基于理化性質(zhì)和抗胃潰瘍作用優(yōu)化煅牡蠣的炮制工藝

張鳳婷，鈐莉妍，包麗媛，齊曉丹，米碩，李文匯，趙穎，賀文慧，王穎莉，謝磊磊，張麗麗，宋亮亮，杜紅*（.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 0488；.東阿阿膠股份有限公司山東省膠類中藥技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 聊城 500；.山西中醫(yī)藥大學，太原 0069）

牡蠣是牡蠣科動物長牡蠣OstreagigasThunberg、大連灣牡蠣OstreatalienwhanensisCrosse或近江牡蠣OstrearivularisGould的貝殼[1]。生品具有重鎮(zhèn)安神、平肝潛陽的功效，其質(zhì)地堅硬，臨床常使用其煅制品。煅品具有收斂固澀、制酸止痛的功效，臨床常用于胃潰瘍的治療。

關(guān)于煅牡蠣的炮制工藝，《中國藥典》2020年版中要求“煅至紅透，質(zhì)地酥脆時取出”，未明確煅制溫度與時間要求。以研究的溫度范圍一般是片段式，并不全面，且多以表觀性狀、孔道大小，結(jié)合鈣離子溶出作為主要考察因素[2-5]。然而，牡蠣生、煅品作用不同，碳酸鈣作為牡蠣的主要成分，僅以其含量的高低難以解釋生熟異用的特點。因此，本研究系統(tǒng)考察100～900℃煅制1～4 h的煅制品的理化性質(zhì)，結(jié)合反映煅牡蠣制酸止痛作用的藥理學指標，綜合對其炮制工藝進行優(yōu)選。

1 材料

1.1 試藥與儀器

牡蠣購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定系王晶娟教授鑒定為牡蠣科大連灣牡蠣的貝殼。飲片經(jīng)檢查符合《中國藥典》2020年版要求。溴化鉀（批號：20210427，天津福晨化學廠），碳酸鈣（批號：20171226，北京化工廠），氧化鈣（批號：20220418，天津福晨化學廠），硫糖鋁咀嚼片（批號：210103，上海華源安徽仁濟堂制藥有限公司）。一氧化氮檢測試劑盒（BN27106，北京百瑞極生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒（批號分別為20221011、20221008，南京建成），PGE2、IL-4、TNF-αELISA測定試劑盒（批號分別為202203、202202、202202，科特生物）。

SX2-2.5-10A箱式電阻爐（紹興市上虞道墟科析儀器廠），PerkinElmer Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker），TMS-Touch物性分析儀（北京盈盛恒泰科技有限責任公司），X 射線衍射儀（粉末 D/max 2500型，日本理學公司），ASAP 2460 Version 2.01比表面積和孔徑分析儀（Micromeritics）。

1.2 動物

SPF級雄性SD大鼠（180～220 g）[斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證編號SCXK（京）2019-0010]。給予普通維持飼料和自由飲水，維持室溫20～25℃，相對濕度60%～70%，燈照周期12 h。動物倫理委員會批件號：BUCM-4-2023022104-1020。

2 方法和結(jié)果

2.1 煅牡蠣樣品制備

稱取100 g凈制后的牡蠣，置于馬弗爐中，分別設定溫度為100、200、300、400、500、600、700、800、900℃，各煅制1、2、3、4 h，得到不同條件下煅牡蠣樣品36份。粉碎過100目篩備用。

2.2 理化性質(zhì)測定

2.2.1 紅外分析 取“2.1”項下樣品粉末，采用溴化鉀壓片法壓制成透明薄片進行檢測[6]。檢測條件為DTGS檢測器，4 cm-1分辨率，掃描光譜范圍 4000～400 cm-1，16次掃描累加。所得光譜數(shù)據(jù)運用OMNIC 進行基線校正、自動平滑等優(yōu)化處理。結(jié)果如圖1所示。

圖1 牡蠣及不同煅制品紅外光譜Fig 1 Infrared spectra of oysters and different calcined products

3530 cm-1左右是O-H/N-H的吸收峰，屬于有機基團[7]；3000～2800 cm-1附近是有機質(zhì)C-H伸縮振動的吸收峰，2520 cm-1附近也屬于有機質(zhì)，1760 cm-1、1500cm-1、1000～600cm-1為CO32-的特征吸收峰；3640cm-1附近小吸收峰是氧化鈣吸收水生成Ca（OH）2形成的[8]；2330 cm-1附近是由于高溫分解生成的CO2吸附于多孔的氧化鈣中所致[9]。

結(jié)果顯示，600℃煅4 h、700℃煅3 h、800℃煅2 h、900℃煅1 h的煅牡蠣中碳酸鈣已開始部分分解，成分中既有碳酸鈣也有氧化鈣。800℃煅3 h、900℃煅2 h的煅牡蠣中碳酸鈣已全部分解，成分組成只有氧化鈣。這表明，在600～900℃煅制時，煅制溫度和煅制時間對煅牡蠣中碳酸鈣的分解的影響具有一定的交互作用。

2.2.2 X射線衍射（XRD）分析 利用XRD分析煅制過程中物相的變化和可能出現(xiàn)的新物相[10]。儀器的檢測條件為：Cu Kα射線，石墨單色器，管壓36 kV，管電流30 mA，掃描速率8°·min-1，步長0.01°，掃描范圍15°～70°。利用JADE6.0對XRD圖譜進行尋峰處理。結(jié)果如圖2所示。

圖2 牡蠣及不同煅制品X射線衍射圖譜Fig 2 XRD patterns of oysters and different calcined products

生牡蠣在2θ為23.05、29.40、31.43、35.97、39.41、43.16、47.11、48.50、57.39等處有衍射峰，符合碳酸鈣 的標準PDF卡片（PDF 47-1743）；低溫煅制牡蠣的衍射圖譜并沒有明顯的變化，直至700℃煅3 h，800℃煅2 h時樣品衍射圖譜中出現(xiàn)了符合氧化鈣的標準卡片（PDF 48-1476）的峰，分別在2θ為32.14、35.99（700℃煅3 h）；32.14、35.82、53.75（800℃煅2 h）處，這表明牡蠣在700℃下煅制3 h或在800℃下煅制2 h即有部分碳酸鈣開始分解。800℃煅3 h以上煅品和900℃煅2 h以上煅品的衍射圖譜與氧化鈣特征衍射峰基本重合，無碳酸鈣相關(guān)衍射峰，表明在800℃下煅制3 h以上或在900℃下煅制2 h以上時樣品中碳酸鈣已完全分解。當煅制溫度＞600℃時，煅制溫度和煅制時間對牡蠣碳酸鈣的分解具有交互影響。

2.2.3 質(zhì)構(gòu)分析 利用TMS-Touch物性分析儀對牡蠣及不同條件煅制品的硬度進行測定。軟件（Texture Lab Pro）設置參數(shù)為（量程800 N或40 N，測試速度為30 mm·min-1，形變量100%），選擇TMS 2 mm Steel針型檢測探頭進行測量。結(jié)果如圖3所示，硬度主要受煅制溫度的影響，煅制時間的影響不大。當煅制溫度高于300℃時，樣品硬度明顯變小。隨著煅制溫度的升高，煅品硬度逐漸變小，酥脆程度明顯增加。

圖3 牡蠣及不同煅制品硬度（*P＜0.05）Fig 3 Hardness of oysters and different calcined products（*P＜0.05）

2.2.4 水煎液pH值及鈣離子含量測定 精密稱取2 g樣品粉末，分別加入10倍和8倍量的水先后煎煮60 min，得到水煎液，使用pH計對水煎液pH值進行測定。采用《中國藥典》2020年版[1]中牡蠣含量測定方法對水煎液中鈣離子含量進行測定。結(jié)果如圖4所示，與生品相比，400℃2～4 h煅品以及500～900℃煅品水煎液pH值顯著升高。

圖4 牡蠣及不同煅制品水煎液的pH值（A）和鈣離子含量（B）（*P＜0.05）Fig 4 pH of decoction（A）and calcium ion content（B）of oysters and different calcined products（*P＜0.05）

2.2.5 聚類分析 對牡蠣及不同條件煅牡蠣的硬度、水煎液pH值、水煎液鈣離子含量等理化性質(zhì)結(jié)果進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果如圖5所示，樣品可分為三類，分別為第一類（生品、100℃煅品和200℃煅品），第二類（300℃煅品、400℃煅品、500℃煅品以及600℃1 h/2 h/3 h煅品）和第三類（600℃4 h煅品、700℃煅品、800℃煅品、900℃煅品）。

綜合上述實驗結(jié)果選取100℃、400℃、600℃以及900℃下各煅制4 h樣品進行大鼠抗實驗性胃潰瘍作用研究。

2.3 抗大鼠實驗性胃潰瘍作用研究

2.3.1 動物分組、給藥與造模 將動物分為模型組、正常組、陽性藥（硫糖鋁）組、生品低劑量組、生品高劑量組、100℃煅品低劑量組、100℃煅品高劑量組、400℃煅品低劑量組、400℃煅品高劑量組、600℃煅品低劑量組、600℃煅品高劑量組、900℃煅品低劑量組、900℃煅品高劑量組、碳酸鈣低劑量組、碳酸鈣高劑量組、氧化鈣低劑量組、氧化鈣高劑量組。

分別取一定量100℃4 h煅品、400℃4 h煅品、600℃4 h煅品、900℃4 h煅品樣品粉末、碳酸鈣對照品、氧化鈣對照品，各加入10倍量純凈水煎煮兩次，過濾濃縮得到低劑量（0.14 g·mL-1）和高劑量（0.28 g·mL-1）藥液。陽性藥組將硫糖鋁口嚼片研磨過100目篩，加適量純凈水制成0.043 g·mL-1藥液。

按照1 mL/100 g給藥，每日一次，連續(xù)給藥6 d，末次給藥前24 h禁食不禁水。模型組及正常組給予同等體積純凈水。除正常組外，其余各組末次給藥后1 h灌胃2 mL含60%乙醇的0.15 mol·L-1鹽酸溶液進行造模[11]，正常組給予等量純凈水。

2.3.2 胃液pH值測定 造膜1 h后，腹腔注射10%戊巴比妥麻醉大鼠，結(jié)扎幽門與賁門后，取胃，剪一小口收集胃液，利用精密pH試紙（0.5～5.0）測定胃液pH值。結(jié)果如圖6所示，與模型組相比，900℃煅品高劑量組、氧化鈣高劑量組胃液pH值明顯升高，這可能與藥液pH值偏大有關(guān)。與正常組相比，生品低、高劑量組，400℃煅品高劑量組，900℃煅品低、高劑量組，碳酸鈣低、高劑量組，氧化鈣低、高劑量組胃液pH值顯著增大。

圖6 牡蠣及不同煅制品對實驗性胃潰瘍大鼠胃液pH值的影響Fig 6 Effect of oysters and different calcined products on the pH of gastric juice of rats with experiment gastric ulcer

2.3.3 潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率測定 沿胃大彎將胃剪開，展開并平鋪于桌面，利用相機進行電子成像，利用PS軟件統(tǒng)計潰瘍面積，按照以下公式計算潰瘍指數(shù)與潰瘍抑制率[12]。潰瘍指數(shù)（%）＝潰瘍部分面積/胃部總面積×100%；潰瘍抑制率（%）＝（模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù)）/模型組潰瘍指數(shù)×100%。結(jié)果如圖7所示。與模型組比較，除生品給藥組外，其余各組給藥后潰瘍指數(shù)均顯著減小，表明牡蠣煅制后均具有抗胃潰瘍作用，以600℃4 h煅品、900℃4 h煅品作用更好，兩者作用優(yōu)于碳酸鈣和氧化鈣。

圖7 牡蠣及不同煅制品對實驗性胃潰瘍大鼠潰瘍指數(shù)（A）與潰瘍抑制率（B）的影響Fig 7 Effect of oyster and different calcined products on ulcer index（A）and ulcer inhibition rate（B）in rats with experimental gastric ulcer

2.3.4 形態(tài)學觀察和組織病理學檢查 剪取大約0.5 mm×0.5 mm大小胃組織，置于10倍量的甲醛溶液中進行固定，包埋，切片，并進行HE染色，在顯微鏡下觀察組織病理變化。

圖8為各給藥組的胃組織病理切片。正常組胃黏膜細胞形態(tài)正常，排列分布整齊致密。模型組胃黏膜細胞形態(tài)嚴重缺損，可見明顯細胞裂隙，大范圍炎細胞紅細胞浸潤。陽性藥組胃黏膜細胞形態(tài)保持良好，排列致密，僅胃壁深處微有炎細胞浸潤，無紅細胞浸潤。生品、100℃煅品、400℃煅品及碳酸鈣組明顯可見細胞腫脹失活，細胞間隙明顯增大，胃黏膜破損。生品組還可見胃壁處明顯炎細胞和紅細胞浸潤。600℃煅品組胃黏膜細胞微有破損但胃壁組織細胞形態(tài)良好，組織致密，無明顯裂隙，微有炎細胞浸潤。900℃煅品低高劑量組均可見細胞腫脹，偶有失活，胃黏膜輕微缺損，可見炎癥細胞浸潤。氧化鈣低高劑量組均可見胃黏膜明顯損傷，細胞腫脹，細胞間隙明顯變大，炎細胞浸潤。

2.3.5 大鼠胃組織生化指標測定 刮取胃黏膜組織，加入適量生理鹽水制成10%組織勻漿。利用對應試劑盒測定胃組織中NO、PGE2、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-4水平，結(jié)果如圖9所示。

圖9A顯示與模型組相比，陽性藥組、600℃煅品高劑量組，碳酸鈣高劑量組及氧化鈣低、高劑量組的胃組織中NO明顯增多。圖9B顯示與模型組相比，陽性藥組，生品高劑量組，100℃煅品低、高劑量，400℃煅品高劑量組，600℃煅品低、高劑量組的胃黏膜中PGE2水平明顯增高。圖9C為不同給藥組胃黏膜中SOD活力，與模型組相比，給藥組差異無統(tǒng)計學意義。圖9D為不同給藥組胃黏膜中GSH-Px活力，結(jié)果顯示給藥組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。圖9E為不同給藥組胃黏膜中TNF-α分泌水平，結(jié)果顯示與模型組相比，100℃煅品低劑量組和400℃煅品高劑量組明顯降低。圖9F為不同給藥組胃黏膜中IL-4分泌水平，結(jié)果顯示給藥組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，生品可增加PGE2水平；100℃煅品、400℃煅品可增加PGE2水平，降低TNF-α水平；600℃煅品可增加NO、PGE2水平。

4 討論

牡蠣的炮制工藝不定，市售藥材飲片質(zhì)量參差不齊，優(yōu)化牡蠣的煅制工藝十分重要。本文通過紅外光譜和X射線衍射圖譜確定了不同條件所得牡蠣煅制品的物相組成，通過測定硬度、水煎液pH值、鈣離子溶出度對不同條件煅制品的理化性質(zhì)進行初步了解，并進行系統(tǒng)聚類分析將樣品分為三類。傳統(tǒng)認為，牡蠣煅制后具有制酸止痛的功效，本研究以鹽酸乙醇誘導實驗性胃潰瘍模型來篩選牡蠣的最佳炮制工藝，結(jié)果表明牡蠣煅制后均具有抑制潰瘍的作用，其中600℃4 h煅品和900℃4 h煅品作用最強。生化指標檢測結(jié)果表明不同條件煅牡蠣的抗胃潰瘍作用機制可能不同，100℃煅品、400℃煅品、600℃煅品可提高組織中PGE2水平，900℃煅品對各生化因子并無明顯作用。

藥效作用的不同可能與理化性質(zhì)的改變有一定關(guān)系。400℃煅品的組成主要為碳酸鈣，但其質(zhì)地明顯變酥脆，藥液更容易進入，胃液pH值略高于100℃煅品給藥組。600℃煅品的組成既有碳酸鈣也有氧化鈣，質(zhì)地更酥脆。900℃煅品為純氧化鈣，可明顯提高胃液pH值起到中和胃酸減緩傷害的作用。但其屬于強堿氧化物遇水反應發(fā)熱對黏膜具有強烈的刺激性，臨床長時間使用可能會引起患者不適。

牡蠣為生熟異用品，生品重鎮(zhèn)安神，煅品制酸止痛。選擇合理的指標對生品、煅品進行質(zhì)量控制是必要的。目前多數(shù)炮制研究都是以鈣離子溶出作為主要的評價指標，無法體現(xiàn)出生品、煅品的差異。本研究結(jié)合質(zhì)構(gòu)、鈣離子溶出、水煎液pH值和抗胃潰瘍作用綜合分析，優(yōu)化炮制工藝，結(jié)果更加全面可靠。