韋唯，葉英，2*，蘭麗虹，王紅，王樹(shù)林

（1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

黃果梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）為白梨系統(tǒng)的地方梨品種，一般為鵝卵形狀，顏色呈金黃色，果皮薄而松軟，經(jīng)自然成熟采摘后-20 ℃冷凍，此過(guò)程對(duì)色澤影響較小，但目前關(guān)于果實(shí)其它品質(zhì)影響的研究鮮見(jiàn)。青海省同仁縣是黃果梨的主產(chǎn)地，主要分布在隆務(wù)鎮(zhèn)、保安鎮(zhèn)、年都乎鄉(xiāng)等沿隆務(wù)河的山水地區(qū)。目前，隆務(wù)河谷地帶黃果梨種植地有297 077 株[1]。由于特殊的地理環(huán)境極大地促進(jìn)了植物光合作用與干物質(zhì)積累，黃果梨營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，口感濃郁純正。黃果梨中含有水分、氨基酸、總糖、總酸、類(lèi)胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)成分且含量豐富，并含有多種礦物質(zhì)元素及各種微量元素[2]。此外，黃果梨果實(shí)具有獨(dú)特的保健功能，如清熱解毒、化痰利肺?？蓪⑵渥鳛樘烊痪G色保健品的優(yōu)質(zhì)原材料，因而極具開(kāi)發(fā)潛力[3]。

黃果梨酒是一種由果酒酵母發(fā)酵而成的功能性果酒。功能性果酒富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如有機(jī)酸及維生素等[4-5]，適量飲用有利于促進(jìn)血液循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)李子酒、刺梨酒中含多種生物活性成分且刺梨酒中含有豐富的超氧化物歧化酶[6-7]。陳珍等[8]研究表明刺梨果酒可有效預(yù)防高脂誘導(dǎo)小鼠肥胖。李少鵬等[9]研究表明枸杞果酒具有提高機(jī)體免疫機(jī)能、促進(jìn)機(jī)體健康等功效。青海地區(qū)黃果梨資源豐富，但對(duì)黃果梨果酒的研究鮮見(jiàn)。因此本文以黃果梨為發(fā)酵原料制作果酒，以期為黃果梨資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黃果梨：青海省同仁縣；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)）：山東中天生物科技有限公司；白砂糖：鄄城縣永泰糖業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ESJ110-48 電子天平：上海上平儀器有限公司；BPH9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-4S 電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；酒精計(jì)：東莞市科銳儀器科技有限公司；UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；H/T16MM 臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 黃果梨果酒制備工藝

1.3.1 工藝流程

原料處理→手動(dòng)破碎→去核→果膠酶酶解→添加偏重亞硫酸鉀→加糖→酵母活化→酒精發(fā)酵→過(guò)濾→澄清→滅菌裝瓶。

1.3.2 操作步驟

1）原料處理：黃果梨從-20 ℃冰箱中取出，15 ℃冷水快速?zèng)_洗解凍，剔除霉?fàn)€果實(shí)，手動(dòng)破碎去核，打漿。

2）果膠酶酶解：向上述果漿添加0.05%的果膠酶，45 ℃酶解3.5 h。

3）添加偏重亞硫酸鉀：將0.013%的偏重亞硫酸鉀添加至酶解后的黃果梨果漿中。

4）酵母活化：參考文獻(xiàn)[9]的方法，稱(chēng)取一定量酵母于錐形瓶中，添加酵母添加量10 倍糖度為6 的用新制蒸餾水配制的糖水。緩慢攪拌5 min，在35 ℃恒溫水浴活化20 min。

5）酒精發(fā)酵：在24～32 ℃條件下發(fā)酵5～9 d。

6）過(guò)濾、滅菌：發(fā)酵停止后，將發(fā)酵瓶中清酒與底部部分沉淀的酵母、果渣等用紗布分離、過(guò)濾處理。對(duì)發(fā)酵酒液進(jìn)行巴氏滅菌處理。

7）陳釀：將黃果梨酒液置于4 ℃條件下陳釀30 d，使酒味協(xié)調(diào)，風(fēng)味濃郁。

1.4 黃果梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)黃果梨果酒的影響

固定菌種接種量為0.05%、初始糖添加量為25%、65 ℃滅菌15 min 條件下。調(diào)整發(fā)酵溫度（24、26、28、30、32 ℃）發(fā)酵7 d，考察發(fā)酵溫度對(duì)黃果梨果酒的影響。

1.4.2 菌種接種量對(duì)黃果梨果酒的影響

固定發(fā)酵溫度為28 °C、初始糖添加量為25%、65 ℃滅菌15 min 條件下。調(diào)整菌種接種量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）發(fā)酵7 d，考察菌種接種量對(duì)黃果梨果酒的影響。

1.4.3 初始糖添加量對(duì)黃果梨果酒的影響

固定菌種接種量為0.05%，發(fā)酵溫度為28 ℃，在65 ℃滅菌15 min 條件下，調(diào)整初始糖添加量（15%、20%、25%、30%、35%）發(fā)酵7 d，考察初始糖添加量對(duì)黃果梨果酒的影響。

1.4.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃果梨果酒的影響

固定菌種接種量為0.05%，發(fā)酵溫度為28 ℃，初始糖添加量為25%，65 ℃滅菌15 min 條件下，調(diào)整發(fā)酵時(shí)間（5、6、7、8、9 d），考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃果梨果酒的影響。

1.5 黃果梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.6 黃果梨果酒感官評(píng)定及物質(zhì)成分變化檢測(cè)

1.6.1 感官評(píng)定

選15 名食品專(zhuān)業(yè)人員組成一個(gè)黃果梨果酒感官評(píng)定小組對(duì)黃果梨果酒進(jìn)行評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria

1.6.2 檢測(cè)方法

總糖含量參照韋璐等[10]的方法，采用蒽酮-硫酸法進(jìn)行測(cè)定；還原糖含量采用直接滴定法進(jìn)行測(cè)定；總酸含量參照楊芳等[11]的方法，采用酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定；多酚含量參考吳曉青等[12]的方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)品進(jìn)行測(cè)定；黃酮含量參考李德森等[13]的方法，以蘆丁為標(biāo)品進(jìn)行測(cè)定；VC含量參考劉榮森[14]的方法，以抗壞血酸為標(biāo)品進(jìn)行測(cè)定；酒精度利用果酒專(zhuān)用酒精計(jì)進(jìn)行測(cè)定；糖度利用手持糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert V8.0.6、Microsoft Office Excel 2007 和Origin 2018 軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵溫度對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖1 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度與感官評(píng)分均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。主要原因可能是當(dāng)發(fā)酵溫度低于28 ℃時(shí)，由于未達(dá)最佳發(fā)酵條件，導(dǎo)致酵母菌的生長(zhǎng)繁殖速率緩慢，黃果梨果酒含糖量過(guò)高，口味偏甜，口感較差。當(dāng)發(fā)酵溫度高于28 ℃時(shí)，酵母發(fā)酵迅速，代謝加快導(dǎo)致其容易衰老，使酒精度降低[15]，另黃果梨發(fā)酵不完全，果酒缺乏酒香味。綜上，選擇發(fā)酵溫度26～30 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 菌種接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果

菌種接種量對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖2。

圖2 菌種接種量對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of yeast addition on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖2 可知，酒精度與感官評(píng)分均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，主要原因可能是當(dāng)酵母菌接種量小于0.05%時(shí)，黃果梨果漿發(fā)酵不完全，導(dǎo)致酒精度較低且果酒具有酸味；當(dāng)菌種接種量大于0.05%時(shí)，黃果梨果漿發(fā)酵迅速，短時(shí)內(nèi)發(fā)酵體系中酒精含量急速增加，在此情況下因酒精含量超過(guò)酵母的耐受能力導(dǎo)致部分酵母發(fā)生衰老和死亡[16]。果酒也會(huì)因此而具有酵母味，使感官評(píng)分降低。綜上，選擇菌種接種量0.04%～0.06%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 初始糖添加量單因素試驗(yàn)結(jié)果

初始糖添加量對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖3。

圖3 初始糖添加量對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of initial sugar addition on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖3 可知，糖作為酒精發(fā)酵所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程有重要的影響。當(dāng)初始糖添加量為15%、20%時(shí)，果酒口感酸澀。并且酒精度與感官評(píng)分相對(duì)較低，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵體系中缺乏糖類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。初始糖添加量為25%時(shí)果酒的酒精度為12.7% vol，感官評(píng)分為88.85，果酒香味濃郁。當(dāng)初始糖添加量超過(guò)25%時(shí)，酒味刺鼻掩蓋了黃果梨的清香。綜上得知，選擇初始糖添加量20%～30%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃果梨果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖4 可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～6 d 時(shí)，發(fā)酵體系中總糖含量較低，致使酒精度與香氣成分積累不足，果酒在酒精度與感官評(píng)分方面略有不足；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)為8～9 d 時(shí)，酒精含量雖能達(dá)到最大程度積累但酵母菌生長(zhǎng)代謝受阻，此時(shí)會(huì)代謝產(chǎn)生各種不良產(chǎn)物且出現(xiàn)輕微的酸敗現(xiàn)象，進(jìn)而影響酒體口感，致使感官評(píng)分大大降低。因此選擇7 d 為黃果梨果酒最佳的發(fā)酵時(shí)間。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

黃果梨果酒發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Response surface test results and analysis

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis result of response surface test

黃果梨果酒釀造工藝參數(shù)的回歸方程為Y=89.90-1.50A-1.12B+1.88C+1.25AB+1.75AC-2.00BC-2.65A2-6.90B2-5.90C2。

由表4 可知，該模型適合黃果梨果酒釀造工藝試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。通過(guò)顯著性檢驗(yàn)可知，除了B、AB、AC 對(duì)感官評(píng)分顯著（P＜0.05），BC 不顯著，其余均為極顯著。對(duì)黃果梨果酒感官評(píng)分影響強(qiáng)弱的順序?yàn)槌跏继翘砑恿浚景l(fā)酵溫度＞菌種接種量。

2.6 交互作用分析

各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig.5 Response surfaces and contour lines of interaction between each two factors

由圖5 可知，AB、AC 等高線(xiàn)趨于橢圓，表明交互作用明顯[17]，對(duì)黃果梨果酒感官評(píng)分影響較大；而B(niǎo)C交互作用不明顯，對(duì)黃果梨果酒感官評(píng)分影響較小。

2.7 營(yíng)養(yǎng)及功能成分變化檢測(cè)結(jié)果

2.7.1 發(fā)酵過(guò)程中總糖含量變化

總糖含量在黃果梨果酒的口感風(fēng)味、色澤和穩(wěn)定性方面有著重要作用[18]。黃果梨果酒中總糖含量的變化如圖6 所示。

圖6 黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中總糖含量變化Fig.6 Changes of total sugar content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖6 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，1～5 d 總糖含量急速下降，主要原因是初期發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)豐富，酵母活力旺盛，在此條件下快速消耗總糖用于酵母自身生長(zhǎng)繁殖以及代謝產(chǎn)生酒精；而從第7 天開(kāi)始總糖降低速率減緩，主要是由于酒精度升高，酵母老化、發(fā)酵環(huán)境發(fā)生改變。發(fā)酵7 d 時(shí)黃果梨果酒總糖含量為28 g/L，屬半甜型果酒。結(jié)合單因素及響應(yīng)面結(jié)果可知總糖含量對(duì)黃果梨果酒的酒精度與感官評(píng)分有著重要的影響。

2.7.2 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量變化

黃果梨果酒中還原糖含量的變化如圖7 所示。

圖7 黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量變化Fig.7 Changes of reducing sugar content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖7 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。0～1 d 內(nèi)上升的原因主要是白砂糖在酵母中相應(yīng)酶的作用下分解產(chǎn)生還原糖；3～5 d 內(nèi)急速下降，主要原因是酵母活力旺盛，整個(gè)發(fā)酵體系處于主發(fā)酵期；5～9 d 內(nèi)下降趨勢(shì)減緩，主要原因可能是發(fā)酵體系中缺乏發(fā)酵底物，且因發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，酵母代謝受抑制，分解糖分能力大大下降。

2.7.3 發(fā)酵過(guò)程中酒精度、糖度變化

黃果梨果酒中酒精度、糖度的變化如圖8 所示。

圖8 黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中酒精度、糖度變化Fig.8 Changes of alcohol content and sugar during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖8 可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酒精度與糖度整體表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。黃果梨原料糖度為12 °Bx，通過(guò)添加白砂糖使發(fā)酵液初始糖度為30 °Bx。發(fā)酵0～1 d 時(shí)因酵母需要適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，所以酒精度基本不變。發(fā)酵第1～3 天時(shí)，發(fā)酵液中的糖類(lèi)被酵母用于自身生長(zhǎng)繁殖及無(wú)氧發(fā)酵，酒精度快速增加，糖度持續(xù)降低。3～7 d 發(fā)酵過(guò)程中酒精度平穩(wěn)上升，此過(guò)程也是各種活性成分積累的最佳時(shí)間；從第7 天開(kāi)始酒精度逐漸趨于平緩并達(dá)到最大值13.8% vol，糖度則為21.23 °Bx，這主要與酵母的生長(zhǎng)代謝受阻有關(guān)。發(fā)酵體系中糖類(lèi)被消耗，無(wú)法提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且此時(shí)發(fā)酵液的pH 值以及發(fā)酵液中過(guò)高的酒精度都會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)帶來(lái)不利影響，導(dǎo)致后期酒精度增加緩慢甚至趨于降低。

2.7.4 發(fā)酵過(guò)程中VC含量變化

黃果梨果酒中VC含量的變化如圖9 所示。

圖9 黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中VC 含量變化Fig.9 Changes of VC content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖9 可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，VC含量總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。主要原因可能是由于酵母細(xì)胞在發(fā)酵初期進(jìn)行有氧呼吸，生長(zhǎng)繁殖而產(chǎn)熱，致使整個(gè)發(fā)酵體系溫度較高，導(dǎo)致VC分解[19]。在第7 天時(shí)上升至8.436 g/L，VC含量基本達(dá)到最大值。

2.7.5 發(fā)酵過(guò)程中黃酮、多酚含量變化

黃果梨果酒中黃酮、多酚含量的變化如圖10 所示。

圖10 黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中黃酮、多酚含量變化Fig.10 Changes of flavone and polyphenol contents during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖10 可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，黃酮、多酚含量變化趨勢(shì)基本一致，均先上升后下降。主要原因是發(fā)酵前期，隨著黃果梨果酒中酒精含量的不斷積累，導(dǎo)致黃酮和多酚的浸提量不斷增加，在5 d 時(shí)均達(dá)到最大值，分別為0.943 5、6.669 mg/L；發(fā)酵后期，黃酮、多酚含量明顯降低，分析原因可能是多酚類(lèi)物質(zhì)因貯藏溫度、含氧量及果實(shí)成分等外界因素的改變而分解[20]。但相比最初值含量都明顯增加，說(shuō)明發(fā)酵有利于黃酮、多酚等活性成分的保留。

2.7.6 發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化

總酸含量與黃果梨果酒的感官品質(zhì)密切相關(guān)[21]。黃果梨果酒中總酸含量的變化如圖11 所示。

圖11 黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化Fig.11 Changes of total acid content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由圖11 可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，總酸含量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)。主要原因是黃果梨本身酸性成分含量較高，且在發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞自身代謝產(chǎn)酸，以及因外界高糖環(huán)境激發(fā)的細(xì)胞代謝產(chǎn)酸的應(yīng)激效應(yīng)所產(chǎn)生的酸[22]。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)密切關(guān)注其含量變化以更好控制黃果梨果酒的感官品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化黃果梨果酒的制備工藝，并通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中總糖、還原糖、酒精度、糖度、VC、黃酮、多酚、總酸含量等，對(duì)黃果梨果酒品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。得到最佳發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵溫度28 ℃、初始糖添加量25%、菌種接種量0.05%、發(fā)酵時(shí)間7 d。此條件下制得的黃果梨果酒感官評(píng)分達(dá)92，酒精度達(dá)13% vol。酒體澄清，有光澤。黃果梨果酒發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)及酒精度的增大，半甜型黃果梨果酒總糖、還原糖、糖度等最終含量均降低。黃酮、多酚含量呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的變化趨勢(shì)，總酸含量整體上升。VC含量相比發(fā)酵第1 天增加4.345 g/L。綜上可知，活性物質(zhì)成分的積累與酒精含量變化有著密不可分的關(guān)聯(lián)?？梢酝ㄟ^(guò)嚴(yán)格把控發(fā)酵條件，密切關(guān)注酒精含量變化，達(dá)到各種營(yíng)養(yǎng)及功能物質(zhì)富集的目的。本試驗(yàn)為黃果梨果酒的釀造工藝提供科學(xué)依據(jù)。