GC-MS/MS法測定復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中N-亞硝基二甲胺與N-亞硝基二乙胺

岳青陽，張耀文，徐萬魁*（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心，沈陽 110036；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院/國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110036）

基因毒性雜質(zhì)是指能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向的一類物質(zhì)，對DNA的損害包括染色體斷裂、DNA重組及復(fù)制過程中共價鍵的插入和修飾，也包括在細(xì)胞水平產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)而產(chǎn)生的突變[1-2]，如磺酸酯類、N-亞硝胺類、鹵代烷烴類和肼類等，其中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)是公認(rèn)的強(qiáng)毒性的化合物之一。N-亞硝基二甲胺（NDMA）及N-亞硝基二乙胺（NDEA）均為常見的N-亞硝胺類化合物，不僅屬于2A類致癌物質(zhì)，而且屬于三大“關(guān)注隊(duì)列”的基因毒性雜質(zhì)，在 ICH M7 指南中明確該類化合物具有較高致癌性[3-5]。

目前，我國高血糖發(fā)病率持續(xù)增長，其中2型糖尿病占糖尿病人群的近90%，二甲雙胍產(chǎn)品作為治療2型糖尿病的一線藥物，有著穩(wěn)定的市場需求[6]。糖尿病患者需要終身服藥，且服用的劑量大、時間長，因此需要更加嚴(yán)格地控制雜質(zhì)水平。2019年12月，F(xiàn)DA宣布從降糖藥物鹽酸二甲雙胍制劑中檢出雜質(zhì)NDMA，隨后我國藥品監(jiān)督管理部門也陸續(xù)開展了二甲雙胍制劑中NDMA的監(jiān)測工作[7-9]。復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊為鹽酸二甲雙胍與格列吡嗪的復(fù)方制劑，臨床上用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，由臨床數(shù)據(jù)顯示，使用該復(fù)方制劑比單獨(dú)使用二甲雙胍效果更佳，且患者依從性、耐受性好，因此該制劑在臨床上使用較為廣泛[10-11]。目前復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊在國內(nèi)尚屬獨(dú)家品種，并未對其中的亞硝胺類雜質(zhì)進(jìn)行控制，國內(nèi)未見復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中NDMA和NDEA檢測的有關(guān)文獻(xiàn)。本文采用GC-MS/MS法同時測定鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊中的NDMA和NDEA，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC2030氣相色譜儀，TQ8050NX質(zhì)譜檢測器，日本島津公司）。XP205電子天平（美國METTLER TOLEDO公司，精度0.000 01 g）。

1.2 試藥

NDMA對照品（純度為99.5%，批號：510166-202104）、NDEA對照品（純度為100.0%，批號：510168-202103）（中國食品藥品檢定研究院）。二氯甲烷（色譜純，批號：22085094，美國Fisher公司）；鹽酸（分析純，批號：20210220，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氦氣（純度＞99.99%）。8批復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊均為遼寧修和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent VF-WAXms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）。柱溫為程序升溫：初始溫度為40℃，維持0.5 min后，以20℃·min-1的速率升至200℃，再以60℃·min-1的速率升至240℃，維持5 min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量：1 μL；載氣為氦氣，流速1.2 mL·min-1；電離方式：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230℃；采集模式：MRM；離子源電壓0.99 kV。NDMA的定量離子對74/44，碰撞能量為6 V，定性離子對為74/42，碰撞能量為21 V；NDEA的定量離子對為102/85，碰撞能量為6 V，定性離子對為102/55，碰撞能量為21 V。

2.2 對照品儲備液的制備

分別取NDMA與NDEA對照品各約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本品內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg），置50 mL離心管中，加1 mol·mL-1鹽酸溶液10 mL，渦旋1 min，再以350 次·min-1的頻率振搖10 min，精密加入二氯甲烷10 mL，以1000 r·min-1渦旋1 min，繼續(xù)振搖10 min，然后以4000 r·min-1離心10 min，小心抽取下層二氯甲烷層過濾，以0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取混合對照品儲備液適量，用二氯甲烷稀釋至質(zhì)量濃度為40 ng·mL-1的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，以二氯甲烷作為空白溶液，取系統(tǒng)適用性溶液和空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，溶劑不干擾NDMA和NDEA的測定。

圖1 二甲雙胍格列吡嗪膠囊代表性色譜圖Fig 1 Representative chromatogram of compound metformin hydrochloride and glipizide capsules

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品儲備液適量，用二氯甲烷逐步稀釋至0.2、0.5、1、2、5、10、20、40 ng·mL-1，進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。各組分在0.1966～39.32 ng·mL-1及0.1870～37.41 ng·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 NDMA和NDEA線性關(guān)系、檢測限及定量限Tab 1 Linearity，detection limit，and quantitation limit of NDMA and NDEA

2.6 檢測限和定量限

精密量取對照品儲備液，用二氯甲烷逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）≈3時的濃度，為其檢測限（LOD），S/N≈10時的濃度，為其定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

2.7 精密度

取0.5 ng·mL-1對照品線性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，NDMA的RSD為1.8%（n＝6），NDEA的RSD為3.2%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取同一批樣品內(nèi)容物9份，分別精密加入20、25、30 ng·mL-1對照品溶液1 mL，各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣測定，計(jì)算各濃度的回收率。結(jié)果NDMA和NDEA加樣回收率在82.3%～85.4%，RSD在2.6%～3.9%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.9 重復(fù)性

取樣品4粒內(nèi)容物，精密加入25 ng·mL-1對照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣測定，同法配制6份，記錄色譜圖。結(jié)果NDMA和NDEA峰面積的RSD分別為2.6%和4.1%，表明重復(fù)性良好（n＝6）。

2.10 穩(wěn)定性

取重復(fù)性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，以二氯甲烷為溶劑，NDMA和NDEA在12 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD分別為2.4%和4.9%。

2.11 測定結(jié)果

取本品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定，將測定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NDMA和NDEA含量。結(jié)果表明，8批復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中均未檢出NDMA和NDEA。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

目前，N-亞硝胺雜質(zhì)的定量分析方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、LC-MS/MS法、LCHRMS法等[12-15]，本文采用GC-MS/MS方法，檢測專屬性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡便。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

制備10 μg·mL-1的混合對照品溶液，使用全掃描模式對混合對照品溶液進(jìn)行m/z40～200內(nèi)的掃描，使用譜庫比對確定NDMA和NDEA的色譜峰，根據(jù)相對強(qiáng)度選擇前體離子，NDMA和NDEA均選擇分子離子作為前體離子。再通過產(chǎn)物離子掃描對碰撞能量及二級碎片離子進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)最高的產(chǎn)物離子，作為定性離子和定量離子。

3.3 供試品提取方法的選擇

中國食品藥品檢定研究院頒布的鹽酸二甲雙胍中N-亞硝基二甲胺推薦檢測方法中鹽酸二甲雙胍不同制劑采用了不同提取溶劑，本研究分別考察了二氯甲烷及鹽酸加二氯甲烷兩種提取方式，并考察了渦旋時間及振搖時間等因素。通過NDMA及NDEA的回收率對比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用二氯甲烷提取，基質(zhì)效應(yīng)較大，輔料干擾測定，而采用1 mol·mL-1鹽酸加二氯甲烷作為提取溶劑時，輔料不干擾測定，且提取時渦旋1 min，振搖10 min，提取效果最佳。

3.4 假陽性結(jié)果的處理

在樣品測定中發(fā)現(xiàn)在與NDMA對照品相同保留時間處出現(xiàn)色譜峰，且該色譜峰的定量與定性離子對均與對照品相同，但離子強(qiáng)度比與對照品相差較大，出現(xiàn)了假陽性現(xiàn)象。經(jīng)優(yōu)化質(zhì)譜條件，將分辨率由“high”優(yōu)化為“unit”后，假陽性現(xiàn)象消失。

根據(jù)美國致癌性數(shù)據(jù)庫（CPDB）中化合物的TD50值，NDMA和NDEA按每日注射最大日暴露量（PDE）96 ng·d-1和26.5 ng·d-1計(jì)，按照二甲雙胍每日最大劑量2000 mg，NDMA和NDEA對應(yīng)的分析評價閾值（AET）為48 ng·g-1和13.25 ng·g-1。通過對8批復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中的NDMA和NDEA雜質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩種雜質(zhì)含量均小于其AET。