植物來(lái)源大環(huán)二萜類化合物的研究進(jìn)展

付嘉，劉楠，顏曉暉*（.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3067；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 3067）

大環(huán)二萜是指由4個(gè)異戊二烯基單位構(gòu)成分子骨架，且結(jié)構(gòu)中存在六元環(huán)以上環(huán)狀結(jié)構(gòu)的二萜類化合物。該類化合物結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜，且一般具有多種功能團(tuán)，具有獨(dú)特的生物活性和藥理作用，如細(xì)胞毒性、抗腫瘤、抗病毒和抗炎活性等。該類化合物在植物、海洋生物中分布廣泛，在植物中主要存在于大戟屬和瑞香科植物中，少部分大環(huán)二萜也存在于橄欖科和金松科植物中。如從大戟屬植物甘遂或千金子中提取的化合物巨大戟醇具有顯著的抗腫瘤、抗病毒活性[1]，其衍生物巨大戟醇甲基丁烯酸酯于2012年被FDA批準(zhǔn)用于日光性角化病的治療[2]。Prostratin是從新西蘭特有的小型灌木中分離出來(lái)的一種大環(huán)二萜類化合物，它可以抑制HIV-1的感染，并減少HIV-1的潛伏期[3]。

獲取大環(huán)二萜的方式通常有3種，分別為植物提取、化學(xué)合成和生物合成。植物提取的工藝較復(fù)雜，一般收率較低，且對(duì)環(huán)境的破壞較為嚴(yán)重；由于大環(huán)二萜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所以化學(xué)合成較難實(shí)現(xiàn)；生物合成主要是利用合成生物學(xué)，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠來(lái)合成天然產(chǎn)物，這種方法生產(chǎn)周期短，且收率穩(wěn)定，符合綠色可持續(xù)的生產(chǎn)理念。但這種生產(chǎn)方式需要掌握化合物完整的生物合成途徑，對(duì)其中關(guān)鍵酶基因了解透徹。

目前對(duì)于大環(huán)二萜類的相關(guān)研究并不多，尤其是在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物合成方面，本篇綜述以介紹大環(huán)二萜的骨架類型為基礎(chǔ)，總結(jié)了近年來(lái)研究報(bào)道的大環(huán)二萜類化合物的生物活性及其生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因和通路解析進(jìn)展，以期為今后大環(huán)二萜類化合物在特定結(jié)構(gòu)、生理活性及合成生物學(xué)等方面的研究提供參考。

1 大環(huán)二萜的骨架類型

大環(huán)二萜的骨架類型較為豐富，常見(jiàn)的主要包括紫杉烷型（taxane）、西松烷型（cembrane）、巴豆烷型（tigliane）、瑞香烷型（daphnane）、巨大戟烷型（ingenane）、假白欖烷型（jatrophane）、續(xù)隨子烷型（lathyrane）和卡司烷型（casbane）等（見(jiàn)圖1）。

圖1 植物中大環(huán)二萜的骨架類型Fig 1 Skeleton types of macrocyclic diterpenes in plants

1.1 紫杉烷型二萜（taxane）

紫杉烷型二萜主要由一個(gè)紫杉烷環(huán)及C4、C5所連四元環(huán)氧丙烷組成，在C13處另有龐大的酯側(cè)鏈相連，該酯鏈為紫杉烷類化合物的主要活性部分。該類化合物被分為4個(gè)亞家族，即taxanes，secotaxanes，abeotaxanes和cyclotaxanes，這4種亞家族由11種（Ⅰ～Ⅺ）不同的骨架組成[4]。紫杉烷型二萜主要來(lái)源于紅豆杉科紅豆杉屬植物，紫杉醇（taxol，見(jiàn)圖2）是當(dāng)前最受關(guān)注的明星抗腫瘤產(chǎn)品，對(duì)各種臨床型惡性腫瘤具有廣泛的藥理學(xué)活性。2008年，美國(guó)Phyton Biotech公司通過(guò)培養(yǎng)紅豆杉的樹(shù)皮細(xì)胞完成紫杉醇的生物合成，年產(chǎn)量可超過(guò)100 kg。2021年Hu等[5]通過(guò)21步完成了紫杉醇的合成，合成效率為0.118%，是目前最短的全合成路線。

紫杉醇的副作用較強(qiáng)，水溶性不好，所以近年來(lái)關(guān)于其結(jié)構(gòu)修飾的研究較多。Bouchet等[6]將紫杉醇的苯甲酰苯基和乙酰基分別改造為烷氧基和羥基得到多西他賽（docetaxel，見(jiàn)圖2），由于其空間位阻小且極性基團(tuán)親水性強(qiáng)，所以其與微管蛋白的親和力是紫杉醇的兩倍。

1.2 西松烷型二萜（cembrane）

西松烷二萜是由4個(gè)異戊二烯單元首尾相連形成的大環(huán)二萜，是一類母體骨架具有十四元環(huán)和3個(gè)對(duì)稱分布的甲基及一個(gè)異丙基的天然產(chǎn)物，包括異丙基型，五元、六元、七元、八元內(nèi)酯環(huán)型，開(kāi)環(huán)型，降碳型等幾種結(jié)構(gòu)類型。從結(jié)構(gòu)上看西松烷型二萜是多種大環(huán)二萜的前體化合物，在生源上具有重要意義。這類化合物主要分布在煙草和海洋生物，在植物中較少存在?；衔铮?）-1S-15-hydroxy-18-carboxycembrene（見(jiàn)圖2）是從大戟科植物大戟中提取到的第一個(gè)西松烷型二萜，體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，該化合物對(duì)乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、大腸癌、皮膚癌等5種腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用[7]。從胡楊中發(fā)現(xiàn)的populusin A（見(jiàn)圖2）是一個(gè)具有獨(dú)特二氧三環(huán)[6.6.1.12，5]十六烷支架的西松烷型二萜化合物[8]。

1.3 巴豆烷型二萜（tigliane）

在植物體內(nèi)巴豆烷型二萜是瑞香烷型和巨大戟烷型二萜生物合成途徑的中間體，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)5/7/6/3的四環(huán)體系，其中A/B環(huán)大多為反式稠合，B/C環(huán)為反式稠合，C/D環(huán)為順式稠合，且結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)取代基。該家族大多數(shù)成員都表現(xiàn)出重要的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒等[9]。

佛波醇（見(jiàn)圖2）是一種重要的巴豆烷型二萜化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)中含有5個(gè)羥基。其C-12位、13位或20位的羥基被不同官能團(tuán)取代時(shí)可以得到數(shù)百種佛波醇酯類化合物[10]。佛波醇衍生物中最具代表性的化合物是佛波酯（PMA）（見(jiàn)圖2），該化合物目前正處于治療急性髓系白血?。ˋML）的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中。PMA和維生素D3通過(guò)誘導(dǎo)髓系轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可以促進(jìn)AML細(xì)胞晚期分化[11]。佛波醇作為這些活性化合物的共同中間體，引起了研究者的廣泛關(guān)注。有研究者通過(guò)14步反應(yīng)，合成了佛波醇的類似物ingenol（見(jiàn)圖2），在此基礎(chǔ)上又繼續(xù)進(jìn)行19步反應(yīng)，成功合成了佛波醇[12]，Wender教授[13]以佛波醇為原料，通過(guò)5步反應(yīng)合成prostrain（見(jiàn)圖2），總收率為15%左右。

1.4 瑞香烷型二萜（daphnane）

瑞香烷型二萜在大戟科和瑞香科植物中都存在，其結(jié)構(gòu)與巴豆烷型二萜結(jié)構(gòu)相似，有復(fù)雜的5/7/6三環(huán)骨架，這類天然產(chǎn)物的發(fā)掘提供了多種具有活性的先導(dǎo)藥物。瑞香烷型二萜化合物在抗HIV、抗腫瘤、抗白血病等方面均顯示出了生物活性?；衔锝Y(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)其生物活性產(chǎn)生一定的影響，當(dāng)A環(huán)的C-1和C-2位的雙鍵被還原為單鍵，化合物的活性會(huì)降低，但如果被羰基取代將提高其活性；當(dāng)B環(huán)的雙鍵被變成環(huán)氧基或苯甲?；鶗r(shí)，均可以使化合物的活性增強(qiáng)；若C環(huán)上有原酸酯基團(tuán)、苯甲酰基或苯乙?；部梢燥@著增強(qiáng)化合物的細(xì)胞毒性。

Resiniferatoxin（RTX，見(jiàn)圖2）是從大戟類樹(shù)膠植物的乳汁中分離出來(lái)的刺激性香草酸類分子。研究發(fā)現(xiàn)RTX是一種強(qiáng)效TRPV1通道激動(dòng)劑，可用于治療慢性疾病[14]，除此之外，RTX也可治療尿失禁[15]。Vasilev等[16]通過(guò)立體選擇性的Aldol縮合、Sml2介導(dǎo)的自由基環(huán)化/HAT串聯(lián)以及環(huán)氧化物離子化串聯(lián)等15步反應(yīng)完成了RTX的全合成。

Gnidimacrin（見(jiàn)圖2）是一種從Gnidiasubcordata中分離得到的一種脂溶性的瑞香烷型二萜類化合物[17]。研究發(fā)現(xiàn)gnidimacrin及其衍生物對(duì)抗HIV病毒具有良好的活性，通過(guò)評(píng)估它們的活性以及構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，C-5和C-20上的羥基是該類化合物保持活性必須的，用芳香族酯修飾C-3位羥基也可以保持該類化合物的活性，且結(jié)構(gòu)中含有的酯鍵可以使這類化合物的半衰期延長(zhǎng)[18]。

1.5 巨大戟烷型二萜（ingenane）

巨大戟烷型二萜是巴豆烷型二萜重排形成的，結(jié)構(gòu)中含有5/7/7/3四環(huán)系，其中C-8和C-10通過(guò)酮橋相連，A/B環(huán)和C/D環(huán)均為順式，多數(shù)巨大戟烷型二萜結(jié)構(gòu)在C-6和C-7間還存在一個(gè)雙鍵，這類化合物主要存在于大戟科大戟屬等植物中。巨大戟烷型二萜酯是該類化合物中數(shù)目較多的一類，它們具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、親脂性的特點(diǎn)，大多數(shù)具有強(qiáng)刺激性，同時(shí)也是腫瘤促進(jìn)劑[19]。

這類化合物中比較有代表性的是巨大戟醇甲基丁烯酸酯（見(jiàn)圖2），它是從澳大利亞植物Euphorbiapeplus的汁液中提取的活性成分，且巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝膠已于2012年1月25日獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于光化性角化病的局部治療。Ingenol是從大戟屬植物中分離出的一種高含氧的巨大戟烷型二萜，Winkler等[20]首次報(bào)道了ingenol的全合成方法，合成路線共45步，每步反應(yīng)的平均收率在80%左右。Baran團(tuán)隊(duì)[21]從天然的（+）-carene出發(fā)，通過(guò)7步反應(yīng)完成了ingenol的骨架的組裝，又通過(guò)7步反應(yīng)構(gòu)建碳氧鍵和立體中心最終完成了ingenol的全合成。

1.6 假白欖烷型二萜（jatrophane）

假白欖烷型二萜是一類具有5/12碳環(huán)骨架的大環(huán)二萜化合物，雙鍵的位置、氧化修飾和?；〈葘?duì)化合物的結(jié)構(gòu)有一定的影響，且該類化合物的12元柔性碳環(huán)非常容易發(fā)生重排或環(huán)化轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌羌芙Y(jié)構(gòu)。

1970年，有學(xué)者從棉葉珊瑚中分離出第一個(gè)假白欖烷型二萜jatrophone（見(jiàn)圖2），該化合物可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用[22]。Zhou等[23]從澤漆中分離到了17個(gè)新的假白欖烷型二萜，分別命名為heliojatrone D和 helioscopids A～P（見(jiàn)圖2），通過(guò)HR-ESI-MS、NMR和X-ray等方法確定了上述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中化合物helioscopid D還含有稀有雙環(huán)[8.3.0]十三烷骨架。

1.7 續(xù)隨子烷型二萜（lathyrane）

續(xù)隨子烷型二萜是一類含有5/11/3三環(huán)系碳骨架的天然化合物，結(jié)構(gòu)中存在環(huán)丙烷并與11元環(huán)呈順式稠合。天然存在的續(xù)隨子烷型二萜結(jié)構(gòu)中通常被各種?；〈渲凶畛Ｒ?jiàn)的是乙?；?、苯甲酰基和苯乙?；?，如C-16位被苯甲?；〈蟮玫搅嘶衔飈atilagascene D（見(jiàn)圖2）；C-16位被乙?；〈玫交衔飈atilagascene A（見(jiàn)圖2）[24]。大戟因子是從續(xù)隨子中分離得到的一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特新穎的化合物，其中大戟因子L1（見(jiàn)圖2）可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，具有抗腫瘤、抗脂肪生成等多種生物活性。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)大戟因子L3（見(jiàn)圖2）可以很好地抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，而且細(xì)胞毒性很低。

1.8 卡司烷型二萜（casbane）

卡司烷型二萜具有十四元碳環(huán)骨架，在生源上續(xù)隨子烷型、假白欖烷型、巨大戟烷型和瑞香烷型等多種大環(huán)二萜都被認(rèn)為是卡司烷型二萜進(jìn)一步環(huán)化衍生而形成的[26]。天然存在的卡司烷型二萜數(shù)量很少，目前僅有100多個(gè)結(jié)構(gòu)被分離鑒定出來(lái)，這些化合物主要集中在大戟屬植物中。

Wang等[27]從大戟的根中提取到的6個(gè)大環(huán)二萜類化合物，其中包括一種新卡司烷二萜類化合物，通過(guò)HR-ESI-MS、IR和NMR確定該化合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該化合物含有6個(gè)不飽和鍵，將該化合物命名為pekinenin G（見(jiàn)圖2）。通過(guò)比較該化合物與其他幾種卡司烷二萜類化合物對(duì)人類腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)中含有環(huán)氧基團(tuán)會(huì)降低化合物的生物活性；而C-5位被羥基或羰基取代會(huì)增加化合物的活性。

本文對(duì)近年來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)的大環(huán)二萜類化合物的結(jié)構(gòu)、來(lái)源、生物活性以及作用機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)，詳見(jiàn)表1及圖2。

表1 植物中代表性大環(huán)二萜類化合物歸納總結(jié)Tab 1 Summary of representative macrocyclic diterpenoids in plants

2 大環(huán)二萜的生物活性

大環(huán)二萜類化合物因其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多樣性而具有豐富的生物學(xué)活性，該類化合物在治療癌癥、炎癥和HIV等方面都有廣泛應(yīng)用，且目前已有相關(guān)藥物用于臨床治療。本部分對(duì)大環(huán)二萜類化合物的生物活性進(jìn)行了總結(jié)（見(jiàn)圖3）。

圖3 大環(huán)二萜的生物活性Fig 3 Biological activity of macrocyclic diterpenes

2.1 抗腫瘤活性

大戟科植物五點(diǎn)草中分離出的3個(gè)假白欖烷型大環(huán)二萜類化合物euphoscopin C、euphorbiapene D和euphoheliosnoid A，對(duì)耐紫杉醇的A549人肺癌細(xì)胞系均顯示出細(xì)胞毒性，IC50值分別為6.9、7.2和9.5 μmol·L-1[56]。從麻瘋樹(shù)樹(shù)干中分離得到的jatromultone D對(duì)A549、HELA、HEPG2、MDAMB231和HEPG2/DOX等5種人腫瘤細(xì)胞系均具有細(xì)胞毒性，IC50值均在2.69～6.44 μmol·L-1。研究表明，該化合物通過(guò)使細(xì)胞停滯于G2/M期來(lái)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡[57]。

Ovatodiolide是從中藥防風(fēng)中提取到的一種大環(huán)二萜類化合物，該化合物在單獨(dú)或聯(lián)合抗腫瘤藥物順鉑共同作用下均顯示出顯著的抑制口腔腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或繁殖的活性。Ovatodiolide主要通過(guò)提高順鉑的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，使JAK2/STAT3信號(hào)通路失調(diào)從而發(fā)揮抗腫瘤作用[58]。宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，研究表明ovatodiolide對(duì)所有的宮頸癌細(xì)胞均有抑制活性。其中對(duì)DoTC2細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，且在此過(guò)程中使調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的Bcl-2和Bax表達(dá)量的比值下降，由此可知ovatodiolide可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮活性，還可以使DoTC2細(xì)胞停滯在G2/M細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞周期B1的表達(dá)，因此該化合物可以作為治療宮頸癌的先導(dǎo)分子[59]。此外，ovatodiolide對(duì)胰腺癌細(xì)胞也有細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)研究證明它可以通過(guò)降低STAT3磷酸化和抑制NF-κB通路來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[60]。

2.2 抗炎活性

從澤漆中提取到的11種大環(huán)二萜，通過(guò)評(píng)估這些化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW 264.7）產(chǎn)生NO的影響，判斷這些化合物的抗炎活性。其中化合物heliojatrone C顯示出最強(qiáng)的抗炎活性，IC50值為（7.4±0.6）μmol·L-1。通過(guò)對(duì)白細(xì)胞介素（IL）-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定發(fā)現(xiàn)該化合物可劑量依賴性抑制這兩種炎癥介質(zhì)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，高劑量時(shí)，該化合物對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子P65的移位顯示出較好的抑制作用。因此抗炎作用的機(jī)制可能是通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)IL-6和TNF-α與P65亞基的移位來(lái)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路從而產(chǎn)生抗炎活性[61]。除此之外，Zhang等[62]從該植物中提取到的大環(huán)二萜類化合物euphzycopias A、B、C、D、E、F和I對(duì)炎癥小體NLRP3均有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值在3.34～14.92 μmol·L-1。

哮喘是一類慢性炎癥疾病，病發(fā)時(shí)主要使用藥物控制，具有停藥后復(fù)發(fā)快的特點(diǎn)?；衔飋vatodiolide不僅具有抗腫瘤作用，對(duì)于哮喘的治療也有一定作用。把經(jīng)過(guò)支氣管肺泡灌洗液處理的雞卵蛋白免疫小鼠作為過(guò)敏性炎癥模型，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、免疫抑制實(shí)驗(yàn)、測(cè)定麻醉小鼠氣道阻力等方法，分析ovatodiolide發(fā)揮抗炎活性的機(jī)制。結(jié)果顯示該化合物通過(guò)下調(diào)哮喘小鼠模型中Th2細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)抑制過(guò)敏性哮喘[63]。

2.3 抗HIV活性

瑞香烷型二萜原酸酯是從瑞香科和大戟科植物中分離得到的一類天然產(chǎn)物，具有優(yōu)異的抗HIV活性。Gnidimacrin最初是從瑞香科植物Gnidia subcordate中分得的，該化合物能在皮摩爾濃度下殺死持續(xù)感染的細(xì)胞，是一種很好的先導(dǎo)化合物[64]。李巍課題組[65]從金邊瑞香中提取到了gnidimacrin以及3個(gè)新的與gnidimacrin類似的瑞香烷型二萜化合物，在MT4細(xì)胞測(cè)試中化合物daphneodorins A和B和均顯示出微納摩爾級(jí)別的抑制活性。Asada從結(jié)香中分離得到瑞香烷型二萜原酸酯edgeworthianins A～E，其中edgeworthianins B、D和E均顯示出顯著的抗HIV活性[66]。

2.4 其他

病蟲(chóng)害常對(duì)農(nóng)牧業(yè)造成不良影響，目前植物殺蟲(chóng)劑是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。Hua等[67]從澤漆中提取到了3種新的大環(huán)二萜類化合物，包括2個(gè)假白欖烷型二萜euphoscopoids A和B和續(xù)隨子烷型二萜euphoscopoid C。這幾種化合物對(duì)棉鈴蟲(chóng)均顯示出了較強(qiáng)的拒食活性，EC50值在2.05～4.34 μg·cm-2。

溶酶體是細(xì)胞的降解中心和信號(hào)樞紐，其生成和活性會(huì)受到各種信號(hào)的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老中起著重要作用。從南歐大戟種子中提取到了5種新的大環(huán)二萜化合物，分別為euphopepluanones A～E，其中化合物euphopepluanones A、B和C的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)罕見(jiàn)的5/11/5的三環(huán)結(jié)構(gòu)。通過(guò)溶酶體紅色熒光探針評(píng)估3種化合物誘導(dǎo)溶酶體生成的活性，其中euphopepluanones A和C的活性最強(qiáng)。研究顯示它們可以促進(jìn)溶酶體關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TFEB的核移位，通過(guò)激活TFEB來(lái)誘導(dǎo)溶酶體生成[68]。

Carneiro等[69]評(píng)估了從大戟科植物Croton nepetaefolius中分離到的卡司烷型二萜對(duì)細(xì)菌或酵母等微生物生長(zhǎng)和生物膜形成的抑制能力，結(jié)果顯示它們對(duì)Staphylococcusaureus和Staphylococcusepidermidis等多種致病菌都表現(xiàn)出抑制活性，最低抑菌濃度在125～500 μg·mL-1。

3 大環(huán)二萜的生物合成研究進(jìn)展

萜類化合物的生成是植物體內(nèi)最重要的次生代謝過(guò)程之一，這類化合物以五碳單元異戊二烯作為前體，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的修飾降解最終生成各種萜類化合物及其衍生物。大環(huán)二萜的生物合成途徑目前僅在蓖麻子、續(xù)隨子、麻瘋樹(shù)、米花團(tuán)等幾種植物中有相關(guān)的研究。異戊烯基焦磷酸酯（isopentenyl diphosphate，IPP）及其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸酯（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）是這類化合物的共同前體，在植物中主要通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonic acid pathway，MVA）途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP）途徑產(chǎn)生，且兩者可以通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)行互換。MVA途徑和MEP途徑已被廣泛報(bào)道，在本綜述中不再詳述[70]。

在植物次生代謝途徑中IPP和DMAPP在牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPs）的作用下進(jìn)行首尾相連，生成香葉基香葉基焦磷酸酯（geranyl-geranyl diphosphate，GGPP）。GGPP是二萜類化合物的直接前體，在不同二萜合酶的作用下生成大環(huán)二萜類化合物的二萜骨架。然后在P450氧化酶等的作用下對(duì)二萜骨架進(jìn)行修飾生成結(jié)構(gòu)不同的大環(huán)二萜類化合物及其衍生物。

3.1 二萜合酶

二萜合酶是參與大環(huán)二萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，它可以將二萜類化合物的共同前體GGPP轉(zhuǎn)化成不同的大環(huán)二萜骨架。1994年，Mau等[71]從大戟科植物蓖麻子中發(fā)現(xiàn)了蓖麻烯合酶（casbene synthase，CS），該酶可以催化GGPP生成蓖麻烯（casbene，見(jiàn)圖4）。蓖麻烯被認(rèn)為是大戟科植物來(lái)源的多種大環(huán)二萜類化合物中間體。Kirby等[72]選擇了包括蓖麻子在內(nèi)的5種大戟科植物，對(duì)不同來(lái)源的CS進(jìn)行篩選，并將釀酒酵母作為底盤(pán)菌株驗(yàn)證酶的功能，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于烏桕的TPS10，乳漿大戟的TPS2和蓖麻的CAS3都可以將GGPP轉(zhuǎn)化生成蓖麻烯，通過(guò)發(fā)酵富集蓖麻烯，產(chǎn)量最高可以達(dá)到31 mg·L-1。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)白角麒麟來(lái)源的TPS6和下垂澳楊來(lái)源的TPS4分別與TPS2有高達(dá)95%和70%的相似性。而來(lái)自蓖麻的CAS2可以催化GGPP生成neocembrene（見(jiàn)圖4）。

圖4 大環(huán)二萜的生物合成途徑Fig 4 Biosynthetic pathways of macrocyclic diterpenes

Chen等[73]從米團(tuán)花腺毛的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)TPS-α家族的萜類合酶LcTPS2，通過(guò)在大腸埃希菌和本氏煙草中進(jìn)行異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)其可以催化GGPP轉(zhuǎn)化生成兩種不同的14-元碳環(huán)的西松烷型二萜。這兩種西松烷型二萜可以在米花團(tuán)植物的葉中檢測(cè)到，并且經(jīng)過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LcTPS2也在米花團(tuán)的葉中特異性高表達(dá)。

Wang等[74]從哥倫比亞和佛得角來(lái)源的擬南芥中克隆得到了TPS20基因，將它們分別與GGPP合酶一起在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示來(lái)源于佛得角的擬南芥的TPS20可以轉(zhuǎn)化GGPP生成一種大環(huán)朵蕾烷二萜醇，而哥倫比亞來(lái)源的擬南芥TPS20并不發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)兩個(gè)基因的cDNA序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)后者比前者多了一個(gè)內(nèi)含子，并且缺失了一個(gè)堿基，這使兩者的氨基酸序列存在較大的差異，功能也發(fā)生改變。

3.2 細(xì)胞色素P450加氧酶和脫氫酶

植物中大環(huán)二萜生物合成途徑中的氧化反應(yīng)多數(shù)是由細(xì)胞色素P450氧化酶（cytochrome P450 oxygenase，CYP）催化進(jìn)行的，多種氧化還原過(guò)程使得大環(huán)二萜類化合物的結(jié)構(gòu)類型豐富多樣。由于之前有研究報(bào)道南歐大戟中CYP71D和CYP726A亞家族的酶參與二萜類化合物的生物合成[75]，因此Luo等[76]利用續(xù)隨子轉(zhuǎn)錄組對(duì)這兩個(gè)P450家族的基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)CYP71D445和CYP26A27的表達(dá)量最高。通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩個(gè)酶進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)蓖麻烯在CYP71D445和CYP26A27的交叉作用下可以在C-5、C-6和C-9位各添加一分子羥基。通過(guò)對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，推測(cè)乙醇脫氫酶ElADH1可能也參與了該類化合物的生物合成途徑。將CYP71D445、CYP26A27和ADH1進(jìn)行共表達(dá)，以蓖麻烯為底物進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，得到了化合物jolkinol C（見(jiàn)圖4）。而麻瘋樹(shù)來(lái)源的CYP726A35或CYP726A20，在與CYP71D495的共同作用下，可以使蓖麻烯在C-5和C-9位分別添加一分子羰基，在C-6位添加一分子羥基，最終得到化合物6-羥基-5，9-酮基-蓖麻子，該化合物可以自發(fā)轉(zhuǎn)化生成化合物jolkinol C或epi-jolkinol C[77]（見(jiàn)圖4）。

Zhao等[78]以成熟續(xù)隨子中參與大環(huán)二萜合成途徑的ElGGPPs、ElCS、ElCYP726A27、ElADH-1和ElCYP71D445等5個(gè)基因的表達(dá)量作為參考，對(duì)各個(gè)組織中基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，選擇出了5個(gè)候選基因，分別為Unigene14844、Unigene16270、Unigene41114、Unigene13099和Unigene33555。其中Unigene41114和CYP726A27屬于同一家族的成員，推測(cè)Unigene41114也參與了大環(huán)二萜類化合物的生物合成，且兩者的功能可能相同。

彭健等[79]從續(xù)隨子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到一個(gè)新的CYP726A亞家族的萜類合成酶，將其命名為EICYP726A30。通過(guò)多重序列比對(duì)和聚類分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與同科植物南歐大戟的CYP726A6氨基酸序列高度相似。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)其在不同組織中的分布情況，結(jié)果表明根中的表達(dá)量最高，種子其次，葉中的表達(dá)量最低。該結(jié)果表明根可能是續(xù)隨子二萜合成的主要組織部位。除此之外，在其他幾種大戟科植物中也有相關(guān)的氧化酶被鑒定出來(lái)。King等[80]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于蓖麻的CYP726A14、CYP726A17和CYP726A18可以使蓖麻烯的C-5位發(fā)生氧化，該類產(chǎn)物是大多數(shù)藥用大環(huán)二萜類化合物的中間體；CYP726A16可以催化5-酮基-蓖麻烯的7，8位發(fā)生環(huán)氧化；CYP726A15可以催化neocembrene的C-5位發(fā)生氧化（見(jiàn)圖4）。

4 總結(jié)與展望

萜類化合物是自然界中存在的一大類天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)種類豐富，且大多具有廣泛的生物活性。大環(huán)二萜類化合物是萜類化合物中重要的組成部分，這類化合物大多分布于植物或海洋生物中，具有結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜、活性廣泛的特點(diǎn)，因此受到人們的廣泛關(guān)注。雖然大環(huán)二萜類化合物具有較為豐富的藥理活性，但大多數(shù)化合物的藥理機(jī)制尚不清楚。目前，大環(huán)二萜類化合物的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用還存在一些限制性因素，如植物中化學(xué)成分復(fù)雜，不利于單一化合物的提取，也不利于發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)類型的大環(huán)二萜類化合物?；瘜W(xué)合成雖然可以有效提高化合物結(jié)構(gòu)的多樣性，但這種方法存在原料昂貴、工藝復(fù)雜和對(duì)環(huán)境破壞嚴(yán)重等問(wèn)題。合成生物學(xué)是指通過(guò)解析植物中大環(huán)二萜生物合成途徑，挖掘關(guān)鍵酶基因，并對(duì)其催化機(jī)制和功能進(jìn)行解析，最后在微生物底盤(pán)菌株中構(gòu)建目標(biāo)化合物完整的生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)高價(jià)值化合物的生產(chǎn)，目前該種方法是生產(chǎn)化合物最高效、綠色穩(wěn)定的方式之一。

目前已有少數(shù)幾種大環(huán)二萜類化合物的生物合成途徑被解析，并且實(shí)現(xiàn)了異源生產(chǎn)，然而大多數(shù)大環(huán)二萜類化合物的生物合成途徑仍然是未知的，可以通過(guò)基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析等方法對(duì)大環(huán)二萜類化合物的生物合成途徑進(jìn)行推測(cè)和解析來(lái)解決這一問(wèn)題。在異源宿主中構(gòu)建化合物的生物合成途徑來(lái)獲得目標(biāo)產(chǎn)物具有產(chǎn)量穩(wěn)定、分離簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，該過(guò)程也可能會(huì)獲得新型結(jié)構(gòu)的大環(huán)二萜類化合物，對(duì)增加大環(huán)二萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣性也有一定的幫助。因此對(duì)大環(huán)二萜生物合成途徑進(jìn)行研究并通過(guò)合成生物學(xué)等方法對(duì)其進(jìn)行生產(chǎn)已成為研究熱點(diǎn)，合成生物學(xué)在大環(huán)二萜的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用方面具有廣泛前景。

總之，大環(huán)二萜類化合物來(lái)源廣泛，結(jié)構(gòu)復(fù)雜豐富，具有多種生物活性，在治療腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合征等多種疾病方面具有重要意義，也可為開(kāi)發(fā)新型藥物提供新的思路。但在大環(huán)二萜類化合物的結(jié)構(gòu)研究、活性發(fā)掘、生源機(jī)制和高效生產(chǎn)等方面仍值得進(jìn)一步探索。