張 寧 康 燕 任文義 程雨辰 徐曉鋒 張力莉

(寧夏大學(xué)動物科技學(xué)院,銀川 750021)

琥珀酸,又名丁二酸,是所有需氧生物中三羧酸循環(huán)的代謝中間體。作為肌肉組織的基本構(gòu)成單位,肌纖維的組成和類型對畜禽的生長以及肉品質(zhì)起著重要作用[1-2]。琥珀酸可通過細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體91(G-protein-coupled receptor 91,GPR91)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度升高[3]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+在肌肉的生長發(fā)育、類型轉(zhuǎn)化上起著重要作用,是骨骼肌中活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)和促進(jìn)肌管分化和蛋白質(zhì)合成的重要第二信使[4-5]。Ca2+信號變化對肌肉前體細(xì)胞成肌成脂分化過程具有重要調(diào)控作用[6]。在小鼠上研究發(fā)現(xiàn),琥珀酸對調(diào)控鼠骨骼肌肌纖維類型具有重要調(diào)節(jié)作用,可改變肌肉的嫩度[7]。Wang等[8]研究表明,在肌纖維類型轉(zhuǎn)化過程中,琥珀酸經(jīng)過細(xì)胞膜受體GPR91誘導(dǎo)激活磷脂酶-Cβ(phospholipase-Cβ,PLC-β),進(jìn)而產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)和二酰基甘油(diacylglycerol,DG)2個第二信使,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加,進(jìn)而激活Ca2+/T細(xì)胞激活核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)通路,調(diào)控肌球蛋白重鏈(myosin heavy chains,MyHCs)的基因表達(dá),從而影響肌纖維類型。本試驗在飼糧中添加不同水平的琥珀酸后飼喂灘羊,對灘羊背最長肌進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)特征分析及PCR定量分析,為進(jìn)一步深入研究琥珀酸對灘羊肉品質(zhì)及肌纖維類型的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選擇年齡(5月齡)和體重[(33.00±0.69) kg]相近的健康灘羊公羔36只,隨機分為4組,每組9只。在干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ)上,4組灘羊飼糧中琥珀酸添加水平分別為0(對照組)、0.5%(試驗Ⅰ組)、1.0%(試驗Ⅱ組)、2.0%(試驗Ⅲ組)。飼喂期為70 d,其中預(yù)試期10 d,正試期60 d。試驗飼糧參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)和生產(chǎn)實踐配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗飼糧干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、鈣、磷含量分別參照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 20806—2006、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018測定,代謝能計算方法為原料代謝能乘以該原料在飼糧中所占比例,然后相加,其中原料代謝能參考《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2022年第33版)》。試驗羊單欄飼養(yǎng),每天飼喂全混合日糧2次(07:00和17:00),自由飲水。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣本采集

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,禁食24 h,禁水2 h,每組選出5只體重接近平均體重的灘羊屠宰,取背最長肌于-20 ℃保存待測。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 肉品質(zhì)指標(biāo)測定

肉品質(zhì)指標(biāo)測定方法參考李斐[9]。

肉色及脂肪色:用肉色測量儀器進(jìn)行測量,記錄數(shù)值。

pH45 min:將pH計插入宰后45 min的背最長肌肉樣橫切面的中心部位,待讀數(shù)穩(wěn)定5 s后讀數(shù),記錄數(shù)據(jù),每個部位測3次,求平均值。

剪切力:取背最長肌肉樣置于80 ℃的恒溫水浴鍋中,水浴加熱至肉的中心溫度達(dá)到75 ℃,取出冷卻至室溫,按與肌纖維呈垂直方向切取寬度為1.5 cm的肉片。用1.27 cm直徑的圓形取樣器順肌纖維方向鉆切肉樣塊,記錄嫩度儀顯示的剪切力,同源樣本的重復(fù)度量次數(shù)為6次,取平均值。

滴水損失:取背最長肌倒數(shù)第3～4肋間處眼肌,修整為長×寬×高=5.0 cm×3.0 cm×2.5 cm的肉塊。將休整好的肉樣稱重(m1),一端用細(xì)鐵絲鉤住,放置于充氣的聚乙烯薄膜食品袋中,懸吊于冰箱0～4 ℃冷藏層,放置24 h后取出肉樣,拭去表層的汁液,稱重(m2),按照如下公式計算滴水損失。

滴水損失(%)=[(m1-m2)/m1]×100。

失水率:取厚度為5 cm的背最長肌肉樣一段(7～8 cm),采用雙片刀垂直于肌纖維方向切取1.0 cm厚的肉片,平置在潔凈的橡皮片上,用直徑為2.523 cm的鋒利圓形取樣器切取一塊中心部分樣品,立即將上述取得的樣品用感量為0.01 g的天平稱重(m1),稱重后將該樣品置于上下各墊18層定性中速濾紙的2層紗布間,放置在35 kg的壓力下加壓5 min后稱重(m2)按照如下公式計算失水率。

失水率(%)=[(m1-m2)/m1]×100。

蒸煮損失:取適量背最長肌肉樣稱重(m1),于80 ℃水浴中蒸煮45 min,將肉樣冷卻30 min再稱重(m2),按照如下公式計算蒸煮損失。

蒸煮損失(%)=[(m1-m2)/m1]×100。

肌內(nèi)脂肪含量:參照GB 5009.6—2016中酸水解法結(jié)合索氏提取法進(jìn)行測定。

1.3.2 肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性測定

肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性測定參考羅玉龍等[10]的方法。灘羊宰后45 min內(nèi),立即取左側(cè)胴體正數(shù)第12～13肋骨間背最長肌組織1份,沿肌纖維方向切成約0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉塊,放入提前經(jīng)液氮預(yù)冷的異戊烷中脫水30 s,然后放入液氮速凍,后放于-80 ℃冰箱中冷凍。將處理好的肌纖維樣品用冰凍切片機切片后采用ATP酶染色,使用Olympus BX51顯微鏡和Image Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件,在20×10倍下對肌纖維特性進(jìn)行觀察,分析肌纖維特性指標(biāo),包括肌纖維直徑、面積、密度和數(shù)量。

1.3.3 肌纖維中MyHCs基因表達(dá)的檢測

使用RNAiso Plus試劑(TaKaRa)按照說明書提取背最長肌總RNA,然后對提取的RNA用核酸定量儀進(jìn)行定量和定性測定,并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。將總RNA通過Hifair?Ⅱ 1st Strand試劑盒(Yeasen Biotech)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,采用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(Yeasen Biotech)進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增。實時熒光定量PCR所用引物由西安擎科生物公司設(shè)計并合成,引物序列見表2。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表2 實時定量PCR所用引物

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016記錄并作簡單處理后,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析,采用單因素方差分析結(jié)合LSD法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加琥珀酸對灘羊肉品質(zhì)的影響

由表3可知,4組的pH45 min、失水率、滴水損失、剪切力、肌內(nèi)脂肪含量及肉色差異均不顯著(P>0.05);試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組的蒸煮損失顯著低于對照組(P<0.05);試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的脂肪亮度(L*)值顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2 灘羊背最長肌ATP酶染色結(jié)果

通過ATP酶染色法對各組灘羊背最長肌進(jìn)行染色,染色結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過ATP酶染色后,肌纖維被分成3種類型,其中顏色最深的是Ⅰ型肌纖維,顏色深度處于中間的是Ⅱa型肌纖維,顏色最淺的是Ⅱb型肌纖維。

2.3 飼糧添加琥珀酸對灘羊肌纖維特性的影響

由表4可知,3個試驗組Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維直徑均極顯著低于對照組(P<0.01),但3個試驗組之間差異不顯著(P>0.05)。3個試驗組Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維橫截面積極顯著低于對照組(P<0.01),Ⅱb型肌纖維橫截面積與對照組差異不顯著(P>0.05)。3個試驗組Ⅰ型肌纖維密度顯著高于對照組(P<0.05),其他2種類型肌纖維密度與對照組差異不顯著(P>0.05)。3個試驗組Ⅱa型肌纖維比例極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.4 飼糧添加琥珀酸對灘羊肌纖維中MyHCs基因表達(dá)的影響

由圖2可知,3個試驗組MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx這4種基因的mRNA相對表達(dá)量均較對照組極顯著降低(P<0.01)。隨著琥珀酸添加量的上升,MyHCⅠ和MyHCⅡx的mRNA相對表達(dá)量先降低后升高,而MyHCⅡa和MyHCⅡb的mRNA相對表達(dá)量逐漸升高。

3 討 論

肌肉纖維的類型和肉品質(zhì)相關(guān),肌纖維類型組成不同,宰后肌肉顏色、pH、系水力等肌肉品質(zhì)性狀也不同[9]。骨骼肌組織中I型肌纖維比例的增加會降低肉的顏色穩(wěn)定性[10]。研究表明,Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例較高的豬肉,L*值增加,持水能力降低[11-12]。本試驗結(jié)果表明,3個試驗組Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例降低,表型測定結(jié)果也顯示試驗組肌肉和脂肪L*值有所下降,失水率降低導(dǎo)致其持水能力增加,說明添加琥珀酸后可通過降低Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例來增加羊肉的持水能力。肌纖維的直徑和橫截面積越大,肌肉剪切力越大,即嫩度越差[13]。本研究結(jié)果顯示,3個試驗組Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維直徑以及Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維橫截面積均較對照組極顯著降低,剪切力也有所下降,琥珀酸說明對羊肉品質(zhì)有所改善。史卓言等[14]指出,豫西黑豬肌纖維橫截面積和直徑均極顯著高于杜洛克豬,而肌纖維密度極顯著低于杜洛克豬,這可能是這2個品種豬肉質(zhì)口感存在差異的原因之一。本研究中,飼糧中添加琥珀酸后灘羊肌肉的肌纖維類型發(fā)生改變,肌纖維橫截面積和直徑均下降,肌纖維密度升高,說明肌纖維類型的改變是造成灘羊肉品質(zhì)改善的原因之一,但具體原因還需進(jìn)一步從分子水平研究其相關(guān)機制。

在成年哺乳動物的骨骼肌上表達(dá)有4種類型的MyHCs,分別為MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx[15-16],它們分別對應(yīng)4種不同類型的肌纖維,即Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纖維,在代謝上分別與慢速氧化型、快速氧化型、快速酵解型和中間型肌纖維相對應(yīng)[17-18]。Ⅰ型肌纖維具有慢收縮、氧化代謝特征,糖原含量低;Ⅱa型肌纖維是一種快速氧化糖酵解纖維,表現(xiàn)出介于Ⅰ型肌纖維和Ⅱx型肌纖維之間的中等收縮和代謝特性;Ⅱb型肌纖維具有快速抽動、糖酵解代謝特征、高糖原含量;而Ⅱx型纖維與Ⅱb型纖維接近,只是收縮速度較低、氧化代謝略高[19]。運動對肌肉纖維類型的轉(zhuǎn)變有深遠(yuǎn)的影響,耐力訓(xùn)練可以使骨骼肌肌纖維類型發(fā)生轉(zhuǎn)化。研究表明,中等強度和高強度的運動可能導(dǎo)致骨骼肌纖維類型由快向慢的轉(zhuǎn)變[20],即骨骼肌從Ⅱ型轉(zhuǎn)化為Ⅰ型。另有研究報道,運動的增加可以使豬的骨骼肌肌纖維類型發(fā)生轉(zhuǎn)化,主要表現(xiàn)為Ⅱb型→Ⅱa型→Ⅱx型→Ⅰ型轉(zhuǎn)化,即從酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化[21]。本研究中,飼糧中添加琥珀酸后,肌纖維中MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅠ和MyHCⅡx的mRNA相對表達(dá)量均較對照組極顯著降低,且試驗組肌纖維中MyHCⅡa和MyHCⅡb的mRNA相對表達(dá)量較低,MyHCⅠ和MyHCⅡx的mRNA相對表達(dá)量較高,說明肌纖維類型從酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化。另外,飼糧能量水平對肌纖維轉(zhuǎn)化也有影響。

圖A、B、C、D分別代表對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組ATP酶染色后鏡檢圖片。圖中藍(lán)色箭頭代表Ⅰ型肌纖維,紅色箭頭代表Ⅱa型肌纖維,黑色箭頭代表Ⅱb型肌纖維。

表4 飼糧添加琥珀酸對灘羊肌纖維特性的影響

續(xù)表4項目 Items對照組Control group試驗Ⅰ組Trial group Ⅰ試驗Ⅱ組Trial group Ⅱ試驗Ⅲ組Trial group ⅢP值 P-value肌纖維橫截面積 Muscle fiber cross-sectional area/μm2Ⅰ型肌纖維 Type Ⅰ muscle fiber176.33±8.02Aa147.00±9.53Bb146.00±9.53Bb144.33±9.50Bb0.008Ⅱa型肌纖維 Type Ⅱa muscle fiber256.00±11.78Aa207.00±18.00Bb197.33±20.55Bb202.33±15.01Bb0.009Ⅱb型肌纖維 Type Ⅱb muscle fiber329.00±14.73305.66±19.55297.66±15.88316.66±10.500.153肌纖維密度 Muscle fiber density/(根/mm2)Ⅰ型肌纖維 Type Ⅰ muscle fiber193.00±14.52b235.66±10.06a228.66±13.20a227.33±10.50a0.011Ⅱa型肌纖維 Type Ⅱa muscle fiber151.66±14.50184.00±15.71184.66±15.94186.00±11.130.053Ⅱb型肌纖維 Type Ⅱb muscle fiber91.66±10.2693.33±8.6295.33±8.5092.66±7.090.961肌纖維比例 Muscle fiber ratio/%Ⅰ型肌纖維 Type Ⅰ muscle fiber21.00±3.6016.33±2.5120.00±3.6013.00±3.000.056Ⅱa型肌纖維 Type Ⅱa muscle fiber28.00±3.60Aa14.66±3.05Bb19.00±2.64Bb18.00±3.00Bb0.004Ⅱb型肌纖維 Type Ⅱb muscle fiber18.00±1.0016.66±2.5114.00±2.0016.00±6.640.222

C代表對照組,T1、T2、T3分別代表試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“**”表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。

李秋艷等[22]發(fā)現(xiàn),飼糧能量水平可調(diào)控烏金豬肌纖維類型基因的表達(dá),并能引起肌纖維類型的轉(zhuǎn)化,其中飼糧高能量水平下背最長肌MyHCⅠ的mRNA相對表達(dá)量最高。De Vadder等[23]在小鼠上的研究指出,琥珀酸可以通過糖異生顯著改善葡萄糖和能量代謝,并且能增加機體能量消耗。因此,本試驗推測可能是琥珀酸增加了能量消耗導(dǎo)致MyHCs基因的表達(dá)下調(diào)及肌纖維類型的轉(zhuǎn)化,但具體機制還需進(jìn)一步研究。

關(guān)于琥珀酸對不同類型肌肉纖維轉(zhuǎn)化的機制應(yīng)進(jìn)一步從分子水平進(jìn)行分析,后期將從肌纖維調(diào)控相關(guān)代謝通路及通路中相關(guān)基因表達(dá)方面繼續(xù)研究,為灘羊肉質(zhì)改善提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

琥珀酸可通過降低Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例來增加持水能力,通過降低肌纖維直徑和橫截面積使剪切力下降,從而改善肉品質(zhì);琥珀酸可極顯著降低肌纖維中MyHCs基因的表達(dá)并且調(diào)節(jié)肌纖維類型的轉(zhuǎn)化。綜合肉質(zhì)表型測定結(jié)果、肌纖維組織學(xué)特性及肌纖維中MyHCs基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)灘羊飼糧中琥珀酸添加量為1.0%(干物質(zhì)基礎(chǔ))時效果較好。