王 鑫，張洪亮，秦志華，鄭乾坤，黃 娟，董紹明，楊瑞梅，曲光剛，單 虎

（1.山東省預防獸醫(yī)學重點實驗室，青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.得利斯集團有限公司，山東濰坊 262216）

1987年豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）在美國首次暴發(fā)，隨后在許多生豬生產(chǎn)國家廣泛傳播，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。PRRS癥狀較為復雜，主要表現(xiàn)為妊娠母豬呼吸困難、體重減輕、生長狀態(tài)差、繁殖障礙以及各日齡仔豬的呼吸系統(tǒng)癥狀[1]。我國于1991年在臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病。郭寶清等[2]在1996年首次從國內(nèi)發(fā)病豬群中分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。PRRSV是一種囊膜正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，同屬病毒還包括馬動脈炎病毒、小鼠乳酸脫氫酶升高病毒和猴出血熱病毒。GP5是PRRSV主要的衣殼糖蛋白，其相對分子質(zhì)量約為25 kDa，在PRRSV感染和組裝過程中發(fā)揮著重要作用。該蛋白由1個N-末端信號肽（SP）、2個胞外結(jié)構(gòu)域、2個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMS）和1個C-末端細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，在2個胞外域之間存在1個高變區(qū)，與病毒識別靶細胞受體有關(guān)[3-5]。GP5是PRRSV最重要的免疫原性蛋白，具有中和表位，且PRRSV感染后康復豬體內(nèi)中和抗體主要針對GP5[6]。納米抗體（nanobody）天然缺失輕鏈，相對分子質(zhì)量小，僅約15 kDa，是目前最小的功能抗體片段。與傳統(tǒng)單克隆抗體相比，納米抗體擁有更小的體積以及更簡單的結(jié)構(gòu)，成本也相對較低，有更廣闊的應用前景。納米抗體具有更高的特異性和結(jié)合活性，能耐酸、堿、表面活性劑等化學試劑，易于改造，在微生物、哺乳動物細胞系和植物中的表達水平很高[7]。近幾年來，納米抗體在體外診斷、治療性抗體藥物研發(fā)、細胞遞送和腫瘤研究等領(lǐng)域均獲得了廣泛應用[8-10]。

目前，養(yǎng)殖場主要通過合理的疫苗免疫程序來防控PRRS。由于PRRSV極易發(fā)生變異，現(xiàn)有弱毒疫苗無法提供完全保護，且弱毒疫苗免疫豬場后存在毒力返強風險。滅活疫苗雖然免疫效果較弱毒疫苗差，但無散毒風險，在我國養(yǎng)豬場得到了廣泛使用[11]。本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對本實驗室前期淘洗獲得的PRRSV GP5蛋白特異性納米抗體序列（VHHGP5）進行表達，并對所制備的特異性納米抗體進行活性鑒定，以期為PRRS檢測和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

克隆宿主菌E.coliTOP10、表達宿主菌E.coliBL21（DE3）、pCold-SUMO-FLAG載體，均由濱州畜牧獸醫(yī)研究院提供；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，購自NEB公司；T4 DNA連接酶、DL 2 000 DNA Marker、核酸染料，購自Takara公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒，購自O(shè)mega Bio-Tek公司；2×TaqPlus Master Mix（Dye Plus），購自南京諾唯贊公司；Unstained Protein MW Marker，購自賽默飛世爾公司；抗FLAG鼠源單抗、HRP標記的羊抗鼠IgG、氨芐青霉素（ampicillin），為SIGMA公司產(chǎn)品；Ni-NTA親和層析柱，購自常州天地人和生物科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、BCA蛋白定量試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；ImMobilon-P醋酸纖維素膜（PVDF），購自Merck公司；PRRSV GP5蛋白、傳染性法氏囊病毒特異性納米抗體VHHIBDV，由山東綠都生物科技有限公司制備。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

圖1 VHHGP5基因PCR擴增結(jié)果

圖2 菌液PCR鑒定結(jié)果

圖3 VHHGP5納米抗體重組蛋白表達形式鑒定結(jié)果

圖4 純化后VHHGP5蛋白SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果

圖5 Western blot分析結(jié)果

1.2 VHHGP5基因片段擴增

根據(jù)前期本實驗室通過噬菌體展示技術(shù)得到的PRRSV GP5特異性納米抗體基因序列，設(shè)計1對特異性擴增引物（F：5'-CGGGATCCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAG-3'；R：5'-CCCAAGCTTATGAGGAGACGGTGACCAGGGTC-3'）。引物含有BamHI 和HindIII酶切位點，用于將納米抗體基因片段擴增克隆到pCold-SUMO-FLAG載體上，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

以本實驗室前期保存的PRRSV GP5特異性納米抗體基因擴增后的膠回收產(chǎn)物作為模板，利用上述合成的引物對VHHGP5基因進行PCR擴增。PCR反應體系25.0 μL：VHHGP5基因模板1.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，ddH2O 17.5 μL。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 35 s，67 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物在120 V 25 min條件下進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，400 bp大小的電泳條帶即目的條帶，切除目的條帶并進行膠回收。

1.3 納米抗體重組表達載體構(gòu)建

使用BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶，分別對VHHGP5膠回收產(chǎn)物和pCold-SUMO-FLAG重組質(zhì)粒進行雙酶切，回收并純化酶切產(chǎn)物，以T4 DNA連接酶連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10感受態(tài)細胞，最后涂布于LB平板，置于37 ℃溫箱過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行PCR鑒定，對鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒，并送至生工生物工程有限公司進行測序，若測序結(jié)果正確即證明重組質(zhì)粒VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG構(gòu)建成功。

1.4 VHHGP5納米抗體誘導表達

將重組質(zhì)粒VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，隨后涂布于平板，倒置于37 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取50 μL過夜培養(yǎng)的菌液接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至OD600nm約為0.6時，加入5 μL IPTG（1 mol/L），在22 ℃160 r/min條件下誘導表達7 h，同時將未添加IPTG的菌液作為陰性對照；誘導表達完成后，10 000 r/min離心1 min收集菌體沉淀，使用500 μL PBS溶液重懸后進行超聲破碎，4 ℃10 000 r/min離心10 min，分離上清及沉淀；以SDS-PAGE凝膠電泳分析重組蛋白表達情況，將表達后的納米抗體重組蛋白命名為VHHGP5。

1.5 VHHGP5納米抗體純化

由于構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體含有6×His標簽，因此使用Ni-NTA親和層析柱對VHHGP5蛋白進行純化。對VHHGP5進行大量誘導表達：將5 mL重組菌液接種至500 mL LB液體培養(yǎng)基，誘導表達條件同1.4；誘導表達完成后，10 000 r/min離心10 min收集菌體沉淀，重懸后進行超聲破碎，對破碎后產(chǎn)物離心并收集上清；參照Ni-NTA親和層析柱產(chǎn)品說明書步驟，對上清中的VHHGP5蛋白進行純化，將獲得的純化蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，并按照BCA試劑盒說明書測定純化后的VHHGP5蛋白濃度。

1.6 VHHGP5納米抗體ELISA效價分析

以PRRSV GP5蛋白作為抗原（包被質(zhì)量濃度為10 μg/mL）包被96孔酶標板，4 ℃過夜；使用3%脫脂奶粉進行封閉，洗滌后依次加入6個梯度稀釋（1:100、1:1 000、1:10 000、1:50 000、1:100 000和1:200 000）的VHHGP5重組蛋白，同時以未誘導的VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG菌液超聲后的上清（稀釋50倍）作為陰性對照，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌后，以抗FLAG鼠源單抗作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗進行孵育；用TMB溶液顯色15 min后終止顯色，使用酶標儀讀取OD450nm值。

1.7 VHHGP5納米抗體Western blot分析

為驗證獲得的納米抗體VHHGP5與PRRSV GP5蛋白能否特異性結(jié)合，以Western blot試驗對表達的納米抗體重組蛋白進行鑒定。對GP5蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，置于封閉液中封閉1 h，加入不同稀釋度（1:100、1:1 000、1:2 000）的VHHGP5重組蛋白孵育，同時以本實驗室保存的VHHIBDV納米抗體重組蛋白作為陰性對照；以抗FLAG鼠源單抗作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗進行孵育，使用ECL化學發(fā)光顯色液避光顯色2 min并拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VHHGP5目的基因擴增

以前期篩選得到的PRRSV GP5蛋白特異性VHH基因的膠回收產(chǎn)物為模板，使用特異性引物進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果（圖1）顯示，擴增出大小約為400 bp的目的條帶，與預期條帶大小一致。

2.2 納米抗體重組表達載體構(gòu)建

菌液PCR鑒定結(jié)果（圖2）顯示，挑選的單克隆中，有3個菌液成功擴增出大小約400 bp的目的條帶。對陽性菌液提取質(zhì)粒并送測序，發(fā)現(xiàn)陽性菌液質(zhì)粒測序正確，表明重組表達載體VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG構(gòu)建成功。

2.3 VHHGP5納米抗體表達及純化

使用IPTG作為誘導劑對目的蛋白進行誘導表達，并通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白表達形式。結(jié)果（圖3）顯示，重組載體VHHGP5-pCold-SUMO-FLAG在誘導后表達出一條約36 kDa的蛋白條帶，且VHHGP5蛋白為可溶性表達，主要存在于超聲后菌體上清中，而沉淀及未誘導的菌液則條帶不明顯。隨后，按照誘導表達條件對VHHGP5納米抗體重組蛋白進行大量表達并通過Ni-NTA親和層析柱進行純化，獲得了純化蛋白（圖4），經(jīng)BCA方法測定，純化后的VHHGP5納米抗體重組蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

2.4 VHHGP5納米抗體活性測定

將純化后的VHHGP5納米抗體進行倍比稀釋，并與固相包被的GP5蛋白進行間接ELISA試驗，以試驗孔OD450nm大于陰性對照孔3倍以上作為陽性判定標準。結(jié)果（表1）顯示，純化后的VHHGP5納米抗體重組蛋白ELISA效價為1:50 000，效價較高。

表1 間接ELISA效價檢測結(jié)果

2.5 Western blot鑒定

VHHGP5納米抗體重組蛋白Western blot分析結(jié)果（圖5）顯示，該納米抗體能夠與PRRSV GP5蛋白發(fā)生特異性反應，表明所制備的納米抗體可特異性識別GP5蛋白，具有良好的反應性。

3 討論

PRRS發(fā)病率及死亡率高、傳播迅速，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大經(jīng)濟損失。GP5是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有多個中和位點，被認為是獲得中和抗體的理想蛋白。市面上已有通過包被GP5蛋白來檢測PRRSV的商品化試劑盒。傳統(tǒng)的單克隆抗體在診斷中發(fā)揮著重要作用，但它們的生產(chǎn)在技術(shù)上要求很高，而且昂貴。單克隆抗體的大尺寸（150 kDa）使其進行重組成為一個挑戰(zhàn)。納米抗體僅由兩條重鏈組成，天然缺失輕鏈，有相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強、易于制備以及更容易進行基因工程改造等特點[12]。目前納米抗體已被廣泛應用于疾病診斷和治療中[13-14]。Ma等[15]利用制備的特異性納米抗體構(gòu)建了檢測豬流行性腹瀉病毒的阻斷ELISA方法，檢測效果與商品化檢測試劑盒相當。由此可見，納米抗體作為新興分子生物學工具正應用于動物疫病防控中。

本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，成功制備了針對PRRSV GP5蛋白的特異性納米抗體。該納米抗體在大腸桿菌中呈可溶性表達，間接ELISA檢測顯示其結(jié)合效價可達1:50 000。此外，本試驗使用的原核表達系統(tǒng)大大降低了蛋白制備成本，純化蛋白的步驟也較為簡便，適合進行大批量生產(chǎn)。在后續(xù)研究中，VHHGP5納米抗體可用于構(gòu)建ELISA、膠體金等檢測方法以及探究PRRSV感染機制。綜上，本研究制備了針對PRRSV GP5蛋白的納米抗體，其可特異性識別GP5蛋白，為PRRS檢測用及治療用新型抗體開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。