFR、HER2 及c-Met 的表達。同時本研究探討了A2B 通過調控PI3K/Akt信號通路誘導人胃癌細胞SGC-7901 發(fā)生線粒體凋亡的分子機制。下一步我們將通過建立胃癌細胞荷瘤裸鼠模型驗證體內實驗是否與體外實驗結果一致。