豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光微球抗體檢測(cè)方法的建立

劉明瑞，殷笑丹，楊曉帆，呂園園

（禾旭（鄭州）生物技術(shù)有限公司，河南鄭州 450000）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種以母豬繁殖障礙和各生長(zhǎng)階段豬發(fā)生呼吸道疾病為特征的嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，在我國(guó)俗稱“藍(lán)耳病”。PRRS的病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可長(zhǎng)期存在于豬群中，其主要傳播途徑是接觸傳播，還可通過空氣和精液傳播[1]。

時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)（time-resolved fluorescence immunochromatography，TRFIA）是20世紀(jì)80年代初在傳統(tǒng)熒光免疫分析基礎(chǔ)上創(chuàng)立的一種新型非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。與傳統(tǒng)熒光素標(biāo)記不同，它所用的示蹤物是具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物，可以有效排除待檢樣品自然熒光干擾，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好以及無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，在臨床免疫檢驗(yàn)和科學(xué)研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。人血清降鈣素原快速定量檢測(cè)方法[2]、甲胎蛋白熒光微球TRFIA定量檢測(cè)方法[3]等多種人體疾病診斷產(chǎn)品均基于TRFIA并已商品化生產(chǎn)銷售。應(yīng)用熒光微球建立的禽白血病病毒抗原檢測(cè)技術(shù)也取得了良好的應(yīng)用效果[4]。目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上暫無(wú)此類產(chǎn)品應(yīng)用于PRRSV抗體檢測(cè)的報(bào)道。

本研究以PRRSV重組N蛋白為包被蛋白，建立了檢測(cè)PRRSV抗體的熒光微球免疫層析方法，為PRRS血清學(xué)診斷、免疫抗體檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查提供了簡(jiǎn)便、快速的手段，具有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和耗材

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PRRSV重組N蛋白，由禾旭（鄭州）生物技術(shù)有限公司制備和保存；PRRSV抗體陽(yáng)性/陰性血清，以及豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）陽(yáng)性血清，由禾旭（鄭州）生物技術(shù)有限公司采集和鑒定；熒光微球，購(gòu)自輝質(zhì)生物公司；羊抗豬二抗、兔抗羊二抗，購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；硝酸纖維素膜，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；玻璃纖維素膜，購(gòu)自通成紙制品公司。其他試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 熒光微球試紙制備

將熒光微球活化后與羊抗豬二抗共價(jià)偶聯(lián)，制備熒光微球標(biāo)記的羊抗豬二抗，將該標(biāo)記物噴涂于玻璃纖維素膜上，干燥后置于4～30 ℃密封保存，即為熒光微球墊；將兔抗羊二抗和PRRSV重組N蛋白噴涂于硝酸纖維素膜上，干燥后置于4～30 ℃密封保存，即為印膜；采用樣品墊處理液浸透玻璃纖維素膜，干燥后置于4～30 ℃密封保存，即為樣品墊；依次將印膜、吸水墊、熒光微球墊和樣品墊粘貼至PVC底板上（圖1），用切條機(jī)裁切為3.0 mm寬的試紙，裝入卡殼并密封包裝。

圖1 熒光微球試紙示意圖

1.3 最佳反應(yīng)條件篩選

1.3.1 檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）包被質(zhì)量濃度 取若干條硝酸纖維素膜分別編號(hào)，將兔抗羊二抗分別稀釋至終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL，用于包被C線；同時(shí)在每個(gè)C線質(zhì)量濃度下，分別將重組N蛋白稀釋至終質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2和1.6 mg/mL，用于包被T線。以0.8 μL/cm的噴涂量，將不同質(zhì)量濃度的兔抗羊二抗和重組N蛋白溶液噴涂于對(duì)應(yīng)編號(hào)的硝酸纖維素膜上，并保證T線和C線間距為5～6 mm，（37±2）℃干燥2～3 h；與其他組分分別配對(duì)后，以陽(yáng)性和陰性血清對(duì)每個(gè)質(zhì)量濃度組合進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)陽(yáng)性和陰性血清的檢測(cè)結(jié)果比值（P/N）篩選T線和C線的包被質(zhì)量濃度。

1.3.2 羊抗豬二抗包被濃度 以500 μL硼酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.5）重懸已活化的熒光微球，吹打混勻后離心收集沉淀，再用500 μL標(biāo)記緩沖液復(fù)溶；將羊抗豬二抗加入含有500 μL微球液的離心管中，使抗體終質(zhì)量濃度分別為10、20、50和100 μg/mL，吹打混勻，于室溫（15～25 ℃）避光反應(yīng)1.5 h；控制其他條件一致，采用PRRSV陽(yáng)性和陰性血清對(duì)各質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，比較陽(yáng)性和陰性血清的檢測(cè)結(jié)果比值（P/N），確定羊抗豬二抗的最適質(zhì)量濃度。

1.3.3 加樣量 為獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，用微量移液器分別取不同加樣量（30、50、80、100和120 μL）的PRRSV陽(yáng)性血清進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，記錄熒光反應(yīng)結(jié)果，選取最適加樣體系。

1.3.4 血清稀釋倍數(shù) 為降低血清檢測(cè)結(jié)果的背景值，用血清稀釋液將PRRSV陽(yáng)性和陰性血清分別作1、10、20和40倍稀釋，各取等量血清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.3.5 反應(yīng)時(shí)間 在室溫（15～25 ℃）及濕度≤30%環(huán)境中，按上述優(yōu)化后的反應(yīng)條件，分別加入PRRSV陽(yáng)性和陰性血清后，每間隔2 min檢測(cè)1次。將試紙放入便攜式熒光檢測(cè)設(shè)備的插卡口，運(yùn)行儀器并讀取T/C值，以確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.6 臨界值 根據(jù)PRRSV熒光微球檢測(cè)方法對(duì)285份已知背景血清（132份陽(yáng)性血清，153份陰性血清）的檢測(cè)結(jié)果，采用ROC曲線[5]（receiver operating characteristic curve）確定該試紙的陰陽(yáng)判定臨界值。

1.4 敏感性試驗(yàn)

采用人工免疫PRRSV（NVDC-JXA1株）滅活疫苗的方式制備陽(yáng)性血清，經(jīng)美國(guó)愛德士試劑盒檢測(cè)，血清抗體效價(jià)為1:64。用血清稀釋液按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64對(duì)該陽(yáng)性血清進(jìn)行稀釋，以本研究建立的方法對(duì)上述稀釋后的血清進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)為陽(yáng)性的最高血清稀釋度。

1.5 特異性試驗(yàn)

以本研究建立的方法對(duì)PRV、CSFV、PPV和PCV2陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)本方法對(duì)常見豬病毒抗體的特異性。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取10份不同效價(jià)的PRRSV陽(yáng)性血清和5份陰性血清，采用PRRSV熒光微球檢測(cè)方法進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)。

1.7 符合率試驗(yàn)

從鄭州市某養(yǎng)殖場(chǎng)采集184份豬血清，采用美國(guó)愛德士試劑盒檢測(cè)血清背景，同時(shí)以優(yōu)化后的PRRSV熒光微球抗體檢測(cè)方法檢測(cè)，比對(duì)二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)條件篩選

2.1.1 T線和C線包被質(zhì)量濃度 將T線和C線設(shè)定為不同的包被質(zhì)量濃度，統(tǒng)計(jì)陰性和陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果（表1）。在C線兔抗羊二抗質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，且T線重組N蛋白質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，P/N達(dá)到最大（33.90），因此C線和T線的最佳包被質(zhì)量濃度分別為1.5和1.2 mg/mL。

表1 T線和C線包被質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

2.1.2 羊抗豬二抗包被質(zhì)量濃度 將不同量的羊抗豬二抗分別加入微球懸浮液，采用PRRSV陽(yáng)性和陰性血清對(duì)各質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，記錄T線、C線熒光值和T/C。結(jié)果（表2）顯示，隨著羊抗豬二抗標(biāo)記量的增加，T線的熒光值逐漸增加，在標(biāo)記量高于50 μg/mL時(shí)，熒光值趨于平穩(wěn)狀態(tài)，同時(shí)P/N達(dá)到高峰（30.45），表明熒光微球共價(jià)結(jié)合的蛋白量已達(dá)到飽和，因此最佳羊抗豬二抗的標(biāo)記質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

表2 羊抗豬二抗包被質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

2.1.3 加樣量 不同加樣量對(duì)熒光微球標(biāo)記物的釋放效果（圖2）顯示：當(dāng)加樣量低于80 μL時(shí)，硝酸纖維素膜上的T線和C線位置無(wú)熒光條帶，熒光反應(yīng)堆積于熒光微球墊；當(dāng)加樣量為80～100 μL時(shí)，熒光微球墊無(wú)明顯熒光微球殘留，熒光亮線呈規(guī)則狀，且T線和C線熒光強(qiáng)度清晰可見；當(dāng)加樣量增加至120 μL時(shí)，樣品墊處有明顯的液體積留。因此確定加樣量為80～100 μL（相當(dāng)于一次性吸管2～3滴的量）。

圖2 不同加樣量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.1.4 血清稀釋倍數(shù) 用血清稀釋液將PRRSV陽(yáng)性和陰性血清分別作1、10、20和40倍稀釋，各取100 μL血清上樣檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示，當(dāng)血清稀釋比例為1:10時(shí)，P/N達(dá)到最大（35.47）。

表3 血清稀釋倍數(shù)確定結(jié)果

2.1.5 檢測(cè)時(shí)間 以PRRSV陽(yáng)性和陰性血清為測(cè)試樣品，觀察T/C隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。結(jié)果（圖3）顯示，在30 min內(nèi)，陽(yáng)性和陰性血清的T線、C線熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性和陰性血清的T/C，發(fā)現(xiàn)其在15 min后趨于平穩(wěn)，并能在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)。因此，確定反應(yīng)15 min后開始檢測(cè)T/C。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果

2.1.6 臨界值 以真陽(yáng)性率（敏感性）為縱坐標(biāo)，假陽(yáng)性率（100 -特異性）為橫坐標(biāo)，根據(jù)PRRSV熒光微球檢測(cè)方法對(duì)285份血清的檢測(cè)結(jié)果繪制ROC曲線（圖4），發(fā)現(xiàn)所對(duì)應(yīng)的曲線下面積值[6]為0.949，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。對(duì)于曲線上每個(gè)T/C對(duì)應(yīng)的約登指數(shù)（敏感性與特異性之和減1），選擇約登指數(shù)最大值（0.785）對(duì)應(yīng)的T/C（0.1）作為本方法的臨界值，此時(shí)對(duì)應(yīng)的敏感性為87.88%，特異性為90.62%。因此，確定本方法的判定標(biāo)準(zhǔn)：T/C≥0.1，判定為PRRSV抗體陽(yáng)性；T/C＜0.1，判定為PRRSV抗體陰性。

圖4 ROC曲線

2.2 敏感性試驗(yàn)

以美國(guó)愛德士試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)為1:64的陽(yáng)性血清為測(cè)試血清，將其按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64比例稀釋，用建立的PRRSV熒光微球檢測(cè)方法檢測(cè)。結(jié)果（表4）顯示，檢測(cè)為陽(yáng)性的最大稀釋度為1:32，說(shuō)明本方法的敏感性較美國(guó)愛德士試劑盒低1個(gè)滴度。

表4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)

采用PRRSV熒光微球檢測(cè)方法對(duì)4種陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果顯示（表5），PRV、CSFV、PPV和PCV2陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明PRRSV熒光微球檢測(cè)方法的特異性良好。

表5 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

采用PRRSV熒光微球檢測(cè)方法重復(fù)檢測(cè)10份陽(yáng)性血清和5份陰性血清。結(jié)果（表6）顯示，變異系數(shù)為3.71%～8.99%，低于10%。結(jié)果表明PRRSV熒光微球檢測(cè)方法穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 符合率試驗(yàn)

以美國(guó)愛德士試劑盒和PRRSV熒光微球檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)184份血清。結(jié)果（表7）顯示，兩種方法的陽(yáng)性符合率為91.43%（128/140），陰性符合率為90.91%（40/44），總符合率為91.30%（168/184）。結(jié)果表明，兩種方法具有較高的一致性。

表7 符合率試驗(yàn)結(jié)果 單位：份

3 討論

目前PRRS診斷首先是基于流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化等作出初步判斷，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行最終確診。已應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)有病毒分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay，IFA）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[7]和血清中和試驗(yàn)（serum neutralization，SN）等。病毒分離和鑒定多用于急性病例確診和新疫區(qū)確定，其余4種方法主要用于檢測(cè)PRRSV抗體。IPMA需要肉眼判定，主觀性較強(qiáng)，操作過程復(fù)雜，批次間差異大，不適用于大規(guī)模抗體檢測(cè)；IFA敏感性較IPMA高，但同IPMA一樣，需要事先在敏感細(xì)胞上進(jìn)行PRRSV增殖，結(jié)果判定受檢測(cè)人員技術(shù)水平的影響較大；與前兩者相比，間接ELISA更為敏感、特異、快速，且易于標(biāo)準(zhǔn)化，是PRRSV抗體常規(guī)監(jiān)測(cè)和疫病診斷的最佳選擇，但其特異性、敏感性主要取決于包被抗原的免疫原性和純度以及臨界值的確定；SN具有明顯的抗原型別差異，中和抗體在感染后1～2個(gè)月才產(chǎn)生，不適用于早期診斷。

將TRFIA應(yīng)用于PRRSV抗體檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求低，無(wú)需大型儀器設(shè)備，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。與傳統(tǒng)膠體金層析技術(shù)相比，結(jié)合熒光微球作為示蹤物的免疫層析技術(shù)具有更高的靈敏度，同時(shí)熒光分析儀檢測(cè)結(jié)果判定能消除檢測(cè)人員的主觀因素影響，并將結(jié)果數(shù)字化，有利于檢測(cè)數(shù)據(jù)的整理分析及數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。與ELISA方法相比，PRRSV熒光微球抗體檢測(cè)方法更加快速、便捷，更適用于PRRS的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因而在獸醫(yī)診斷方面的發(fā)展?jié)摿Ω鼮榭捎^，市場(chǎng)應(yīng)用廣泛，可為PRRSV抗體快速檢測(cè)提供新的思路。

本研究以高度保守的PRRSV重組N蛋白作為檢測(cè)抗原[8]，通過對(duì)C線和T線包被質(zhì)量濃度等優(yōu)化，采用ROC曲線確定以0.1（T/C）為本方法的臨界值。進(jìn)而對(duì)建立的PRRSV熒光微球抗體檢測(cè)方法進(jìn)行系列驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該方法能夠檢測(cè)出1:32稀釋的PRRSV陽(yáng)性血清，而對(duì)PRV、CSFV、PPV和PCV2陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，重復(fù)檢測(cè)15份血清樣品的變異系數(shù)為3.71%～8.99%，與美國(guó)愛德士試劑盒的符合率為91.30%，說(shuō)明該方法雖然敏感性略低，但特異性和重復(fù)性均良好，與進(jìn)口試劑盒具有較高的一致性。然而該方法的可行性需要進(jìn)一步對(duì)臨床感染樣本進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)與基于NSP7蛋白建立的熒光微球方法相比較[9]，以提高方法的敏感性，從而提高其在PRRS防控和疫苗監(jiān)測(cè)方面的效率。