HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平及其與肝癌的相關(guān)性

成曉梅 田紅 李想 楊潔

我國乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染患者較多,部分HBV感染者可能進(jìn)展為乙型肝炎肝硬化,甚至進(jìn)展為HBV相關(guān)性肝癌[1]。由于肝癌的早期診斷缺乏靈敏度、特異度高的生物學(xué)指標(biāo),很多患者在進(jìn)行腹部CT檢查時(shí)已進(jìn)展至肝癌晚期,嚴(yán)重影響患者生存率及生活質(zhì)量,因此早期診斷及治療尤為重要[2]。隨著外科手術(shù)技術(shù)、小分子靶向藥物及生物制劑的不斷發(fā)展,肝細(xì)胞癌患者可選擇的治療手段及藥物有所增加,但治療后的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高,因此早期診斷HBV相關(guān)性肝癌并進(jìn)行干預(yù)是提高患者生存率的關(guān)鍵[3]。微小RNA(miR)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,已被發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞生理活動及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要調(diào)節(jié)作用[4]。研究發(fā)現(xiàn),miR-200a、miR-504在原發(fā)性肝癌患者的組織、血清中表達(dá)水平均有變化,且主要發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用[5-6]。白細(xì)胞介素(IL)作為一類炎癥因子,在機(jī)體內(nèi)參與多種免疫、炎癥、應(yīng)激等過程,其中IL-24作為一種多效性免疫調(diào)節(jié)因子,對乳腺癌、食管癌等癌細(xì)胞均具有促凋亡及抑制細(xì)胞增殖的作用[7-8]。本研究探究HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平特征及與肝癌發(fā)生的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年2月至2023年2月于空軍第986醫(yī)院接受治療且符合納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者作為觀察組(n=60),另外選取同期慢性HBV感染者作為對照組(n=60)。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《原發(fā)性肝癌診療指南(2022年版)》中肝細(xì)胞癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②有明確的HBV感染史、家族史及HBV相關(guān)病原學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果;③均為首次臨床診斷肝細(xì)胞癌,入組前未接受任何化療、放療或手術(shù)治療;④患者一般狀況尚好且臨床資料完整可取。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并任何其他類型的急、慢性感染;②合并嚴(yán)重心、肺功能障礙或衰竭;③入院治療前1個(gè)月內(nèi)接受過激素、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物治療;④合并其他類型、部位的惡性腫瘤或存在肝內(nèi)及全身肝癌轉(zhuǎn)移;⑤同時(shí)參與其他臨床研究。觀察組中男性47例,女性13例,年齡為(59.5±4.0)歲。對照組中男性49例,女性11例,年齡為(58.9±4.7)歲。兩組患者性別、年齡及基礎(chǔ)疾病的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批,所有入組患者均簽署知情同意書。

二、方法

(一)一般資料 通過門診及住院病歷系統(tǒng)收集患者ALT、AST、肝功能Child-Pugh分級、HBeAg、HBV DNA等一般資料。

(二)血清miR-504、miR-200a水平檢測 通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測定患者外周血清miR-504、miR-200a水平。所有患者均于入院時(shí)采集空腹外周血5 mL,于室溫下以1500 r/min、有效半徑10 cm、離心15 min,獲得上層血清,使用血清總RNA提取試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司)提取血清樣本中總RNA,使用多重PCR擴(kuò)增試劑盒(天根生化科技有限公司)擴(kuò)增總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,所有步驟均按照對應(yīng)商品試劑盒說明書操作。應(yīng)用朗基Q2000B-實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司)及miScript SYBR Green PCR試劑盒(德國QIAGEN公司)對miR-504、miR-200a及U6內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列見表1。qRT-PCR每孔反應(yīng)體系為20 μL,包括樣本cDNA 2 μL、miScript SYBR Green Mix 10 μL、正向、反向引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。表1中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系為95℃,8 min;95℃,20 s;59℃,30 s;72℃,30 s,采集信號,共35個(gè)循環(huán)。每份樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,通過2-△△CT法計(jì)算患者血清中miR-504及miR-200a的相對表達(dá)水平。

表1 目標(biāo)基因及內(nèi)參基因引物序列

(三)血清IL-24水平檢測 應(yīng)用IL-24 ELISA試劑盒(上海聯(lián)祖生物科技有限公司),經(jīng)過上樣、孵育、洗板、加酶、孵育、再次洗板、顯色、終止等步驟,最終在IO-RAD全自動酶標(biāo)儀(美國伯樂有限公司)上讀取各樣本中吸光度(A值),并根據(jù)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各血清樣本中IL-24的表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料對比

觀察組患者HBV DNA高于對照組 (P<0.05),ALT、AST、肝功能Child-Pugh分級及HBeAg陽性率兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料對比

二、兩組患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平對比

觀察組患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平均顯著低于對照組患者(P<0.05),見表3。

表3 兩組患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平對比(±s)

三、觀察組患者血清miR-504、miR-200a與IL-24的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析表明,觀察組患者血清中IL-24水平與血清miR-504呈顯著正相關(guān)性(r=0.423,P=0.001),與miR-200a水平無明顯相關(guān)性(r=0.173,P=0.187),見圖1。

圖1 觀察組60例患者血清miR-504、miR-200a與IL-24的相關(guān)性

四、HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平與肝癌發(fā)生的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平與肝癌發(fā)生呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.689、-0.383、-0.579,P=0.001、0.001、0.001)。

五、影響HBV慢性感染者肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素

二元logistic回歸分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平降低均是肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表4。

表4 影響HBV慢性感染者肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素

六、血清miR-504、miR-200a與IL-24水平對HBV慢性感染者肝癌發(fā)生的診斷價(jià)值分析

ROC分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a與IL-24水平診斷肝癌發(fā)生的AUC分別為0.898(95%CI:0.839～0.956,P<0.01)、0.721(95%CI:0.630～0.812,P<0.01)及0.834(95%CI:0.762～0.906,P<0.01)。

討 論

HBV相關(guān)肝癌患者早期癥狀隱匿、病情進(jìn)展較快,多數(shù)患者在出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀及體征時(shí)已處于肝癌晚期或存在肝內(nèi)、肝外多發(fā)轉(zhuǎn)移[10]。早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行外科手術(shù)干預(yù)可提高肝癌患者的生存率,對于HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者,即使應(yīng)用小分子靶向藥物、免疫制劑等仍難以取得良好的臨床效果。目前,臨床尚缺乏用于肝癌患者早期診斷的特異性標(biāo)志物。miRNA在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)功能,其中miR-504、miR-200a等在肺癌、宮頸癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖作用,因此被認(rèn)為是重要的抗腫瘤調(diào)節(jié)因子[11,12]。此外,IL-24作為一個(gè)凋亡調(diào)節(jié)因子,對多種腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用也逐漸受到關(guān)注[13]。

miR-200a是miR-200家族中的重要成員,其對于子宮內(nèi)膜異位癥具有重要調(diào)節(jié)作用。miR-200a轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平降低后會降低對下游Rho激酶的抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)Rho/Rho激酶通路活化、肌動蛋白收縮及應(yīng)力纖維合成,最終有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲,提示miR-200a具有一定抑癌作用[14]。miR-504在胃癌患者腫瘤組織中表達(dá)水平較高,且可能通過靶向RNA結(jié)合基序蛋白4促進(jìn)抑制胃癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重疾病進(jìn)展,但在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-504表達(dá)增高會抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,且miR-504水平較低的患者生存時(shí)間較久,提示miR-504在不同類型腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮不同作用[15]。IL-24是IL-10家族成員之一,廣泛分布于人體多種細(xì)胞、組織中,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化及凋亡過程。體外研究發(fā)現(xiàn)IL-24可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡水平,同時(shí)能夠通過干擾腫瘤血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞信號傳遞等方法抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[16]。在本研究中,HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者血清miR-200a、miR-504及IL-24的表達(dá)水平均較低,且是HBV慢性感染者肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,其中血清miR-504對肝癌發(fā)生的診斷價(jià)值最高。不同的miRNA可能通過調(diào)節(jié)肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的不同信號通路及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)直接或間接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡等過程,miR-504、miR-200a可能通過影響磷脂酰肌醇3激酶通路、Notch通路等方式促進(jìn)了肝癌細(xì)胞凋亡水平[17]。miR-504可能在HBV相關(guān)性肝癌早期抑制肝癌細(xì)胞的增殖及遷移作用,隨著患者HBV慢性感染加重及免疫功能缺損,miR-504表達(dá)水平呈下降趨勢并失去了對肝癌細(xì)胞的抑作用,表現(xiàn)為肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)低水平miR-504狀態(tài)。此外,miR-504可靶向抑癌基因p53,進(jìn)一步說明了在HBV慢性感染者中miR-504降低與肝癌的發(fā)生具有相關(guān)性[18]。miR-504與IL-24表達(dá)水平具有一定正相關(guān)性,提示IL-24可能也在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抗癌特性。此外,IL-24也具有一定直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,可作為免疫、炎癥調(diào)節(jié)因子在局部發(fā)揮直接抗腫瘤效應(yīng)。因此,IL-24水平降低可能減弱巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷作用,使機(jī)體免疫監(jiān)視及免疫清除功能降低。但關(guān)于miR-504、miR-200a及IL-24可能發(fā)揮抗肝癌細(xì)胞作用的具體方式仍需進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動物模型進(jìn)行探索。

綜上所述,HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平顯著降低,與HBV慢性感染者肝癌發(fā)生呈負(fù)相關(guān),對于HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌具有一定診斷價(jià)值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。