《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中黃酮類化合物顯色反應(yīng)的考證

秦凌月，謝文豪，彭越，韓清娟，黃秀凝，劉艷霞*（.陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系 生藥學(xué)與中藥學(xué)教研室，重慶 40008；.陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 無軍籍地方生大隊(duì)0隊(duì)，重慶 40008；.陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系藥物分析與分析化學(xué)教研室，重慶 40008）

天然藥物化學(xué)是藥學(xué)、中藥學(xué)專業(yè)的專業(yè)必修課，是運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)理論與方法研究天然藥物中化學(xué)成分的一門學(xué)科，主要研究天然藥物中各類化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特征、物理化學(xué)性質(zhì)、提取分離方法、結(jié)構(gòu)鑒定與生物活性、生物合成規(guī)律及途徑、體內(nèi)外動(dòng)態(tài)變化等[1]。筆者所在教研室承擔(dān)藥學(xué)四年制本科的天然藥物化學(xué)授課任務(wù)，理論課56學(xué)時(shí)、實(shí)驗(yàn)課54學(xué)時(shí)。實(shí)驗(yàn)課共設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)，均為18學(xué)時(shí)，其中實(shí)驗(yàn)二為“堿-酸法提取蘆丁”。

蘆?。╮utin）是糖苷類黃酮的一種，由槲皮素（quercetin）3位上的羥基與蕓香糖（葡萄糖與鼠李糖1-6連接而成的雙糖）脫水而成，超過70種植物或植物來源的糧食中均含有該黃酮，如杏、葡萄、蕎麥種子、櫻桃、洋蔥、李子和橙子等[2]。蘆丁除具有維生素P樣作用外，還具有多種藥理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗細(xì)菌與真菌，廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療[3]。

1 事件概述及原因分析

天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的選用教材為人民衛(wèi)生出版社的《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》（第4版），配套的理論教材為《天然藥物化學(xué)》（第7版）[4-5]。在2022—2023學(xué)年秋季學(xué)期“堿-酸法提取蘆丁”實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生通過堿溶酸沉法從槐米（豆科植物槐Sophorajaponica的花蕾）中提取蘆丁，并依據(jù)其在冷水、熱水中的溶解度差異進(jìn)行精制；用ZrOCl2/枸櫞酸顯色反應(yīng)鑒定精制蘆丁時(shí)，學(xué)生加入2% ZrOCl2/甲醇溶液后溶液顏色變黃，但繼續(xù)加入2%枸櫞酸/甲醇后溶液未發(fā)生褪色現(xiàn)象，與配套理論教材中關(guān)于鋯鹽實(shí)驗(yàn)原理的描述（黃酮類化合物分子中有游離的3-OH或5-OH時(shí)，3-OH或5-OH、4-酮基與鋯鹽試劑生成黃色鋯絡(luò)合物，但3-OH、4-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性較5-OH、4-酮基絡(luò)合物強(qiáng)，故加入枸櫞酸后，5-OH黃酮的溶液顯著褪色，而3-OH黃酮仍呈鮮黃色[4]）不相符。超出了學(xué)生理解范疇，使學(xué)生對該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了質(zhì)疑。

首先核對試劑，未有異常情況發(fā)生。其次分析原因，ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)的溶液未褪色，猜測可能是蘆丁的純度不高，其中含具有3-OH的雜質(zhì)，雜質(zhì)的3-OH、4-酮基與Zr4+形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，使得加入2%枸櫞酸/甲醇后溶液不褪色。為考證該猜想是否成立，采用師生合作的方式，使用蘆?。S酮醇苷，含5-OH）、槲皮素（黃酮醇，含3-OH、5-OH）、芹菜素（黃酮，含5-OH）為對照品（見圖1），對實(shí)驗(yàn)課獲取的精制蘆丁進(jìn)行鹽酸-鎂粉反應(yīng)、Molish反應(yīng)和ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)的鑒定，過程中設(shè)置試劑用量的梯度以優(yōu)化操作步驟，并使用聚酰胺薄層色譜法鑒定所含雜質(zhì)。

圖1 蘆?。ˋ）、槲皮素（B）、芹菜素（C）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of rutin（A），quercetin（B）and apigenin（C）

2 精制蘆丁的顯色反應(yīng)與薄層色譜

2.1 材料

對照品蘆?。ㄅ?hào)： 153-18-4）、槲皮素（批號(hào)： 117-39-5）、芹菜素（批號(hào)： 520-36-5）（純度均≥98% ，成都鈉鈳鋰生物科技有限公司），其余試劑均為市售分析純，水為超純水。供試品為“堿-酸法提取蘆丁”實(shí)驗(yàn)課中學(xué)生提取并精制的蘆丁樣品。

2.2 供試品及對照品溶液的配制

取供試品16 mg置于25 mL量瓶中，乙醇定容，得供試品待測溶液。

分別取對照品蘆丁16 mg、槲皮素8 mg、芹菜素8 mg置于25 mL量瓶中，乙醇定容，得對應(yīng)的對照品溶液，分別標(biāo)記為標(biāo)液1、標(biāo)液2、標(biāo)液3。

2.3 供試品的顯色反應(yīng)

鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取標(biāo)液1～3及供試品溶液各2 mL分別放入比色管中，設(shè)置梯度用量的鹽酸與鎂粉，即分別加入0.2、0.4、0.2 mL濃鹽酸，再依次分別加入0.03、0.03、0.06 g鎂粉，觀察三組試驗(yàn)的顏色變化情況。

Molish反應(yīng)：取標(biāo)液1～3及供試品溶液各2 mL分別放入比色管中，設(shè)置梯度用量的α-萘酚/乙醇溶液，即分別加入0.3、0.2、0.1 mL 10%α-萘酚/乙醇溶液，搖勻，沿管壁滴加3 mL的濃硫酸，觀察三組試驗(yàn)中兩液面產(chǎn)生的顏色變化。

ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)：取標(biāo)液1～3及供試品溶液各2 mL分別放入比色管中，滴加2%ZrOCl2/甲醇溶液，注意觀察顏色變化情況，至溶液變?yōu)辄S色，繼續(xù)滴加至顏色不再加深為止，記錄消耗的ZrOCl2/甲醇溶液體積；再向試管中加入2%枸櫞酸/甲醇溶液，記錄顏色變化情況。

2.4 供試品的聚酰胺薄層色譜

取聚酰胺薄層板，以標(biāo)液1～3為對照，點(diǎn)上供試品樣品，用75%乙醇液進(jìn)行展開。展開一段距離后，吹干，用1% AlCl3溶液對薄層板進(jìn)行顯色，在日光、紫外燈下觀察樣品斑點(diǎn)的顏色與熒光。

2.5 結(jié)果分析

鹽酸-鎂粉反應(yīng)結(jié)果表明，加入0.4 mL濃鹽酸，再加0.03 g鎂粉后顯色較好且鎂粉消化完全，標(biāo)液1～3及供試品分別呈紅色、淡紅、黃色、紅色。即供試品顯色與對照品蘆丁相同，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，說明實(shí)驗(yàn)課中成功從槐米中提取到蘆?。ㄒ妶D2A）。

圖2 鹽酸-鎂粉反應(yīng)（A）、Molish反應(yīng)（B）及ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)（C）顯色效果Fig 2 Chromogenic effect of hydrochloric acid-magnesium powder reaction（A），Molish reaction（B）and ZrOCl2/citric acid reaction（C）a.蘆丁對照品（rutin reference）；b.槲皮素對照品（quercetin reference）；c.芹菜素對照品（apigenin reference）；d.供試品（test product）

Molish反應(yīng)結(jié)果表明，加入0.3 mL 10%α-萘酚/乙醇溶液，并滴加3 mL濃硫酸后，標(biāo)液1、供試品呈現(xiàn)的玫瑰環(huán)明顯，而標(biāo)液2、3無玫瑰環(huán)現(xiàn)象。符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，再次說明實(shí)驗(yàn)課中蘆丁提取成功（見圖2B）。

ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)結(jié)果表明，消耗1 mL ZrOCl2/甲醇溶液后，標(biāo)液1～3及供試品溶液均變黃且顏色不再加深；后加入2%枸櫞酸/甲醇溶液，蘆丁與芹菜素標(biāo)液完全褪色，槲皮素標(biāo)液不褪色，而供試品發(fā)生褪色但褪色不完全，最終呈現(xiàn)為淺黃色（見圖2C）。這證實(shí)了實(shí)驗(yàn)前的推論：“堿-酸法提取蘆丁”實(shí)驗(yàn)課中所用試劑均無異常，供試品不褪色是因?yàn)槠浔旧聿患?、其中含有?-OH的雜質(zhì)。

聚酰胺薄層色譜的結(jié)果表明，供試品的主要成分為蘆丁，但其中含有少量槲皮素（見圖3）。即供試品中具3-OH的雜質(zhì)為槲皮素。

圖3 日光（A）、365 nm紫外光（B）下的薄層色譜圖Fig 3 Thin layer chromatography under sunlight（A）and 365 nm ultraviolet（B）

3 結(jié)論與討論

提取的蘆丁中含有槲皮素雜質(zhì)的相關(guān)研究，為本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提供了有力支撐：孟祥穎等[6]報(bào)道通過堿溶酸沉法加熱提取蘆丁，產(chǎn)物常有9%～13%的水解產(chǎn)物存在；趙文斌等[7]從槐米粉提取蘆丁，薄層層析鑒定表明，樣品中含有少量槲皮素；舒曉宏等[8-9]從槐花米中提取蘆丁時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸堿濃度適宜的石灰水和鹽酸可提高蘆丁產(chǎn)率，但堿提pH值偏高、酸沉pH值偏低，蘆丁粗提率提高的同時(shí)帶來含量較高的雜質(zhì)；另有研究者采用有機(jī)溶劑提取法，從槐米、苦蕎中提取到的蘆丁，也均被不同程度地分解為槲皮素[10-11]。筆者查閱資料推斷，槲皮素雜質(zhì)是蘆丁在提取過程中被堿水解而產(chǎn)生的：蘆丁的苷鍵為烯醇苷鍵，對堿不穩(wěn)定，堿溶液會(huì)催化苷鍵水解[4]；《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中描述“稱取槐花米20 g，取1～1.5 g石灰粉加入10 mL水后研成乳液，槐米在攪拌條件下加入石灰乳，調(diào)節(jié)pH至8～9，加熱至微沸，維持pH 保持40 min……[5]”；在上述提取過程中，用石灰乳調(diào)節(jié)溶液pH使呈堿性，加熱情況符合蘆丁堿水解的條件，故而部分蘆丁堿水解生成槲皮素，造成提取的供試品蘆丁不純。

綜合上述，“堿-酸法提取蘆丁”實(shí)驗(yàn)課中，通過堿溶酸沉法提取蘆丁時(shí)，蘆丁發(fā)生部分堿水解生成槲皮素雜質(zhì)，槲皮素含有的3-OH、 4-酮基與鋯鹽試劑形成穩(wěn)定性強(qiáng)的絡(luò)合物，故采用ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)鑒定蘆丁供試品時(shí)，加入2%枸櫞酸/甲醇溶液后，黃色不褪或褪色不完全；而純凈蘆丁的 5-OH 與鋯鹽試劑形成絡(luò)合物的穩(wěn)定性較差，采用ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)鑒定時(shí)，完全褪色?？偠灾?，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)不褪色現(xiàn)象實(shí)為蘆丁堿水解生成了槲皮素雜質(zhì)所致，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)授課中可給予解釋或進(jìn)行進(jìn)一步探討。

此外，本次實(shí)驗(yàn)探究充分體現(xiàn)了基于問題導(dǎo)向（problem-based learning，PBL）[12]的師生合作教學(xué)模式，凸顯了“以教師為主導(dǎo)、學(xué)生為主體”的教學(xué)理念。具體來講，學(xué)生在“堿-酸法提取蘆丁”實(shí)驗(yàn)課中發(fā)現(xiàn)了精制蘆丁的ZrOCl2/枸櫞酸反應(yīng)的不褪色現(xiàn)象；以兩名學(xué)生為代表形成學(xué)習(xí)小組，探討該問題的可能原因，具有天然藥物化學(xué)、藥物分析學(xué)學(xué)科背景的教師成立教學(xué)組；師生就該問題交流探討，共同設(shè)計(jì)用于考證該問題的實(shí)驗(yàn)步驟；學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，教師指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、答疑解惑；最終師生合作解決了天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的問題。教師在指導(dǎo)學(xué)生中獲得了成長，學(xué)生深刻理解了黃酮化合物顯色反應(yīng)的原理，實(shí)驗(yàn)操作得以進(jìn)一步規(guī)范，科研思維也得到引導(dǎo)與培養(yǎng)?；赑BL的師生合作教學(xué)模式為深化天然藥物化學(xué)課程改革[13]提供了思路與方法。