MNNG和佛波酯誘導(dǎo)建立結(jié)腸癌的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型

魏 剛 袁利娟 路建國(guó) 劉灃濤 段森森 包國(guó)強(qiáng)

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西省咸陽(yáng)市 712046; 2 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科, 陜西省西安市 710038)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示,結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)占所有癌癥新發(fā)病例數(shù)的10%,結(jié)直腸癌死亡病例數(shù)在癌癥相關(guān)死亡病例數(shù)中占9.4%[1]。2020年我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例共555 477例,在全球和我國(guó)所有癌癥中分別位列第1、第2,死亡病例數(shù)共286 162例,在全球和我國(guó)分別位列第1、第5[2-3]。深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生及降低患者病死率尤為重要。目前有關(guān)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的研究主要以人結(jié)腸癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象,或是采用結(jié)腸癌細(xì)胞系建立動(dòng)物模型,而直接采用人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞建立惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的相關(guān)研究報(bào)告較為罕見。本研究采用永生化的人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,經(jīng)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)多代誘導(dǎo)處理,使其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,最終建立結(jié)腸癌的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型,旨在為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 NCM460細(xì)胞購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司,MNNG購(gòu)自Adamas-beta公司(貨號(hào):70-25-7),PMA購(gòu)自Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(貨號(hào):16561-29-8),神經(jīng)鈣黏附蛋白(neural-cadherin,N-cadherin)抗體(貨號(hào):bs-20623R)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抗體(貨號(hào):bs-0103R)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)單克隆抗體(貨號(hào):bsm-33140M)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,β-actin抗體(貨號(hào):AF5003)、辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔二抗(貨號(hào):A0208)、RIPA裂解液(貨號(hào):P0013B)和二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(貨號(hào):P0012S)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,ECL化學(xué)發(fā)光液(貨號(hào):36222ES60)購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,酶標(biāo)儀(型號(hào):iMark)購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):使用含1%青-鏈霉素(均為100 U/mL)和10%胎牛血清的DMEM,并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)NCM460細(xì)胞。2～3 d傳代一次,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的建立:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460細(xì)胞,過(guò)夜培養(yǎng)后,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞后加入含50 μg/mL MNNG的DMEM,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8 h,棄去培養(yǎng)液。用PBS洗去殘留的MNNG后,加入含100 ng/mL PMA的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液。用PBS洗去殘留的PMA,然后更換為正常DMEM,于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,按照1 ∶2的比例進(jìn)行傳代。去除傳代后細(xì)胞,按照上述培養(yǎng)方法,反復(fù)誘導(dǎo)培養(yǎng),一直培養(yǎng)至30代。

1.2.3 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的鑒定

1.2.3.1 MTT實(shí)驗(yàn):取正常NCM460細(xì)胞、誘導(dǎo)后的第17代NCM460細(xì)胞(下文用NCM460-M-P17細(xì)胞表示)和誘導(dǎo)后的第30代NCM460細(xì)胞(下文用NCM460-M-P30細(xì)胞表示),用胰酶消化細(xì)胞,以1 000 r/min離心5 min后棄去上清液,用DMEM將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板(每孔200 μL,設(shè)3個(gè)復(fù)孔),于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,室溫震蕩10 min,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,采用GraphPad Prism 8.0繪制細(xì)胞增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常NCM460細(xì)胞、NCM460-M-P17細(xì)胞和NCM460-M-P30細(xì)胞,用胰酶消化細(xì)胞后,以1 000 r/min離心5 min,留取細(xì)胞沉淀。用DMEM將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板(設(shè)3個(gè)復(fù)孔),將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)14 d后終止培養(yǎng)。用PBS洗滌細(xì)胞3次后,用甲醇固定20 min,再用吉姆薩染液染色15 min,沖洗晾干后在顯微鏡下觀察細(xì)胞團(tuán),計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常NCM460細(xì)胞、NCM460-M-P17細(xì)胞和NCM460-M-P30細(xì)胞,用胰酶消化細(xì)胞后,以1 000 r/min離心5 min,留取細(xì)胞沉淀,用DMEM將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板(設(shè)3個(gè)復(fù)孔),將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)100%時(shí),用20 μL槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)板底部垂直劃痕,此時(shí)兩條線之間的距離記為D0。用PBS洗滌細(xì)胞3次后,加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后在鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。測(cè)量培養(yǎng)48 h后兩條線之間的距離D48(細(xì)胞48 h遷移距離),計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率(%)=(D0-D48)/D0。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常NCM460細(xì)胞、NCM460-M-P30細(xì)胞,用胰酶消化細(xì)胞后,以1 000 r/min離心5 min,留取細(xì)胞沉淀,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,用二喹啉甲酸法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量后,每孔上樣20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE,分離蛋白后采用濕轉(zhuǎn)膜方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉于4 ℃封閉12 h后,加入用TBST稀釋的N-cadherin抗體(1 ∶1 000)、TGF-β1抗體(1 ∶1 000)、EGFR單克隆抗體(1 ∶1 000)及內(nèi)參β-actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜后,用TBST清洗,然后加入經(jīng)TBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔二抗(1 ∶1 000),室溫孵育90 min,用TBST清洗后加入發(fā)光液并立即進(jìn)行顯影。用ImageJ軟件計(jì)算蛋白條帶的灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 鏡下可見正常NCM460細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),排列有序,形態(tài)為梭形,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。與正常NCM460細(xì)胞比較,NCM460-M-P17細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化,但細(xì)胞呈現(xiàn)團(tuán)塊生長(zhǎng)的趨勢(shì);而NCM460-M-P30細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化,細(xì)胞形態(tài)多樣、大小不一,排列紊亂且緊密,呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng),無(wú)細(xì)胞間接觸抑制或密度抑制,鋪滿培養(yǎng)瓶底后出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象,見圖1。

圖1 3種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.2 3種細(xì)胞增殖能力的比較 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,3種細(xì)胞的增殖能力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,與正常NCM460細(xì)胞比較,NCM460-M-P17細(xì)胞、NCM460-M-P30細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),且NCM460-M-P30細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于NCM460-M-P17細(xì)胞(P<0.05),見表1。

表1 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后3種細(xì)胞增殖能力的比較(x±s,吸光度值)

2.3 3種細(xì)胞克隆形成能力的比較 與正常NCM460細(xì)胞比較,NCM460-M-P17細(xì)胞、NCM460-M-P30細(xì)胞的克隆形成數(shù)量增多,且NCM460-M-P30細(xì)胞的克隆形成數(shù)量多于NCM460-M-P17細(xì)胞(P<0.05),見表2。大多數(shù)NCM460-M-P17細(xì)胞和NCM460-M-P30細(xì)胞的克隆團(tuán)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè),見圖2。

表2 3種細(xì)胞克隆形成數(shù)量的比較(x±s,個(gè))

圖2 吉姆薩染色觀察細(xì)胞克隆形成情況(×10)

2.4 3種細(xì)胞遷移能力的比較 劃痕48 h后,鏡下可見NCM460-M-P17細(xì)胞、NCM460-M-P30細(xì)胞的劃痕處有細(xì)胞生長(zhǎng),見圖3。與正常NCM460細(xì)胞比較,NCM460-M-P17細(xì)胞、NCM460-M-P30細(xì)胞的48 h遷移距離增加、遷移率升高,且NCM460-M-P30細(xì)胞的48 h遷移距離和遷移率長(zhǎng)于或高于NCM460-M-P17細(xì)胞(P<0.05),見表3。

表3 3種細(xì)胞遷移情況的比較(x±s)

圖3 3種細(xì)胞的遷移情況

2.5 正常NCM460細(xì)胞與NCM460-M-P30細(xì)胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1蛋白表達(dá)水平的比較 NCM460-M-P30細(xì)胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1的蛋白表達(dá)水平高于正常NCM460細(xì)胞(P<0.05),見圖4和表4。

表4 正常NCM460細(xì)胞與NCM460-M-P30細(xì)胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖4 TGF-β1、EGFR和N-cadherin的蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型是指運(yùn)用外源性因素逐漸改變體外培養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境,導(dǎo)致在這種環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)胞發(fā)生惡性表型的改變,主要包括細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、遷移能力及克隆形成能力等方面的改變。由于動(dòng)物細(xì)胞與人類細(xì)胞存在種屬差異,兩組免疫機(jī)能也不同,所以動(dòng)物和人類對(duì)致癌劑的耐受程度不同,在研究癌變過(guò)程中,如果采用動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異。另外,一些促癌劑普遍存在于人類生活環(huán)境,考慮到促癌過(guò)程的長(zhǎng)期性和可逆性,采用人類細(xì)胞深入研究促癌劑促癌的分子作用機(jī)制,對(duì)于人類腫瘤的發(fā)生機(jī)制研究及防治研究具有重要意義。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程[4]。采用人類細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)及惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)探討結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制既能排除免疫系統(tǒng)的干擾,又能更深入地研究長(zhǎng)期暴露于致癌物質(zhì)的細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的各種生物學(xué)特征變化。

MNNG是一種人工合成的亞硝基化合物,是胃腸道腫瘤的化學(xué)致癌物。PMA是一種強(qiáng)促癌劑兼誘導(dǎo)分化劑[5]。本研究聯(lián)合運(yùn)用MNNG和PMA分階段誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞8 h和24 h后,再更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,以減輕誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的毒性損傷,提高細(xì)胞的存活率,保證細(xì)胞連續(xù)傳代誘導(dǎo)的順利實(shí)施。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)30代連續(xù)誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng),排列紊亂,無(wú)細(xì)胞間接觸抑制,提示該細(xì)胞已表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性[6]。

腫瘤細(xì)胞具有無(wú)限增殖的特性,本研究的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)多代連續(xù)誘導(dǎo)后,NCM460-M-P17細(xì)胞、NCM460-M-P30細(xì)胞的增殖能力均較正常NCM460細(xì)胞明顯提高,且以NCM460-M-P30細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)(P<0.05),提示長(zhǎng)期生長(zhǎng)在含有低濃度MNNG和PMA環(huán)境中的NCM460細(xì)胞,其增殖能力會(huì)隨促癌劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

克隆形成能力是指細(xì)胞能夠無(wú)限制地分裂并形成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)的能力。這種能力使得細(xì)胞能夠形成腫瘤組織,促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。正常細(xì)胞由于生長(zhǎng)受限,不能無(wú)限生長(zhǎng),而腫瘤細(xì)胞因失去接觸抑制且具有單克隆生長(zhǎng)能力,能夠呈克隆樣生長(zhǎng)。因此,細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)形成的克隆樣細(xì)胞團(tuán)是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志[7]。本研究中的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)MNNG和PMA多代誘導(dǎo)處理的NCM460細(xì)胞的克隆形成能力顯著提高。這提示經(jīng)促癌劑長(zhǎng)期誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞對(duì)環(huán)境依賴性降低,適應(yīng)能力、自主生存能力及克隆形成能力增強(qiáng),具有惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

轉(zhuǎn)移能力是腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵生物學(xué)特征之一,它可以使腫瘤細(xì)胞能夠從原發(fā)病灶轉(zhuǎn)移到其他組織或器官。這種轉(zhuǎn)移過(guò)程是腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)的重要原因之一,也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要因素。本研究的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NCM460-M-P17細(xì)胞及NCM460-M-P30細(xì)胞的遷移能力較正常NCM460細(xì)胞提高(P<0.05),說(shuō)明促癌劑可能會(huì)導(dǎo)致NCM460細(xì)胞遷移能力異常增強(qiáng),進(jìn)而使其具有腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性。

N-cadherin、TGF-β1、EGFR是最常見的與腫瘤侵襲和遷移有關(guān)的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,與正常NCM460細(xì)胞比較,NCM460-M-P30細(xì)胞中N-cadherin、TGF-β1和EGFR蛋白表達(dá)水平升高,這進(jìn)一步從分子水平說(shuō)明了促癌劑長(zhǎng)期誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞可使其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

綜上所述,經(jīng)過(guò)MNNG和PMA促癌劑連續(xù)多代誘導(dǎo)處理后,NCM460細(xì)胞的生物學(xué)功能(增殖、克隆形成和遷移能力)發(fā)生明顯改變,具備惡性細(xì)胞的生物學(xué)特征。該建模方法為深入研究結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制提供了新思路。但本研究未深入分析MNNG和PMA誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制,也未進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn),今后需要進(jìn)一步完善研究?jī)?nèi)容,以更好地探討結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)制。