室溫下多色可調(diào)發(fā)光碳點的制備及其在血紅蛋白靈敏檢測中的應(yīng)用

何燕萍, 王 昕, 李昊陽, 李 棟, 陳縉泉, 徐建華

華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室, 上海 200241

引 言

一種新的碳基納米材料, 熒光碳點(carbon dots, CDs)在這幾年引起了大家的廣泛關(guān)注。 由于其具有高穩(wěn)定性、 良好的生物相容性、 可調(diào)諧的發(fā)光波長以及優(yōu)異的電子特性等[1], 有望成為一種非常有前途的光學(xué)納米探針。 目前已在光催化、 生物醫(yī)學(xué)、 傳感和細(xì)胞成像等多個領(lǐng)域得到應(yīng)用[2]。

碳點的合成一般分為兩大類。 一類方法主要是通過化學(xué)或物理手段將大塊碳材料分解為更小的碳材料, 整個過程的核心是碳原子間化學(xué)鍵的斷裂, 主要方法有電弧放電和激光燒蝕等。 另外一類方法主要是有機小分子通過熱解或碳化最終形成碳點, 合成方法主要包括溶劑熱處理法[3]、 常規(guī)熱分解(碳化、 熱解)、 微波輔助熱解、 超聲波處理以及電化學(xué)合成等方法。 這些傳統(tǒng)的合成方法在合成過程中通常會涉及到有毒的化學(xué)試劑或有機溶劑, 在反應(yīng)過程中還需要較高的能耗、 復(fù)雜的實驗裝置以及復(fù)雜的實驗操作等。 從原料的選取、 時間成本以及所需能耗來看, 并不符合綠色化學(xué)的要求。 為了達(dá)到更低的經(jīng)濟以及環(huán)境成本, 開發(fā)一種“更綠色”的方法來合成碳點是很有必要的。 本研究將果糖溶液與堿性溶液混合, 將它們在常溫下放置一段相對較短的時間后透析即可獲得碳點[4]。 與其他合成方法相比, 該合成辦法不需要強酸催化劑、 外部加熱以及額外的能量輸入, 更為簡單、 節(jié)能以及高效。

目前大多數(shù)報道的碳點的熒光發(fā)射波長較短[1, 5], 而短波長的光會破壞活細(xì)胞以及生物系統(tǒng), 特別是對于在室溫下合成的碳點, 更難達(dá)到長波長發(fā)射。 因此, 在室溫下合成在長波長處發(fā)射的碳點具有重要意義, 可以為生物分子檢測提供一個更有前景的平臺。 而本研究合成的碳點在425 nm波長的光的激發(fā)下, 最大發(fā)射峰位于535 nm, 為用于生物分子檢測的熒光探針研究提供了更多支持。

血紅蛋白(hemoglobin, Hb)作為生物體內(nèi)紅細(xì)胞的重要組成部分, 主要功能是攜帶和運輸氧氣, 調(diào)節(jié)血液的pH值等[6], 在生命活動中具有十分重要的意義。 觀測血紅蛋白的含量是否穩(wěn)定對于生命體的健康評估是十分必要的。 在紅細(xì)胞中, 血紅蛋白約占蛋白質(zhì)總量的90%, 及時觀測Hb含量是否在正常范圍內(nèi), 可以有效預(yù)防白血病、 貧血癥和癌癥等許多疾病的產(chǎn)生。 若能定量檢測生物體內(nèi)的Hb含量, 將對生命科學(xué)研究和臨床診斷提供重要的技術(shù)支持。 除此之外, 在刑偵領(lǐng)域, 若能對低濃度的血紅蛋白進(jìn)行高效檢測, 將具有重要的應(yīng)用價值。 牛血紅蛋白(bovine hemoglobin, BHb)與Hb在結(jié)構(gòu)以及光譜特性上具有極高的相似性。 由于BHb來源獲取更為簡單, 已被廣泛用作HHb的模型物, 應(yīng)用于各種光譜研究和機理分析[7]。

此前已經(jīng)有文獻(xiàn)報道了幾種用于定量檢測血紅蛋白的分析方法, 例如熒光法[8]、 電化學(xué)法和比色法等, 其中基于碳點熒光猝滅的檢測方法由于成本低、 檢測速度快、 靈敏度高而備受關(guān)注, 然而此前的工作對其熒光猝滅的機理研究還不夠充分[9]。 2014年Chang等將碳點應(yīng)用于血紅蛋白的檢測中, 通過電化學(xué)方法以甘氨酸為前體合成了碳點, 但該文章的重點在于如何檢測血紅蛋白, 并沒有過多地分析其猝滅的機制[10]。

本研究通過堿催化的方法合成了碳點, 并用該碳點實現(xiàn)了對微量牛血紅蛋白的特異性檢測。 該碳點在不同波長激發(fā)下, 對BHb的檢測都有較好的線性響應(yīng), 合成方法也較為簡單, 可以更加高效、 便捷地檢測血紅蛋白。 我們通過紫外可見分光光度計(UV-Vis)、 穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀、 透射電子顯微鏡(TEM)以及皮秒時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)(TCSPC)對合成碳點的性質(zhì)進(jìn)行了分析, 研究了BHb對碳點熒光的猝滅機制, 計算BHb猝滅碳點熒光的猝滅速率常數(shù), 以及兩者之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù), 并通過圓二色分光光度計(CD)分析BHb在該過程中結(jié)構(gòu)的變化。

1 實驗部分

1.1 儀器及設(shè)置

使用紫外-可見分光光度計(TU1901)來測量穩(wěn)態(tài)吸收光譜, 探測范圍為190～650 nm。 穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜通過穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(FluoroMax-4)進(jìn)行測量, 設(shè)置激發(fā)波長和發(fā)射波長的范圍分別為340～425和360～830 nm。

時間分辨熒光光譜在實驗室自行搭建的TCSPC系統(tǒng)上測量。 在該系統(tǒng)中, 使用英國Fianium公司的皮秒連續(xù)光纖激光器產(chǎn)生中心波長為425 nm, 重復(fù)頻率為20 MHz的激發(fā)脈沖。 通過獨立的時間相關(guān)單光子計數(shù)模塊和單光子計數(shù)光電倍增管記錄熒光。 將二氧化硅納米顆粒水溶液作為樣品對其瑞利散射進(jìn)行檢測, 得到儀器響應(yīng)函數(shù)(IRF)約為200 ps。 有關(guān)該系統(tǒng)的更多詳細(xì)信息, 可參見文獻(xiàn)[11]。

碳點的透射電鏡圖由上海島津?qū)嶒炂鞑挠邢薰镜碾娮语@微鏡(JEOL2100F)獲得。 BHb的CD光譜通過日本JASCO公司的圓二色分光光度計(J-1500)測量, 范圍在190～260 nm之間, 測試過程中全程通氮氣。

(1)規(guī)范性原則。在電網(wǎng)“三集五大”重要戰(zhàn)略要求下，運營在線監(jiān)測系統(tǒng)架構(gòu)設(shè)計各部分內(nèi)容，應(yīng)該按照電力企業(yè)相關(guān)技術(shù)規(guī)范、架構(gòu)設(shè)計規(guī)范等要求進(jìn)行設(shè)計。

1.2 樣品制備

使用的果糖、 牛血紅蛋白(分子量約為64 500)、 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉二水合物均購買于阿拉丁公司, 氫氧化鈉購買于國藥集團。 將磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉二水合物以一定比例混合得到磷酸鹽(PB)緩沖液(10 mmol·L-1, pH≈7.1), 若無額外提及, 溶劑均為上述緩沖液。

實驗合成的碳點以果糖作為前體, 氫氧化鈉作為催化劑。 分別將果糖和氫氧化鈉溶于去離子水, 制成500 mmol·L-1的溶液作為母液, 將兩者以一比一的比例混合, 最終溶液中果糖和氫氧化鈉的濃度皆為250 mmol·L-1, 放置一段時間后進(jìn)行透析即可得到碳點, 該過程僅需將兩個溶液混合靜置, 無需加熱和其他能源輸入。 將兩個溶液以一比一的比例混合靜置一周后, 用截留分子量為500D的透析袋進(jìn)行透析, 透析24 h后, 將所得水溶性碳點溶液放入凍干機中真空干燥36 h以獲得固體碳點粉末, 凍干產(chǎn)率約為4.99%。

分別稱取BHb樣品以及凍干后的碳點粉末溶于PB緩沖液中, 作為一級儲備液, 濃度分別為10 mmol·L-1和0.184 g·mL-1, 并保存在低溫(4 ℃)且避光的環(huán)境中。 實驗時取1.5 mL碳點的一級儲備液, 根據(jù)所需BHb濃度加入不同體積的BHb一級儲備液與之混合, 最后加入適當(dāng)體積的PB緩沖液使得最后溶液體積保持在3 mL。 若無特別提及, 本文溶液中碳點的濃度為0.092 g·mL-1, BHb的濃度為0～5 μmol·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點的表征

通過對碳點的電鏡圖像的測量以及對它粒徑分布情況的統(tǒng)計(如圖1), 結(jié)果顯示得到的碳點為球狀, 且分散性良好。 為了避免碳點聚集從而影響粒徑大小的測量, 實驗選取了碳點分布較為分散的區(qū)域, 測量碳點的粒徑大小分布在5.5～11.5 nm之間, 平均粒徑大小約為8.2 nm。

為了進(jìn)一步分析碳點晶面間的距離, 我們采取了更高的分辨率, 測量的高分辨電鏡圖如圖2所示, 測得碳點的晶面間距約為0.33 nm, 根據(jù)文獻(xiàn)報道為石墨的(003)晶面[4]。

圖2 碳點的高分辨電鏡圖

2.2 BHb對碳點熒光的猝滅

為了分析BHb對碳點光譜的影響, 我們將碳點與不同濃度的BHb混合, 測量混合溶液的熒光發(fā)射光譜以及吸收光譜。 在圖4(a)中, 藍(lán)色和黑色的曲線分別代表碳點和BHb的吸收光譜, 其中BHb的濃度為0.25 μmol·L-1, 碳點的濃度是4.6 mg·mL-1, 紅色曲線是兩者混合后的吸收光譜(已考慮兩溶液混合帶來的濃度降低的影響), 發(fā)現(xiàn)混合后的吸收光譜約為兩個樣品單獨存在時的吸收光譜之和。 圖4(b)顯示的是加入不同濃度的BHb后碳點的熒光發(fā)射光譜。 結(jié)果表明, BHb會猝滅碳點的熒光, 加入的BHb濃度越高, 碳點熒光下降的比例就越大。 圖中熒光強度已經(jīng)過歸一化處理。

圖4 碳點和BHb的吸收光譜(a)以及加入不同濃度BHb后碳點的熒光發(fā)射光譜(b)

2.2.2 猝滅機制

根據(jù)猝滅機理的不同, 熒光猝滅被分為動態(tài)和靜態(tài)兩種形式。 靜態(tài)猝滅的原理是, 部分熒光分子與猝滅劑結(jié)合, 形成的絡(luò)合物不會發(fā)出熒光, 從而導(dǎo)致熒光分子的熒光強度減弱。 動態(tài)猝滅的原理是, 部分熒光分子處于激發(fā)態(tài)時, 與猝滅劑分子發(fā)生了碰撞或其他相互作用, 失活后直接回到基態(tài), 從而使熒光強度降低。 常用Stern-Volmer方程來對熒光猝滅的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 見式(1)。

(1)

式(1)中,F0和F分別表示加入BHb前后碳點的熒光強度,kq為雙分子猝滅速率常數(shù), [Q]表示加入的BHb的濃度,τ0為未加BHb時碳點的熒光壽命。 根據(jù)Stern-Volmer方程作出碳點的熒光強度下降比例隨BHb濃度變化的關(guān)系曲線, 如圖5(a)所示, 可以看到, 碳點的熒光下降程度F0/F和BHb濃度之間表現(xiàn)為很好的線性關(guān)系, 由Stern-Volmer方程計算可得在295 K下,kq的值約為5.72×1013L·mol-1·s-1, 比最大擴散速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·s-1)大幾個量級, 表明BHb對碳點熒光的猝滅是一個靜態(tài)的過程[16]。 除此之外, 這兩種猝滅形式還可以根據(jù)不同溫度下的猝滅速率常數(shù)來進(jìn)行判斷。

圖5 在不同反應(yīng)溫度下碳點熒光隨BHb濃度變化的Stern-Volmer圖(a), (b)

在較高的溫度下, 熒光分子和猝滅劑之間的碰撞比較劇烈。 因此隨著溫度的升高, 動態(tài)猝滅的猝滅速率常數(shù)也隨之增大。 在靜態(tài)猝滅的情況下, 高溫不利于復(fù)合物形成, 因此隨著溫度的升高, 靜態(tài)猝滅的猝滅速率常數(shù)也隨之減小。 從圖5(a)中觀察發(fā)現(xiàn), 溫度越高, Stern-Volmer圖線的斜率越低, 也就是猝滅速率常數(shù)越小, 因此該過程是靜態(tài)猝滅過程, 求得猝滅速率常數(shù)如表1所示。 由式(2), 可進(jìn)一步求得結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n, 在三個溫度下, 分別作出熒光變化量的對數(shù)形式隨BHb濃度的對數(shù)的變化曲線, 經(jīng)過線性擬合, 求得結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)如表1所示。 在不同的溫度下, 結(jié)合位點數(shù)都在1附近, 表明在碳點和BHb之間有一個結(jié)合位點。 在295 K下, 結(jié)合常數(shù)為2.94×105L·mol-1, 較高的結(jié)合常數(shù)表明碳點和BHb之間有一個比較強的結(jié)合。 隨著溫度升高, 結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點數(shù)皆有一定程度的下降, 進(jìn)一步證明了BHb對碳點熒光的猝滅是一個靜態(tài)的過程。

表1 在不同溫度下的猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)

(2)

為了獲得更直接的證據(jù)證明兩者之間發(fā)生了靜態(tài)猝滅, 我們測量了碳點的熒光壽命在猝滅過程是否發(fā)生改變。 由圖6(a)可知, 加入不同濃度的BHb, 碳點的熒光壽命基本保持不變, 經(jīng)擬合, 碳點的熒光壽命約為1.7 ns, 激發(fā)和探測的波長分別為425和535 nm。

圖6 加入不同濃度BHb后碳點的時間分辨熒光光譜(a)以及加入碳點前后BHb的圓二色譜(b)

2.2.3 圓二色譜

(3)

(4)

式(3)和式(4)中,c為蛋白的濃度, 實驗選用的BHb的濃度為5 μmol·L-1;n為蛋白質(zhì)中氨基酸的數(shù)量, 根據(jù)文獻(xiàn)報道為574[19];l為光程, 為2 mm; MRE209 nm則代表209 nm處BHb的平均殘基橢圓率。 計算后發(fā)現(xiàn)加入碳點后BHb的α-螺旋含量由43.1%下降至40.3%, 說明碳點的加入會改變蛋白的結(jié)構(gòu)。

2.3 碳點檢測BHb的性能分析

2.3.1 線性方程與檢測限

我們檢測了不同濃度BHb對于碳點熒光的影響, 發(fā)現(xiàn)加入BHb后碳點的熒光峰值下降, 由圖7(a)可見, 碳點熒光變化F0/F在BHb濃度為0～5 μmol·L-1時, 兩者表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系, 回歸方程為y=0.091 28x+0.994 87, 相關(guān)系數(shù)r為0.998, 在線性方程中BHb濃度的單位為μmol·L-1, 以三倍信噪比計算得到檢測BHb的檢測限為304 nmol·L-1, 相比其他檢測BHb的方法[20], 該碳點檢測BHb也具有比較低的檢測限。 除此之外, 由于碳點具有可調(diào)諧熒光的特性, 當(dāng)激發(fā)波長由425 nm減小為370 nm, 熒光峰也會發(fā)生一定的藍(lán)移。 利用碳點的該特性, 我們用370 nm的光激發(fā)碳點, 觀察BHb對碳點熒光的影響, 也呈現(xiàn)與425 nm的光激發(fā)相似的實驗結(jié)果, 如圖7(b), 線性回歸方程為y=0.095 96x+0.987 51, 在線性方程中BHb濃度的單位為μmol·L-1, 相關(guān)系數(shù)r為0.998, 檢測限為243 nmol·L-1, 同樣可以實現(xiàn)對微量血紅蛋白的檢測。 除此之外, 我們通過不同緩沖液的實驗證實, 在Tris緩沖液中, 加入BHb后碳點的熒光特性與碳點在PB緩沖液中的實驗結(jié)果結(jié)論相同, 表明不同的緩沖液體系對于熒光碳點檢測BHb沒有影響。

圖7 碳點熒光變化與BHb濃度在0～5 μmol·L-1之間的線性關(guān)系, 激發(fā)波長分別為425 nm(a)和370 nm(b)

2.3.2 選擇性與熒光穩(wěn)定性

為了評估該碳點檢測BHb的選擇性, 我們選擇了生物體血液中存在的7種常見的氨基酸或蛋白質(zhì), 包括牛血清白蛋白、 色氨酸、 酪氨酸、 丙氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸以及蛋氨酸, 分別與碳點混合, 測量在不同體系下, 碳點的熒光變化(425 nm激發(fā)), 樣品的濃度均設(shè)置為20 μmol·L-1。 實驗結(jié)果表明只有在碳點/BHb體系中, 熒光有明顯的變化, 證實了合成碳點對血紅蛋白的高選擇性, 結(jié)果如圖8(a)所示。 加入BHb后, BHb與碳點發(fā)生相互作用, 形成復(fù)合物。 碳點熒光強度隨時間變化如圖8(b)所示, 表明用該碳點探針檢測BHb, 碳點的熒光具有較好的穩(wěn)定性。

圖8 基于碳點熒光猝滅檢測血紅蛋白的選擇性(a)以及熒光穩(wěn)定性(b)

3 結(jié) 論

采用化學(xué)方法以果糖和氫氧化鈉為原料制備了水溶性發(fā)光碳點, 合成過程遵循綠色化學(xué)原則, 無需加熱等高能耗過程, 需要的儀器設(shè)備簡單, 具有較高的實用性。 合成的碳點可用于微量血紅蛋白的特異性檢測。 通過皮秒時間相關(guān)單光子計數(shù)系統(tǒng)以及熒光溫控實驗證明了血紅蛋白對合成碳點熒光的猝滅是一個靜態(tài)的過程, 兩者之間發(fā)生結(jié)合, 形成了基態(tài)復(fù)合物, 并通過圓二色譜分析發(fā)現(xiàn), 在該過程血紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化, 對其機理進(jìn)行了詳細(xì)的實驗分析。 本研究展示了一種基于發(fā)光碳點熒光猝滅來檢測血紅蛋白的方法, 該方法具有高選擇性, 高穩(wěn)定性以及低成本的優(yōu)勢。