腺苷酸基琥珀酸裂解酶在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

曾德余，羅嘉，陶一明，裴雷，殷先利

（湖南省腫瘤醫(yī)院 1.消化泌尿內(nèi)科 2.外科，湖南 長沙 410031；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410008；4.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410011）

胃癌（gastric cancer，GC）每年新發(fā)病例超過100萬例[1]，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[2]。局部晚期GC，單獨手術(shù)通常不能治愈。研究[3]表明，新輔助化療為局部晚期GC帶來新的契機(jī)，新輔助化療對提高局部晚期GC的整體療效也得到認(rèn)可。對于局部晚期GC，新輔助化療可以提高陰性切緣R0切除率，使得GC患者生存獲益[4]。更新的中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）指南[5]，強(qiáng)調(diào)對于非轉(zhuǎn)移性GC的綜合治療，應(yīng)該重視新輔助治療。然而，目前缺乏用于GC患者新輔助化療選擇的生物標(biāo)志物，GC患者的總體生存率仍不理想，對于GC化療耐藥機(jī)制的深入了解也十分有限[6]。因此，分析潛在機(jī)制并找到可能的臨床治療靶點有重要價值。

腺苷酸基琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）是嘌呤從頭生物合成一磷酸腺苷（AMP）的必需酶[7]。新近研究表明，ADSL在結(jié)直腸癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、子宮內(nèi)膜樣癌[11]和肝癌[12]中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。然而，它在GC發(fā)展中的作用在很大程度上未知。本研究通過生物信息學(xué)方法結(jié)合新輔助化療GC臨床組織標(biāo)本檢測，初步探討ADSL在GC中的作用及其與新輔助化療的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 GC組織標(biāo)本

選擇2016年1月—2021年12月間湖南省腫瘤醫(yī)院收治的24例接受新輔助化療的局部晚期GC病例，其中SOX方案5例、XELOX方案7例、FLOT方案12例。SOX方案：奧沙利鉑130 mg/m2，第1天，替吉奧80 mg/m2，第1～14天，3周為1個周期。XELOX方案：奧沙利鉑130 mg/m2，第1天，卡培他濱1 000 mg/ m2，第1～14天，3周為1個周期。FLOT方案：多西他賽60 mg/m2，第1天，奧沙利鉑85 mg/m2，第1天、亞葉酸200 mg/m2，第1天，5-氟尿嘧啶2 600 mg/m2，48 h靜脈輸注，2周為1個周期，2～4個周期化療完成后3周進(jìn)行手術(shù)。GC患者接受新輔助化療周期結(jié)束后，通過胃鏡檢查、增強(qiáng)CT或MRI通過計算腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來評估腫瘤對新輔助化療的反應(yīng)，行胃切除術(shù)，術(shù)后組織病理學(xué)檢測確診為腺癌。收集GC組織和配對的距腫瘤外緣至少5 cm的相應(yīng)正常黏膜組織。手術(shù)切除后立即收集樣品并在液氮中快速冷凍，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。手術(shù)標(biāo)本采集均已被告知并簽署書面知情同意書。本課題研究內(nèi)容已通過湖南省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（批件號：2022078）。

1.2 數(shù)據(jù)庫分析

1.2.1 TNMplot數(shù)據(jù)庫 TNMplot（https://www.tnmplot.com）包括來自GEO的Genechip差異基因表達(dá)分析（3 691個正常、29 376個腫瘤和453個轉(zhuǎn)移樣本）和來TCGA的RNA-seq差異基因表達(dá)分析（730個正常、9 886個腫瘤和394個轉(zhuǎn)移樣本）[13]。使用該數(shù)據(jù)庫比較和分析ADSL在正常組織和癌組織中的表達(dá)。

1.2.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是用于分析癌癥OMICS數(shù)據(jù)（TCGA和MET500）開放的數(shù)據(jù)庫[14]，提供泛癌基因表達(dá)和基于基因表達(dá)的患者生存信息的分析結(jié)果，ADSL基因表達(dá)與GC預(yù)后的分析使用UALCAN。

1.2.3 人類蛋白表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫 人類蛋白表達(dá)圖譜（HPA）是一個在線數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org），包含近20種癌組織和48種正常組織的免疫組化蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，本研究通過免疫組化圖像比較了ADSL蛋白在正常胃組織和GC組織中表達(dá)的定位。

1.2.4 STRING數(shù)據(jù)庫 通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）進(jìn)行ADSL表達(dá)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）分析。使用DAVID數(shù)據(jù)庫在線工具對ADSL基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。

1.3 熒光定量PCR

約50 mg配對GC組織樣本冰上勻漿后，使用TRIzolTM RNA Purification試劑盒（Invitrogen，貨號12183555）從組織中提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取物的完整性。取1 μg RNA合成互補(bǔ)DNA（cDNA），按Merck公司RT-PCR第一條鏈cDNA合成試劑盒（AMV，貨號11483188001）操作說明書進(jìn)行。定量PCR檢測引物序列設(shè)計和擴(kuò)增反應(yīng)條件參考PrimerBank[15]。ADSL（ID183227686c 2）上游引物序列：5'-ACA TTG GGT TTG CCT ATC ACA G-3'；下游引物序列：5'-GCC ATC ACA TCA TGT CGT AAA CG-3'，GAPDH作為實時PCR的內(nèi)參對照，GAPDH（ID378404907c3）上游引物序列：5'-CTG GGC TAC ACT GAG CAC C-3'；下游引物序列：5'-AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3'。使用iTaq SYBR Green Mix（Bio-Rad公司，貨號720001564），30個循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小116 kb，退火溫度60 ℃。進(jìn)行實時定量PCR分析基因表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

TNMplot數(shù)據(jù)庫正常組織和腫瘤組織表達(dá)差異比較使用Wilcoxon檢驗。UALCAN數(shù)據(jù)庫使用Kaplan-Meier統(tǒng)計分析整體生存率。驗證隊列mRNA表達(dá)比較采用配對t檢驗，用GraphPad Prism Version 9.02軟件分析制圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSL在GC組織中的表達(dá)

使用TNM plot分析了TCGA隊列中的配對GC和正常組織中的表達(dá)（圖1A）。與正常胃組織相比，腫瘤組織中的ADSL mRNA表達(dá)明顯增加（P=1.11e-20）。HPA數(shù)據(jù)庫圖像顯示，與正常胃組織樣本切片相比，在GC腫瘤組織切片中觀察到更深的ADSL染色。

圖1 ADSL在GC中的表達(dá) A：TNMplot分析ADSL基因在GC于正常組織中的表達(dá)；B：HPA中ADSL蛋白在GC和正常組織中的表達(dá)

2.2 ADSL表達(dá)與GC預(yù)后的關(guān)系

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫探討了ADSL mRNA表達(dá)預(yù)測GC患者的預(yù)后價值，結(jié)果表明，ADSL高表達(dá)的GC患者的生存率更低（P=0.018）（圖2）。

圖2 GC中ADSL表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 ADSL蛋白相互作用的分析

為了進(jìn)一步研究ADSL在GC中的分子作用基礎(chǔ)，將ADSL引入STRING數(shù)據(jù)庫以獲得功能性蛋白質(zhì)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。與ADSL相關(guān)的功能性蛋白表達(dá)PPI網(wǎng)絡(luò)包含腺苷脫氨酶（ADA）、腺苷激酶（ADK）、磷酸腺苷脫氨酶3（AMPD3）、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（APRT）、ASS1、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶（ATIC）、二氫葉酸還原酶（DHFR）、磷酸核糖基甘氨酰胺甲?；D(zhuǎn)移酶（GART）、甲?；臍淙~酸合成酶（MTHFD1）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（MTHFD1L）、亞甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶（MTHFD2）、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶（PAICS）、磷酸核糖甲?；拾彪吆厦福≒FAS）、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1（SHMT1）。其中ADK、PFAS、ATIC、PAICS、GART的可信度評分分別為0.992、0.997、0.987、0.999。由TCGA-GC患者數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ADSL表達(dá)與ADK、PFAS、ATIC、PAICS、GART呈明顯正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.28、0.47、0.32、0.35、0.35（圖3B）。

圖3 ADSL相關(guān)作用分子的分析 A：STRING數(shù)據(jù)庫分析ADSL相關(guān)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；B：TCGA隊列GC患者ADSL相互作用基因的相關(guān)性分析

2.4 ADSL表達(dá)調(diào)控相關(guān)信號通路及功能的預(yù)測分析

用DAVID對ADSL及其相互分子進(jìn)行KEGG通路分析（圖4A）和GO功能富集分析（圖4B）。KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSL過表達(dá)涉及p53信號通路、Wnt信號通路、miroRNA調(diào)控以及細(xì)胞周期；ADSL低表達(dá)涉及氮素代謝、果糖和甘露糖的代謝、黏蛋白型O-聚糖的生物合成、甘油脂代謝。GO富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSL過表達(dá)涉及有絲分裂細(xì)胞周期、有絲分裂細(xì)胞周期檢查點、細(xì)胞周期檢查點的調(diào)控；ADSL低表達(dá)有利于維護(hù)胃腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和組織穩(wěn)態(tài)。

2.5 新輔助化療后GC腫瘤組織中ADSL表達(dá)的變化

為探討新輔助化療和ADSL表達(dá)的關(guān)系，通過熒光定量PCR檢測了新輔助化療后GC腫瘤組織中ADSL表達(dá)的情況，結(jié)果顯示：SOX方案組、XELOX方案組、FLOT方案組ADSL mRNA在GC組中表達(dá)水平分別為：3.27±1.34、2.66±0.98、2.47±0.79；明顯高于正常胃組織中的ADSL mRNA表達(dá)1.25±0.2、1.21±0.39、1.13±0.33（圖5）。與XELOX組和SOX組比較，F(xiàn)LOT方案組有更高的臨床客觀緩解率，更低的ADSL mRNA表達(dá)。

圖5 新輔助化療后GC組織和鄰近的非腫瘤胃組織中的ADSL mRNA表達(dá) A：SOX方案組；B：XELOX方案組；C：FLOT方案組

3 討 論

研究[8,16]表明，ADSL的抑制通過破壞從頭嘌呤合成途徑來減少AMP合成。較低的AMP水平會導(dǎo)致氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP減少，從而導(dǎo)致線粒體應(yīng)激。較低的ATP水平誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在S期。線粒體功能障礙可以通過一系列應(yīng)激反應(yīng)途徑減少，包括ATF5介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）途徑。而未得以解決的線粒體應(yīng)激可能導(dǎo)致癌細(xì)胞周期停滯和程序性細(xì)胞死亡。越來越多的證據(jù)表明，核苷酸合成和線粒體功能之間存在串?dāng)_—嘌呤從頭合成通過介導(dǎo)ATP產(chǎn)生來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長治療抵抗[17]，而線粒體ATP在癌癥增殖中促進(jìn)核苷酸合成。線粒體壓力也可以激活從頭嘌呤合成途徑促進(jìn)癌細(xì)胞生長[18]。已報道的證據(jù)發(fā)現(xiàn)ADSL過表達(dá)GC的細(xì)胞周期密切相關(guān)。

新輔助化療后進(jìn)行腹腔鏡D2胃切除術(shù)，對晚期可切除的GC是有效和安全的[19]。FLOT方案在進(jìn)展期GC患者的病理反應(yīng)和生存率方面顯示出優(yōu)勢。在本研究中，F(xiàn)LOT方案與兩藥方案XELOX組、SOX組對比，前者表現(xiàn)出更高的臨床客觀緩解率，而且筆者通過組織樣本驗證了新輔助化療和ADSL表達(dá)可能的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)果提示，F(xiàn)LOT方案的療效可能與下調(diào)ADSL mRNA表達(dá)有關(guān)。在本研究中，通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)在GC中ADSL過表達(dá)涉及miroRNA調(diào)控以及細(xì)胞周期的調(diào)控。這與新近的腫瘤研究發(fā)現(xiàn)基本相一致，Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)miR-21-5p和miR-21-3p的上調(diào)可調(diào)節(jié)嘌呤代謝，導(dǎo)致藥物耐受性增加。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)表明，與親代細(xì)胞相比，嘌呤代謝是DTPC中的主要途徑。靶向miR-21部分挽救了DTPC中嘌呤代謝物的變化。在miR-21敲低后，ADSL的表達(dá)減少被逆轉(zhuǎn)。ADSL是從頭嘌呤生物合成途徑中的一種必需酶，通過將磷酸核糖基氨基咪唑琥珀酰胺轉(zhuǎn)化為氨基咪唑甲酰胺核苷，以及將腺苷酸琥珀酸轉(zhuǎn)化為AMP。但是ADSL和miR-21在GC中的調(diào)控作用仍然有待開展基礎(chǔ)實驗進(jìn)一步予以證明。

綜上所述，ADSL在GC呈高表達(dá)，其過表達(dá)可以預(yù)測不良臨床預(yù)后。ADSL調(diào)控的嘌呤從頭合成途徑可能參與GC的發(fā)生發(fā)展。ADSL有望成為進(jìn)展期GC新輔助化療療效的標(biāo)志物。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：曾德余負(fù)責(zé)課題設(shè)計、課題資助、文稿撰寫；羅嘉負(fù)責(zé)組織樣本采集；陶一明協(xié)助課題設(shè)計；裴雷負(fù)責(zé)組織樣本檢測；殷先利負(fù)責(zé)課題資助、文稿評閱修改建議。