“樸實(shí)方”對慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸Cajal 細(xì)胞及SCF/c-Kit 信號(hào)通路的影響

趙向東 王貝貝 李芳斕 曹永清 王可為

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 230023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇南京 210022）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是功能性便秘的一種，以結(jié)腸傳輸功能障礙，腸內(nèi)容物通過緩慢為主要特點(diǎn)，主要癥狀為排便困難，并伴有排便頻次降低、糞便干燥堅(jiān)硬等表現(xiàn)[1]。本病全球發(fā)病率為14%，其中我國發(fā)病率為4.0%～10.0%[2-3]。便秘會(huì)增加結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，誘發(fā)心腦血管疾病，常伴有焦慮、抑郁、睡眠障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of cajal，ICC）在胃腸道動(dòng)力障礙性疾病中具有重要作用[5]。ICC的特異受體酪氨酸激酶受體（c-Kit）及其天然配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）構(gòu)成的信號(hào)途徑對ICC的發(fā)生、發(fā)育及功能維持具有重要的調(diào)控作用[6]。

樸實(shí)方為龍華醫(yī)院曹永清教授治療便秘的經(jīng)驗(yàn)方，基于四君子湯化裁，加入枳實(shí)、厚樸、丹參等以活血行氣、健脾益氣，治療便秘臨床療效顯著[7]。本研究使用復(fù)方地芬諾酯建立STC小鼠模型，觀察樸實(shí)方對STC模型小鼠SCF/c-Kit信號(hào)通路的影響，以挖掘樸實(shí)方治療STC的作用機(jī)制，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡ICR雄性小鼠50只，體質(zhì)量（27±2）g，購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度為16～22 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水與進(jìn)食，晝夜光照交替12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：PZSHUTCM19030835）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 樸實(shí)方凍干粉：樸實(shí)方藥物組成為黨參20 g、茯苓15 g、白術(shù)20 g、厚樸15 g、枳實(shí)15 g、丹參30 g，飲片均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。中藥飲片加入1100 mL超純水，完全浸泡30 min，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火再煎煮30 min，將藥液倒出，剩余藥材重復(fù)上述步驟再次煎煮。2次水煎藥液合并、過濾、蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥，凍干粉置于-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)開始前先配制成濃度為1.70 g/mL（高劑量）的母液，再取部分母液用超純水稀釋成0.85 g/mL（低劑量）濃度使用。復(fù)方地芬諾酯片（常州康普藥業(yè)有限公司，批號(hào)1807013），研磨成粉，用蒸餾水配制成濃度1 mg/mL的混懸液。琥珀酸普蘆卡必利片（prucalopride，Janssen Cilag S.P.A公司，批號(hào)IEL0X00），研磨成粉，用蒸餾水配制成濃度0.03 mg/mL的混懸液。

1.3 主要試劑 活性炭（2018090716，廣州鴻生炭業(yè)化工有限公司），阿拉伯樹膠（2018040506，合肥博美生物科技責(zé)任有限公司），SCF酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法試劑盒（00502072019，上海司鼎生物科技有限公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSQ-101，日本TOYOBO公司），BCA蛋白試劑盒（P0012S，碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.4 主要儀器 熒光定量PCR分析儀（STEPONE，美國ABI公司），Mini pate spinner（MPS1000，美國Labnet公司），穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-6B，北京六一生物科技有限公司），高速冷凍離心機(jī)（450R，德國eppendorf公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-1，上海梅香儀器有限公司），臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)（L535R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），熒光倒置顯微鏡（IX71，日本OLYMPUS公司），凍干機(jī)（Alpha2-4/LD plus，德國CHRIST公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R220SE，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 50只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組和樸實(shí)方低、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組小鼠予復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃造模，給藥劑量為每日10 mg/kg，1次/d，連續(xù)14 d[8]。當(dāng)小鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少、體質(zhì)量減輕和大便粒型小、干硬等表現(xiàn)時(shí)，表明造模成功。正常組以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。此期間若出現(xiàn)小鼠死亡，則予補(bǔ)足，以確保造模完成后各組鼠數(shù)均為10只。

2.2 給藥 造模完成后，陽性對照組灌胃給予琥珀酸普蘆卡必利混懸液0.3 mg/（kg·d），樸實(shí)方高、低劑量組分別灌胃給予相應(yīng)中藥溶液17.0、8.5 g/（kg·d），正常組、模型組每日灌胃給予同體積生理鹽水，各組均每日灌胃1次，給藥體積均為0.1 mL/10 g，連續(xù)14 d。

2.3 取材 末次給藥結(jié)束后，各組小鼠禁食不禁水24 h，管飼法灌胃0.2 mL 5%活性炭，30 min后眼眶采血，脫頸椎處死，取腸管進(jìn)行腸道推進(jìn)功能檢測，完成后截取適當(dāng)長度結(jié)腸，使用PBS溶液將結(jié)腸內(nèi)的糞便清洗干凈，截取3 段長1～2 cm的結(jié)腸組織，其中1 段浸泡于10%多聚甲醛中，2 段放入凍存管并立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存，以待后續(xù)檢測使用。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 測定炭末推進(jìn)率觀察腸道推進(jìn)功能 各組小鼠灌胃活性炭30 min后，取包括胃和直腸末端在內(nèi)的整個(gè)腸管，在腸道保持充分松弛情況下量取其腸道總長度及活性炭染色的腸管長度，計(jì)算炭末推進(jìn)率（即為腸道推進(jìn)率）。炭末推進(jìn)率（%）=（炭末前沿至幽門的距離/腸道總長度）×100%。

2.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察結(jié)腸組織學(xué)特征 取浸泡于10%多聚甲醛中固定的各組小鼠結(jié)腸組織，按照脫水、透明、浸蠟、包埋的順序處理，切片、撈片、烤片，依次予二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇浸泡，自來水漂洗，蘇木素、鹽酸染色，自來水返藍(lán)，1%伊紅染色，最后使用95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.3 ELISA法檢測血清SCF水平 取各組小鼠血清，按ELISA試劑盒說明書上的方法檢測小鼠血清中SCF含量。

2.4.4 RT-PCR法檢測結(jié)腸組織SCF、c-Kit mRNA表達(dá) 取凍存的各組小鼠結(jié)腸組織約100 mg，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，嚴(yán)格按照SYBR試劑盒操作，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA使用2 μL，反應(yīng)條件為首先95 ℃持續(xù)2 min進(jìn)行預(yù)變性，隨后95 ℃持續(xù)5 s，60 ℃持續(xù)10 s，連續(xù)35～40個(gè)循環(huán)后檢測溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，采用2-△△Ct計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 c-Kit、SCF及內(nèi)參引物序列

2.4.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白表達(dá) 取凍存的各組小鼠結(jié)腸組織，快速研磨碾碎，收集蛋白樣品，測定濃度；加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上清緩沖液進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜室溫封閉1 h，PBST沖洗3 次；二抗孵育，重復(fù)上述操作。采用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，將PVDF膜加入化學(xué)發(fā)光底物，后將其置入增光屏的暗盒中曝光，掃描圖片顯影、定影。以GAPDH單抗檢測作為內(nèi)參對照，使用Image J軟件分析各組蛋白的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。正常組和模型組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；模型組與各給藥組比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠腸道推進(jìn)率比較 模型組小鼠的腸道推進(jìn)率明顯低于正常組（P＜0.01），樸實(shí)方高、低劑量組及陽性對照組小鼠腸道推進(jìn)率明顯高于模型組（P＜0.01）。各給藥組組間腸道推進(jìn)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腸道推進(jìn)率比較（）

表2 各組小鼠腸道推進(jìn)率比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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3.2 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)特征比較 正常組小鼠結(jié)腸黏膜表面光滑，可見大量腺體，無明顯水腫充血；模型組小鼠結(jié)腸肌層厚度降低，腺體數(shù)量減少，出現(xiàn)明顯充血、水腫；樸實(shí)方高劑量組及陽性對照組小鼠結(jié)腸組織肌層厚度較模型組明顯增加，腺體數(shù)量增加，排列較整齊，充血水腫明顯改善；樸實(shí)方低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜組織病理改變僅輕度改善。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理表現(xiàn)（HE，×200）

3.3 各組小鼠血清SCF含量比較 模型組小鼠血清SCF含量顯著低于正常組（P＜0.01）；樸實(shí)方高、低劑量組和陽性藥物組小鼠血清SCF含量明顯高于模型組（P＜0.01）；各給藥組組間SCF含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清SCF含量比較（）

表3 各組小鼠血清SCF含量比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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3.4 各組小鼠結(jié)腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達(dá)量比較 模型組小鼠結(jié)腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達(dá)量顯著低于正常組（P＜0.01）；樸實(shí)方高、低劑量組和陽性對照組小鼠上述指標(biāo)明顯高于模型組（P＜0.01）；上述指標(biāo)各給藥組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達(dá)量比較（）

表4 各組小鼠結(jié)腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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3.5 各組小鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白表達(dá)比較 模型組小鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白相對表達(dá)量明顯低于正常組（P＜0.01）；樸實(shí)方高、低劑量組和陽性對照組小鼠上述蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；上述指標(biāo)各給藥組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表5。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白電泳圖

表5 各組小鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白相對表達(dá)量比較（）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白相對表達(dá)量比較（）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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4 討論

慢傳輸型便秘是以腸道傳輸功能減退為特點(diǎn)的頑固性便秘，本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為與腸道神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、ICC細(xì)胞損傷、胃腸道激素水平異常、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、腸道菌群失調(diào)、精神心理因素、腸道平滑肌形態(tài)和功能異常等因素相關(guān)[4]。由于本病病因復(fù)雜，癥狀頑固，臨床治療往往難以取得滿意效果。目前主要的治療手段有外科手術(shù)、中西藥物治療、針灸、物理療法及心理精神治療等，其中口服西藥包括促動(dòng)力藥、容積性瀉藥、滲透性瀉藥、刺激性瀉藥、潤滑劑等。本研究的陽性藥物普蘆卡必利是新型二氫苯并呋喃甲酰胺衍生物的代表藥物，可特異并選擇性激動(dòng)和表達(dá)腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元5-羥色胺（5-HT）受體，誘導(dǎo)腸道高幅推進(jìn)性收縮，具有顯著的促動(dòng)力作用。

本研究采用復(fù)方地芬諾酯灌胃誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸傳輸功能紊亂。復(fù)方地芬諾酯是用于治療腹瀉的傳統(tǒng)藥物，長期服用會(huì)導(dǎo)致大腸中的水分被過度吸收，抑制腸道運(yùn)動(dòng)并引起便秘，但它不影響造模小鼠的正常生理功能，并接近便秘的臨床癥狀，是一種有效的功能性便秘造模藥物[9]。

中醫(yī)學(xué)對便秘的認(rèn)識(shí)由來已久，《傷寒論·辨脈法》提出：“其脈浮而數(shù)，能食，不大便者，此為實(shí)，名曰陽結(jié)也?！魂幗Y(jié)也?！辈苡狼褰淌谡J(rèn)為STC的主要病機(jī)是中焦失調(diào)、氣郁濕阻、血瘀腸絡(luò)[7]，自擬“樸實(shí)方”，臨床療效顯著。樸實(shí)方由黨參、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、厚樸、丹參組成。其中黨參、茯苓、白術(shù)為該方主藥，來源于四君子湯。原方中人參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；臣以苦溫之白術(shù)，健脾燥濕，加強(qiáng)益氣助運(yùn)之力；佐以甘淡的茯苓，健脾滲濕，苓術(shù)相配，則健脾祛濕之功益著。STC患者大便困難，腑氣不通，故加厚樸寬腸下氣、化滯除脹，枳實(shí)行氣消積，二藥共用調(diào)暢氣機(jī)而除痞滿，以消無形之氣滯；輔以丹參活血通絡(luò)。

目前STC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究發(fā)現(xiàn)Cajal間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能異?？蓪?dǎo)致腸道傳輸功能紊亂，而Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與表型的改變與SCF/c-Kit通路密切相關(guān)[10]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞主要分布于結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌之間，是胃腸道平滑肌的慢波起搏細(xì)胞，參與慢波的形成，介導(dǎo)腸道神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)控胃腸道肌肉收縮功能[11-13]。STC的發(fā)病機(jī)制與胃腸道運(yùn)動(dòng)能力下降有關(guān)，而起源于環(huán)肌和縱肌交界區(qū)內(nèi)的慢波可通過各肌層Cajal間質(zhì)細(xì)胞傳導(dǎo)電信號(hào)來影響胃腸道運(yùn)動(dòng)功能[14]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠腸道推進(jìn)率明顯降低，經(jīng)過樸實(shí)方和琥珀酸普蘆卡必利干預(yù)后明顯改善，小鼠的腸道運(yùn)動(dòng)能力明顯加強(qiáng)，其中樸實(shí)方高、低劑量和琥珀酸普蘆卡必利療效相當(dāng)，可供臨床參考。本研究還發(fā)現(xiàn)樸實(shí)方對STC模型小鼠腸道運(yùn)動(dòng)能力的改善無明顯劑量依賴性，可為臨床用藥的合理劑量提供依據(jù)。

c-Kit是ICC的特異性標(biāo)志物，屬受體酪氨酸激酶家族第3亞類，與其配體SCF結(jié)合后所啟動(dòng)的信號(hào)通路，對ICC的發(fā)育、分化及表型維持至關(guān)重要，是直接反映ICC數(shù)量和密度的標(biāo)簽。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，STC患者結(jié)腸組織c-Kit mRNA及其蛋白表達(dá)降低，提示SCF/c-Kit信號(hào)通路在結(jié)腸Cajal細(xì)胞減少、結(jié)腸運(yùn)輸障礙所引起的STC中發(fā)揮重要作用[15-16]。ICC配體SCF來源于神經(jīng)元細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，可促進(jìn)ICC的發(fā)生和分化，并維持其正常的生理功能[17]。研究表明，ICC細(xì)胞的數(shù)量及功能和SCF/c-Kit信號(hào)通路密切相關(guān)。SCF是c-Kit的天然配體，每個(gè)c-Kit單體都通過細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與SCF結(jié)合。在SCF二聚化之后，c-Kit單體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并產(chǎn)生同源二聚化，導(dǎo)致細(xì)胞膜中氨基酸殘基的自動(dòng)磷酸化并刺激各種第2信號(hào)分子來調(diào)節(jié)ICC的細(xì)胞功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，STC模型小鼠的結(jié)腸肌層厚度降低，腺體數(shù)量減少且充血、水腫，血清SCF含量下降，結(jié)腸組織c-Kit、SCF mRNA及其蛋白表達(dá)均顯著下降，經(jīng)樸實(shí)方和琥珀酸普蘆卡必利治療后上述病理表現(xiàn)和指標(biāo)都得到明顯改善，各給藥組小鼠血清SCF含量和結(jié)腸組織c-Kit、SCF mRNA及其蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明樸實(shí)方在對SCF便秘小鼠的治療過程中可以激活SCF/c-Kit信號(hào)通路，修復(fù)ICC并增加其數(shù)量。

綜上，樸實(shí)方可提高小鼠腸道推進(jìn)率，改善小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，上調(diào)結(jié)腸組織中c-Kit和SCF的表達(dá)，激活SCF/c-Kit信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸ICC增殖，增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)，從而改善小鼠便秘狀態(tài)。本研究初步闡釋了樸實(shí)方治療STC的作用機(jī)制，然而中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)作用，課題組擬進(jìn)一步探討樸實(shí)方有效成分及其他作用靶點(diǎn)，深入研究其作用機(jī)制，從而更好地指導(dǎo)臨床用藥。此外，本實(shí)驗(yàn)中樸實(shí)方達(dá)到和普蘆卡必利相似的治療效果，比預(yù)期結(jié)果好，可能存在其他作用機(jī)制出現(xiàn)了疊加效果，也值得設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究。