李昊琦，呼慶勛（上海大學醫(yī)學院，上海 200444）

一氧化氮（NO）作為生物體內(nèi)具有生物活性的信號分子，介導多種生物學作用，在生物系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理功能。隨著對NO的深入探索，多項研究表明NO作為一種能在細胞間傳遞信號的分子，普遍存在于多種細胞、組織和器官中，參與心血管穩(wěn)態(tài)[1]、免疫反應[2]、神經(jīng)傳遞[3]以及與細胞凋亡和增殖[4]相關的多種生理病理途徑。

線粒體是參與調(diào)節(jié)各種重要細胞過程的細胞器，除了作為細胞的能量工廠以產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（ATP）外，也在細胞信號傳導、細胞分化、細胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。線粒體通過調(diào)控細胞代謝和表觀遺傳修飾等機制對機體穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，其功能異常將參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來的研究表明NO及其衍生物對線粒體功能的調(diào)控起到重要影響作用，進而影響細胞生理狀態(tài)和疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本文就NO對線粒體功能的調(diào)控機制及其通過調(diào)控線粒體功能參與疾病發(fā)病的機制進行綜述。

1 NO的生物學作用

NO作為一種新型的氣體信號分子，在氮原子上有不成對的電子對，對多種生物分子都具有很高的反應性。作為具有脂溶性的介質(zhì)，NO可以快速透過生物膜擴散發(fā)揮生理作用，但在體內(nèi)具有不穩(wěn)定性，能迅速被血紅蛋白、氧自由基等滅活。

內(nèi)源性NO的產(chǎn)生主要是指在一氧化氮合酶（NOS）催化下，以L-精氨酸和分子氧為底物，在輔助因子四氫生物蝶呤（BH4）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、黃素單核苷酸（FMN）參與下產(chǎn)生。NOS主要包括三種亞型：神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）。在三種亞型中，eNOS主要表達于內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞中，對于維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)是最重要的[7]。nNOS在大腦的特定神經(jīng)元中組成性表達，主要調(diào)節(jié)神經(jīng)信號轉導，在骨骼肌和心肌組織中也有表達。eNOS和nNOS的活性都受Ca2+和鈣調(diào)素（CaM）以及自身翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。iNOS最早被發(fā)現(xiàn)存在于巨噬細胞中，iNOS非鈣離子依賴的特性使其具有較高的催化活性，其催化產(chǎn)生的NO在炎癥條件下的多種生化途徑和能量代謝調(diào)節(jié)中起著核心作用[8]。此外，據(jù)報道，線粒體基質(zhì)和內(nèi)膜中具有線粒體一氧化氮合酶（mtNOS），以調(diào)節(jié)線粒體的耗氧量和生物發(fā)生。mtNOS被認為是nNOS的α亞型，但有關其性質(zhì)尚未有確切定論[9]。除了NOS的催化作用，NO的合成也可以被其氧化代謝物亞硝酸鹽還原，亞硝酸鹽可以通過與質(zhì)子反應或酶促反應轉化為NO。

NO通過激活環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）信號通路和參與細胞功能的各種蛋白質(zhì)（包括參與線粒體生物學的蛋白質(zhì)）的S-亞硝基化來介導大部分功能[10]。NO 可激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），使細胞內(nèi)cGMP增加，啟動一系列蛋白磷酸化反應，從而發(fā)揮重要的生理功能。NO-cGMP信號通路廣泛存在于人類和動物的多種組織細胞中，它代表一種新的細胞間信息傳遞和細胞功能調(diào)節(jié)的信號傳導系統(tǒng)。NO也會通過cGMP非依賴性途徑介導生物學效應，其作用于半胱氨酸殘基，通過S-亞硝基化酶在靶蛋白上產(chǎn)生S-亞硝基硫醇（SNO），稱為S-亞硝基化的翻譯后修飾。

2 NO對線粒體功能的調(diào)控機制

2.1 NO介導靶蛋白的S-亞硝基化修飾

S-亞硝基化是指部分亞硝基與蛋白質(zhì)的巰基殘基（S）共價連接形成S-亞硝基，其動態(tài)過程主要由細胞內(nèi)S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）的水平調(diào)節(jié)。S-亞硝基化是一種基于氧化還原的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，可調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，若發(fā)生異常可能導致蛋白質(zhì)錯誤折疊，發(fā)生細胞凋亡和代謝紊亂[11]。研究表明NO通過介導靶蛋白的S-亞硝基化修飾可以調(diào)控線粒體功能（見圖1）。

圖1 NO介導靶蛋白的S-亞硝基化修飾調(diào)控線粒體功能Fig 1 Nitric oxide mediates the S-nitrosylation modification of target proteins to regulate the mitochondrion function

NO水平的升高會導致三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）中的酶以及電子傳遞鏈（ETC）中蛋白質(zhì)的異常S-亞硝基化，從而損害它們的酶活性。ETC中復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ中關鍵亞基的直接S-亞硝基化或硝化抑制了它們的呼吸活性，從而抑制了它們產(chǎn)生ATP的能力。

GSNO是NO在體內(nèi)的主要生物活性形式，可被亞硝基化谷胱甘肽還原酶（GSNOR）不可逆分解。因此，GSNOR在NO信號途徑中可作為主要調(diào)節(jié)因子以調(diào)控反應發(fā)生。缺乏GSNOR會促進線粒體亞硝化應激，導致動力相關蛋白1（Drp1）和Parkin過度S-亞硝基化，對線粒體動力學和線粒體自噬產(chǎn)生損傷作用[12]。已有研究表明S-亞硝基化可以調(diào)節(jié)Drp1的磷酸化狀態(tài)，從而影響Drp1的定位和功能。Drp1的S-亞硝基化促進Ser-616磷酸化，導致線粒體裂變增加[13]。在GSNOR敲除小鼠的肝臟和大腦中發(fā)現(xiàn)S-亞硝基化的Parkin累積，表明GSNOR缺乏會誘導Parkin異常S-亞硝基化從而抑制Parkin活性，導致線粒體自噬失調(diào)[14]。

2.2 NO調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈活性

NO及其衍生物通過不同的機制抑制線粒體呼吸，低濃度的NO特異性和可逆地抑制細胞色素C氧化酶，較高濃度的NO可導致呼吸鏈不可逆抑制、解偶聯(lián)、通透性轉變或細胞死亡[15]。NO可以與細胞色素C氧化酶的血紅素α3-CuB活性中心結合并抑制其活性。NO與銅離子（CuB）結合，形成一種新的血紅素-CuB-NO配合物，從而阻礙了ETC的正常運作，降低了細胞色素C氧化酶的活性。NO還通過形成不可逆地抑制線粒體呼吸的高反應性分子來發(fā)揮病理生理作用。NO與線粒體氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的超氧化物陰離子反應形成過氧亞硝酸鹽（ONOO-），破壞基質(zhì)、內(nèi)膜、外膜以及膜間空間中的關鍵線粒體組分。在線粒體中，ONOO-抑制復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ在呼吸鏈中的作用和ATP合酶的活性，還影響其他蛋白質(zhì)的活性，如錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和細胞色素C等，導致線粒體功能障礙[16]（見圖2）。

圖2 NO介導線粒體呼吸鏈活性調(diào)控線粒體功能Fig 2 NO mediated mitochondrion respiratory chain activity regulates the mitochondrion function

3 NO調(diào)控線粒體功能在疾病中的作用

3.1 心血管疾病

心血管疾病是全球死亡的主要原因，在心血管疾病的發(fā)生和預防中，NO起著重要的作用。NO在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮保護作用的機制主要包括調(diào)節(jié)血壓和血管張力，抑制血小板聚集和白細胞黏附，防止平滑肌細胞增殖等[17]。NO生物利用度的紊亂會導致心血管系統(tǒng)保護功能的喪失，在某些情況下甚至會加速疾病進程。

線粒體是心肌細胞的能量代謝中心，在維持正常心肌收縮力和心臟活動中發(fā)揮必不可少的作用，因此線粒體已成為心血管系統(tǒng)保護策略的關鍵靶標。NO通過使線粒體呼吸鏈復合體、代謝酶以及線粒體相關蛋白質(zhì)發(fā)生S-亞硝基化以影響其活性與功能，參與不同心血管疾病的發(fā)病機制。早期已有研究發(fā)現(xiàn)NO使線粒體復合物Ⅰ發(fā)生S-亞硝基化，抑制再灌注期間復合物Ⅰ活性的恢復，減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生，減輕心臟再灌注損傷[18]。同樣，Castillo等[19]在離體大鼠心臟缺血再灌注損傷模型中抑制GSNOR，發(fā)現(xiàn)可促進線粒體復合物Ⅲ和Ⅴ發(fā)生S-亞硝基化。用GSNOR抑制劑治療的心臟顯示心肌損傷標志物肌酸激酶的釋放較低，心肌梗死區(qū)域減少，并且改善了缺血后的心室功能，表明S-亞硝基化水平提高在缺血性心臟病中能發(fā)揮一定的心肌保護作用。Siragusa等[20]研究發(fā)現(xiàn)eNOS與內(nèi)皮細胞中的丙酮酸激酶2型（PKM2）相互作用并使其S-亞硝基化，降低其酶活性，PKM2抑制將葡萄糖分解代謝轉向磷酸戊糖途徑，通過磷酸戊糖途徑增加底物通量，以產(chǎn)生還原當量（NADPH和GSH）并防止氧化應激，維持內(nèi)皮的氧化還原狀態(tài)。Tang等[21]研究闡明GSNOR在心肌細胞線粒體定位，通過調(diào)控線粒體蛋白腺嘌呤核苷酸轉位酶1（ADP/ATP translocase 1，ANT1）的S-亞硝基化修飾影響線粒體功能，使得線粒體氧化應激增加并抑制了線粒體自噬，最終導致心肌重構和心力衰竭。因此，推測線粒體GSNOR將會成為心力衰竭的一個新治療靶點，也有研究已證實GSNOR可以通過調(diào)節(jié)線粒體動力學和線粒體自噬相關蛋白的S-亞硝基化水平以維持線粒體穩(wěn)態(tài)并延遲細胞衰老[12]，這表明GSNOR具有間接影響細胞氧化還原狀態(tài)的效力，可以對心血管穩(wěn)態(tài)發(fā)揮一定的保護作用。

綜上研究結果表明，NO除了作為內(nèi)源性血管舒張因子參與對心血管的保護作用外，也可以通過對心肌線粒體的調(diào)控作用來維持心血管穩(wěn)態(tài)。靶向S-亞硝基化修飾正成為保護心血管系統(tǒng)的潛在目標，可以為開發(fā)新的治療策略提供新的途徑，然而一些抑制劑是否會對心血管功能造成不良影響仍需進一步研究。

3.2 神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病

在大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中，線粒體功能紊亂，ROS和活性氮（RNS）的產(chǎn)生增加，從而導致突觸丟失和神經(jīng)元損傷[22]。RNS過量產(chǎn)生會導致NO介導的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如半胱氨酸殘基的S-亞硝基化和酪氨酸殘基的硝化。在阿爾茨海默?。ˋD）中，S-亞硝基化水平升高是其發(fā)病機制之一，且β-淀粉樣蛋白（Aβ）能在NO調(diào)節(jié)下使得Drp1亞硝基化而導致線粒體分裂增加。Nakamura等[23]發(fā)現(xiàn)AD中iNOS的表達上調(diào)使NO合成增加，NO進而S-亞硝基化Drp1。其研究表明去泛素化酶Uch-L1促進S-亞硝基化級聯(lián)反應，其將NO基團轉移到Cdk5，然后再轉移到Drp1，刺激Drp1活性增強。由此導致線粒體過度分裂碎片化和生物能量受損，引起神經(jīng)元突觸缺失及細胞死亡。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)GSNOR通過減輕Drp1的S-亞硝基化修飾，維持線粒體穩(wěn)態(tài)以及減少神經(jīng)元凋亡蛋白的釋放，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。另有研究表明，當NO在帕金森病（PD）中表達過高時，PINK1的S-亞硝基化會抑制其激酶活性，損害PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，從而導致多巴胺能神經(jīng)元細胞死亡[25]。以上研究揭示了NO介導線粒體動力學和線粒體自噬以致神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)生，而靶向部分酶的亞硝基化活性可能是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的治療靶點。

此外，對于部分神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，高濃度的NO可通過抑制線粒體呼吸和激活細胞死亡途徑而導致神經(jīng)毒性。NO是介導PD中多巴胺能神經(jīng)元退變的主要影響因素之一，研究表明NO與多巴胺代謝物3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）的協(xié)同相互作用，可抑制細胞色素C氧化酶，引起線粒體損傷并通過消耗谷胱甘肽和氮氧應激的機制導致多巴胺能細胞死亡[26]。iNOS介導的NO產(chǎn)生也有助于α-突觸核蛋白的聚集，導致線粒體呼吸能力下降及多巴胺能神經(jīng)元的選擇性喪失[27]。

3.3 腫瘤

NO在腫瘤中有著雙重作用，低濃度NO可以促進腫瘤生長，高濃度NO則可抑制腫瘤細胞增殖并誘導腫瘤細胞死亡[6]。當NO存在時，與鐵硫簇（Fe-S）形成鐵-亞硝酰復合物，引發(fā)線粒體去極化，導致線粒體氧化應激，介導細胞凋亡。NO也可抑制電子呼吸鏈復合物Ⅳ，減少ATP的產(chǎn)生并降低細胞存活率。這種抑制作用還可以增加ROS/RNS的產(chǎn)生，誘導氧化/亞硝化應激或氧化還原信號傳導，引起細胞凋亡，進而可抑制腫瘤進展，降低腫瘤細胞的轉移潛力。目前，高濃度NO在腫瘤治療方面具有廣闊的應用前景，在腫瘤微環(huán)境中可與ROS反應生成具有更強氧化性的活性氮類衍生物，共同影響線粒體功能、調(diào)控細胞因子，在分子和細胞水平上有效地抑制腫瘤的生長和轉移[28]。

代謝重編程是惡性腫瘤的特征，即使在有氧條件下，腫瘤細胞仍然以糖酵解途徑為主要能量來源，即Warburg效應。NO通過與酶的相互作用或通過激活致癌途徑來影響腫瘤細胞代謝。Gao等[29]研究表明，nNOS可促進磷酸果糖激酶1（PFK-1）亞型PFKM Cys351位點的S-亞硝基化修飾，導致卵巢癌細胞糖酵解增加。Li等[30]發(fā)現(xiàn)iNOS衍生的NO通過誘導PKM2發(fā)生核轉位來促進卵巢癌細胞的糖酵解。另一方面，在腫瘤中發(fā)現(xiàn)編碼TCA循環(huán)酶的基因發(fā)生突變，如富馬酸水合酶（FH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和異檸檬酸脫氫酶（IDH），導致代謝產(chǎn)物琥珀酸、富馬酸和2-羥基戊二酸的豐度增加[31]。這些代謝產(chǎn)物可作為驅動不同癌癥的致病因子，并且代謝物積累會促進惡性腫瘤的發(fā)展。以上研究表明NO誘導代謝變化，導致致癌信號傳導、增殖和突變發(fā)生率增加，因此靶向腫瘤細胞代謝可以作為潛在的腫瘤治療手段，但仍需進一步研究闡明該類藥物與腫瘤相關的免疫細胞產(chǎn)生不良影響的可能性。

3.4 炎癥

巨噬細胞存在于大部分組織中，與組織穩(wěn)態(tài)、炎癥和宿主防御有關，在一些細胞因子和內(nèi)毒素的誘導下可以產(chǎn)生大量的NO。NO可以通過改變線粒體生物性質(zhì)來介導巨噬細胞效應活性，并且在控制巨噬細胞代謝重編程方面具有重要影響。在細胞代謝方面，NO可以通過抑制TCA循環(huán)中關鍵酶和相關代謝產(chǎn)物的活性調(diào)控巨噬細胞代謝[32]。研究表明NO可以通過抑制烏頭酸酶2（ACO2）以調(diào)節(jié)衣康酸鹽水平來調(diào)節(jié)炎癥信號傳導，并且通過改變呼吸鏈復合物Ⅰ中關鍵N-模塊亞基的豐度來調(diào)節(jié)巨噬細胞呼吸功能[33]。NO還抑制丙酮酸脫氫酶（PDH），通過PDH-E3亞單位（DLD）的半胱氨酸亞硝基化，從而阻斷丙酮酸進入TCA循環(huán)[34]。NO通過靶向ACO2和PDH限制了代謝產(chǎn)物進入TCA循環(huán)，進而影響了免疫細胞代謝重編程。在細胞凋亡方面，NO可以通過線粒體膜電位直接介導或通過產(chǎn)生過氧化亞硝酸鹽間接誘導細胞色素C的釋放，進而活化半胱氨酸蛋白酶（Caspase）依賴的細胞凋亡途徑。Simpson等[35]發(fā)現(xiàn)過量的NO促進細胞凋亡和炎癥。巨噬細胞內(nèi)Caspase-8減少增加了iNOS的表達，從而促進了促凋亡蛋白BAX/BAK的信號傳導，以驅動線粒體凋亡。NO影響免疫細胞代謝和細胞凋亡新機制的進一步闡明，可以為患有炎癥性疾病的患者帶來新的治療方法。

4 總結與展望

綜上所述，一氧化氮合酶亞型、S-亞硝基化修飾的靶蛋白、呼吸鏈組分、細胞因子等是機體內(nèi)NO調(diào)控線粒體功能的重要因素。NO調(diào)控線粒體功能在各疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，靶向該途徑可以為治療各類疾病提供新的治療策略，也為相應疾病的藥物研發(fā)提供新的思路。但也應注意NO對于疾病的調(diào)控有雙重性，NO及其衍生物與不同靶標的相互作用，具體取決于濃度、時間和空間限制。因此在臨床治療中有必要提出新的策略來提高NO的生物利用度，以增強其防治潛力。同時在NO介導線粒體代謝方面也需要進一步的研究來揭示復雜代謝途徑之間的關系，并發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞生命活動的新代謝途徑，將有助于我們進一步明確靶向目標，為疾病的防治提供新的策略。