雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù)用于牛結(jié)核病快速診斷的研究

歐喜超 趙冰 滕沖 張思琦 許曄 邢睿達(dá) 裴少君 夏輝 王勝芬 范偉興 趙雁林

【Fundprogram】 National Key Research and Development Program (2022YFC2305204); Key Research and Development Plan of Tibet Autonomous Region (XZ202201ZY0007N-01)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)感染引起的人畜共患疾病。牛分枝桿菌是MTBC中宿主范圍最為廣泛的菌種,可感染人和牛等50多種哺乳動物和20多種禽類[1]。在家畜中,牛對MTBC菌株最易感,牛結(jié)核病在我國被列為二類動物疫病,是一種慢性消耗性傳染病。目前,我國對動物結(jié)核病主要采取“監(jiān)測、檢疫、撲殺、消毒”的綜合防控措施,但仍缺乏快速診斷的有效方法。因此,準(zhǔn)確診斷牛結(jié)核病,對于有效降低檢疫凈化成本、控制人畜共患結(jié)核病,進(jìn)而徹底消除結(jié)核病對人類的危害具有十分重要的意義[2-4]。

結(jié)核病病原學(xué)診斷技術(shù)主要包括抗酸桿菌染色涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢測。動物樣本涂片鏡檢陽性率較低,培養(yǎng)試驗(yàn)耗時長,不適用于牛結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)。分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有較成熟的檢測靶標(biāo),操作簡單快捷,被認(rèn)為是最有潛力的一類結(jié)核病診斷技術(shù)。Xpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)和Xpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)檢測試劑盒是在美國Cepheid公司GeneXpert檢測系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,研發(fā)出來的MTB全封閉自動化檢測試劑盒,該試劑盒可實(shí)現(xiàn)對MTB和利福平耐藥的快速檢測[5],已被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病檢測項(xiàng)目,對全球結(jié)核病控制做出了很大的貢獻(xiàn)[6]。然而,昂貴的試劑設(shè)備和維護(hù)成本阻礙了這一檢測系統(tǒng)在動物結(jié)核病早期診斷領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。

本研究通過針對MTBCIS6110和IS1081基因,開發(fā)雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù),結(jié)合自動化核酸提取檢測設(shè)備,探索雙靶標(biāo)熒光PCR檢測特異度和動物組織樣本檢出限,通過對有明顯結(jié)核病變的奶牛組織病料進(jìn)行液體培養(yǎng)、Xpert、Xpert Ultra 和雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測,評價(jià)雙靶標(biāo)熒光PCR檢測在剖檢奶牛病料中檢測MTBC的效能。

材料和方法

一、材料和試劑

1．樣本來源:用接種環(huán)刮取2～3周新鮮牛分枝桿菌(ATCC 19210)菌落,使用細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀制備1麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?進(jìn)行10倍系列稀釋后接種到無菌培養(yǎng)皿,完成培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù),獲得起始菌液的菌落數(shù)(colony forming unit,CFU)。將1麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙和ㄟ^梯度稀釋制備6種不同濃度的菌懸液(2500 CFU/ml,1250 CFU/ml,625 CFU/ml,313 CFU/ml,156 CFU/ml,78 CFU/ml)。使用組織研磨儀將健康牛肺組織制成乳劑后混入牛分枝桿菌菌懸液,制備6種不同菌液濃度的牛肺病料,用于雙靶標(biāo)熒光PCR體系的最低檢測限分析。

于2022年5月,在河北省選取2家牛場,對存欄的奶牛進(jìn)行牛結(jié)核病篩查,對篩查出的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(PPD試驗(yàn))和γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)陽性奶牛進(jìn)行無害化處理,在無害化處理場無菌采集有明顯結(jié)核病變的35頭奶牛組織病料并送至中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室?，F(xiàn)場共采集50份結(jié)核病變明顯的病料,病變部位可見明顯結(jié)節(jié)、膿液或壞死,實(shí)驗(yàn)室人員收到病料后立即開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測。

2.主要設(shè)備和試劑:Lab-Aid 824s(180014)核酸提取儀,SLAN-96S全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng),GeneXpert檢測設(shè)備,MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng),組織研磨儀。Xpert和Xpert Ultra試劑盒均購自美國Cepheid公司,BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)管購自美國BD公司。核酸酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP和10×PCR緩沖液由廈門致善生物科技股份有限公司提供。

3.引物和探針:從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載基因IS6110(GenBank檢索號:X17348.1)和IS1081(GenBank檢索號:888515)核苷酸序列,使用軟件Primer Premier 5.0和OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)設(shè)計(jì)引物和探針(表1)。通過Blast分析確認(rèn)PCR引物對MTBC菌株的特異性。所有引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 不同分子生物學(xué)技術(shù)檢測奶牛組織病料對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測效能分析

二、研究方法

1. 病料前處理:肺部淋巴結(jié)組織在生物安全柜內(nèi)用無菌手術(shù)剪和手術(shù)鑷剝?nèi)ブ竞徒M織被膜,挑取0.5 g病變組織放入帶有5 mm和3 mm研磨珠的2 ml無菌研磨管,加入0.3 ml生理鹽水,然后將研磨管放入組織研磨儀進(jìn)行研磨(60 Hz,90 s),將研磨后病料分裝至3管50 ml離心管中,分別進(jìn)行液體培養(yǎng)、Xpert、Xpert Ultra和雙靶標(biāo)熒光PCR檢測。

2. MGIT 960液體培養(yǎng):將50 ml 6% NaOH溶液、50 ml 2.9%檸檬酸鈉和0.5 g N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)混合,配置100 ml NALC-NaOH消化液,在生物安全柜內(nèi)向裝有研磨后病料的50 ml離心管內(nèi)加入2倍體積NALC-NaOH消化液,作用15 min后,在生物安全柜內(nèi)打開離心管蓋,加入0.067 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液至45 ml,以 3000×g離心15 min后,棄去上清液,加入1 ml磷酸鹽緩沖液混勻后進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)。陽性培養(yǎng)物進(jìn)行MPT64抗原初步菌種鑒定[7]和全基因組測序菌種鑒定[8]。

3.熒光PCR檢測:擴(kuò)增體系包含:1×PCR緩沖液,400 nmol/L上游引物和下游引物,200 nmol/L探針,3 mmol/L鎂離子,0.24 mmol/L dNTP,2 UTaqDNA聚合酶。體系擴(kuò)增程序:退火95 ℃,退火溫度68 ℃(每循環(huán)降低1 ℃),延伸72 ℃,共10個循環(huán);退火95 ℃,退火溫度58 ℃,延伸71 ℃,共45個循環(huán)。

取500 μl研磨后的病料,放置在5 ml凍存管中,加入1000 μl研磨消化液,再加入10 μl核酸酶和20 μl蛋白酶K,上下顛倒混勻數(shù)次,37 ℃溫浴10 min,99 ℃加熱10 min,取全部上清液進(jìn)行核酸提取。使用Lab-Aid 824 MTB核酸提取Maxi試劑盒提取上述病料樣本,每種樣本提取1份,提取結(jié)束后將核酸取出,放于EP管內(nèi)備用。取25 μl提取后的核酸作為模板加入反應(yīng)管。

4.特異性驗(yàn)證:為保證體系對MTBC檢測的特異性,選擇了21種常見非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)進(jìn)行體系特異性驗(yàn)證,包括:猿猴分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、M.agrarius、潰瘍分枝桿菌、胃分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、淺黃分枝桿菌。加入與模板體積相等的雙蒸水作為無模板對照。

5.GeneXpert檢測:將Xpert和Xpert Ultra試劑盒配套的處理液加入到含有前處理后病料的離心管中,渦旋振蕩后靜置15 min,將處理后樣品由加樣孔緩慢加入到反應(yīng)盒內(nèi),然后上機(jī)并讀取檢測結(jié)果[9-10]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料以“百分率(%)”描述,組間差異的比較采用配對χ2檢驗(yàn)(McNemar test),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Probit概率模型計(jì)算肺組織病料雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測的檢出限;采用四格表的形式計(jì)算檢測技術(shù)的敏感度和特異度,評價(jià)不同分子生物學(xué)檢測技術(shù)對牛分枝桿菌的檢測效能。

結(jié) 果

一、雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測特異性和檢出限

使用1株MTB(H37Rv)、1株牛分枝桿菌和21株 NTM菌株的DNA作為雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測的檢測模板。只有MTB和牛分枝桿菌菌株的DNA顯示陽性結(jié)果,檢測NTM DNA或空白對照時,均未觀察到擴(kuò)增曲線。雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測MTBC的特異度為100.0%(21/21)。

雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測在人工肺組織樣本牛分枝桿菌(ATCC 19210)菌液濃度為600 CFU/ml以上時,檢測命中率均為100.0%(20/20),對菌液濃度為300、250、200、150、100、50和10 CFU/ml組織樣本的陽性檢出率分別下降到95.0%(19/20)、90.0%(18/20)、85.0%(17/20)、85.0%(17/20)、45.0%(11/20)、0(0/20)、0(0/20)。通過使用概率模型計(jì)算,雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測組織樣本牛分枝桿菌的檢出限為244.4 CFU/ml(95%CI:91.9～158.2 CFU/ml)。

二、剖檢奶牛病料基本情況

通過剖檢PPD試驗(yàn)和IGRA檢測陽性奶牛,在35頭奶牛中發(fā)現(xiàn)有明顯的結(jié)核病變,共無菌采集50份病料,其中,腸系膜淋巴結(jié)病料3份(6.0%),肺淋巴結(jié)病料15份(30.0%),肺門淋巴結(jié)病料13份(26.0%),肝門病料6份(12.0%),乳房病料3份(6.0%),脾臟病料1份(2.0%),不詳9份(18.0%)。送檢全部病料均存在不同程度的結(jié)核病變,切開結(jié)核病變可見大量的干酪樣物質(zhì)。

三、不同方法檢測陽性率比較

在50份送檢病料中,液體培養(yǎng)、Xpert、Xpert Ultra和雙靶標(biāo)熒光PCR檢測陽性率分別為64.0%(32/50)、56.0%(28/50)、78.0%(39/50)和76.0%(38/50)。雙靶標(biāo)熒光PCR檢測陽性率明顯高于Xpert檢測陽性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.456,P=0.035);雙靶標(biāo)熒光PCR檢測陽性率與Xpert Ultra檢測陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.056,P=0.812)。32株分離培養(yǎng)陽性菌株,經(jīng)全基因組測序比對發(fā)現(xiàn)全部為牛分枝桿菌。

四、不同方法檢測效能評價(jià)

排除1份Xpert檢測失敗、1份Xpert Ultra檢測失敗和2份培養(yǎng)污染病料,共46份病料可用于診斷效能評價(jià)。以液體培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn),Xpert、Xpert Ultra和雙靶標(biāo)熒光PCR檢測MTBC的敏感度分別為77.4%(24/31)、96.8%(30/31)和90.3%(28/31)。雙靶標(biāo)熒光PCR檢測敏感度明顯高于Xpert檢測,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.165,P=0.017),與Xpert Ultra檢測敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.069,P=0.301),見表1。

討 論

動物結(jié)核病控制的首要任務(wù)是快速準(zhǔn)確地找出傳染源,及時切斷傳播途徑。目前常用牛結(jié)核病篩查方法為PPD試驗(yàn)。PPD試驗(yàn)是世界動物衛(wèi)生組織推薦的診斷牛結(jié)核病的主要方法,該方法在牛結(jié)核病的診斷與防控過程中發(fā)揮了重要作用。但PPD試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性會受到牛只個體差異、人為判定誤差、環(huán)境分枝桿菌干擾(如禽分枝桿菌),以及PPD試劑質(zhì)量的影響,診斷準(zhǔn)確性較差[11]。與PPD試驗(yàn)相比,IGRA不受大多數(shù)非致病分枝桿菌的影響,具有更高的敏感度和特異度,但仍然會受到少部分非致病性分枝桿菌(如禽分枝桿菌)干擾,造成一定的假陽性,導(dǎo)致檢測陽性牛剖檢后無法找到結(jié)核病變,無法對剖檢牛進(jìn)行最終確診[12]。本研究發(fā)現(xiàn),通過對PPD試驗(yàn)和IGRA檢測陽性奶牛進(jìn)行剖檢后,取病變組織開展MTBC分子檢測,可及早確診牛結(jié)核病,提高牛結(jié)核病檢測的特異度,進(jìn)而可以通過對牛場及早開展干預(yù)措施,避免牛結(jié)核病在人群和動物中的進(jìn)一步傳播。本研究通過將奶牛病料消化處理后采用MGIT 960液體培養(yǎng)方法進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng),分枝桿菌的分離培養(yǎng)陽性率較高,分離培養(yǎng)陽性菌株有助于下一步通過全基因組測序或基因分型研究,掌握我國感染牛分枝桿菌的遺傳進(jìn)化和流行特征。本研究發(fā)現(xiàn),剖檢動物樣本MTBC 分子檢測陽性率高于液體培養(yǎng)試驗(yàn),且檢測快速。因此,推廣新型MTBC分子檢測技術(shù),對于提高動物結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確性和及時性,深入研究動物結(jié)核病流行傳播等至關(guān)重要[13]。

常用MTBC分子檢測靶標(biāo)基因包括IS6110、IS1081、16SrRNA、gyrB和rpoB基因等,以IS6110和IS1081等多拷貝基因?yàn)榘袠?biāo)的檢測技術(shù)其敏感度明顯高于單拷貝基因檢測技術(shù)。但I(xiàn)S6110并非存在于所有MTBC菌株中,極少部分MTBC菌株中拷貝數(shù)較低甚至缺失,可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。由于卡介苗菌株僅含有1個IS6100拷貝,但含有5個IS1081拷貝,牛分枝桿菌IS1081拷貝數(shù)通常高于IS6110拷貝數(shù)[14],因此,對多個靶標(biāo)基因進(jìn)行聯(lián)合檢測,對牛結(jié)核病早期診斷具有十分重要的意義。目前臨床運(yùn)用非常廣泛的Xpert檢測是一種以半巢式實(shí)時定量PCR為基礎(chǔ)的全自動一體化檢測技術(shù),可同時檢測MTB和利福平耐藥性,操作簡便,結(jié)果報(bào)告時間短,第2代Xpert Ultra以IS6110和IS1081為檢測靶標(biāo),其檢測敏感度明顯提高,特異度略有降低[10]。但由于Xpert檢測需要專用的檢測設(shè)備,檢測通量低且試劑成本較高,限制了其在動物結(jié)核病早期診斷領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。熒光PCR檢測試劑盒屬于開放性的檢測產(chǎn)品,可在通用的實(shí)時熒光PCR儀上使用,不需要額外的檢測設(shè)備,每批最多可以檢測94個樣本,適合開展大范圍檢測。本研究發(fā)現(xiàn),雙靶標(biāo)實(shí)時熒光PCR檢測組織樣本牛分枝桿菌的檢出限為244.4 CFU/ml,而文獻(xiàn)報(bào)到Xpert檢測含卡介苗人工痰的檢出限為344.1 CFU/ml,Xpert Ultra檢測含卡介苗人工痰的檢出限為143.4 CFU/ml[14],這可能與組織樣本核酸提取過程復(fù)雜,造成核酸損耗較多有關(guān)。本研究通過對病料樣本同時進(jìn)行上述3種分子檢測,發(fā)現(xiàn)雙靶標(biāo)熒光PCR檢測MTBC陽性率明顯高于Xpert檢測,與Xpert Ultra檢測陽性率無明顯差異;以液體培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)雙靶標(biāo)熒光PCR檢測MTBC的敏感度也明顯高于Xpert檢測,與Xpert Ultra檢測敏感度無明顯差異。但雙靶標(biāo)熒光PCR檢測成本明顯降低,檢測通量大,適合在動物結(jié)核病早期診斷領(lǐng)域進(jìn)行推廣使用。

本研究局限性在于未能采集活畜體液標(biāo)本進(jìn)行檢測,下一步將進(jìn)一步評價(jià)雙靶標(biāo)熒光PCR檢測技術(shù)在動物體液樣本中檢測MTBC的可行性。本研究發(fā)現(xiàn),組織病料結(jié)核病變奶牛已處于結(jié)核病后期感染階段,2家牛場已發(fā)生牛結(jié)核病的聚集性感染,建議下一步采集奶牛痰液、乳汁、尿液和糞便樣本進(jìn)行分子生物學(xué)檢測,早期發(fā)現(xiàn)并有效控制傳染源,避免牛結(jié)核病的進(jìn)一步流行傳播。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)歐喜超:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計(jì)分析;趙冰:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù);滕沖:采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析;張思琦:采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;許曄:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、起草文章;邢睿達(dá):實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù);裴少君:分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、指導(dǎo);夏輝:分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo);王勝芬:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、統(tǒng)計(jì)分析、指導(dǎo);范偉興:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo);趙雁林:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、指導(dǎo)