王心淼 王玉玨 鄭麗瑩 張敬軒 陳 曄

白內障是致盲的主要原因[1]。高血糖水平的持續(xù)存在具有生理毒性,在白內障的發(fā)展過程中最為明顯。研究表明,糖尿病患者白內障的發(fā)病率遠高于非糖尿病患者[2]。白內障是由晶狀體內的氧化應激引起,長時間的氧化應激可引起上皮細胞間質轉化(EMT),導致白內障的發(fā)生[3]。晶狀體上皮細胞(LEC)參與了晶狀體纖維的分化過程,其中EMT是關鍵環(huán)節(jié),進一步研究LEC的EMT與氧化應激的關系,是開發(fā)糖尿病性白內障治療策略的必要條件[4]。微小RNA(miRNA)是長度為18～23個核苷酸的單鏈RNA分子。研究發(fā)現,miRNA在晶狀體、視網膜和其他眼組織中表達[5]。miR-34a參與LEC的EMT,并在大鼠晶狀體中表達。同時,白內障患者晶狀體中miR-34a-5p明顯上調,提示miR-34a-5p可能對白內障發(fā)生有影響[6]。因此,本研究探討miR-34a-5p在LEC的EMT中的作用和機制,為研究糖尿病性白內障靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LEC(上海生命科學研究院細胞庫);胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1)和DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為33.3 mmol·L-1)(美國Invitrogen公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(深圳市東創(chuàng)實驗科技有限公司);miRNA陰性對照(miR-NC)、miR-34a-5p抑制物和LipofectamineTM2000轉染試劑盒(美國Promega公司);四噻唑藍(MTT)(美國Amresco公司);丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所);Trizol、mRNA反轉錄試劑盒和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司);RIPA 裂解液(武漢博士德生物工程有限公司);β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、上皮型E鈣黏蛋白(E-cadherin)、鼠雙微體4(MDM4)、轉化生長因子-β2(TGF-β2)和β-actin抗體(美國Santa Cruz公司);二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Revco公司);HBS-1096B 酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司);PCR擴增儀和BD垂直電泳儀(美國Life Technologies公司)。

1.2 miR-34a-5p與MDM4結合位點預測

進入Targetscan數據庫(https://www.targetscan.org/vert_80/),在“Select a species ”選擇“Human”物種信息,在“Enter a microRNA name”位置輸入miR-34a-5p,在“Enter a human gene symbol”位置輸入MDM4,探索miR-34a-5p與MDM4是否存在潛在的結合位點。

1.3 LEC的轉染及雙熒光素酶檢測

按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書方法,將MDM4野生型/突變型(WT/MUT)與miR-NC和miR-34a-5p抑制物轉染到對數生長期的LEC中,轉染48 h后,用雙熒光素酶檢測試劑分析MDM4野生型/突變型(WT/MUT)熒光素酶活性。

1.4 細胞分組

在37 ℃、體積分數5% CO2環(huán)境下用含體積分數10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC,待細胞達到80%后進行實驗。實驗分組:(1)對照組(DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC);(2)高糖組(DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC);(3)miR-NC組(轉染miR-NC后用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC);(4)miR-34a-5p抑制物組(轉染miR-34a-5p抑制物后用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)LEC)。每組設置3個復孔,24 h后進行相關實驗。

1.5 MTT法檢測LEC細胞增殖

按1.4分組處理LEC,以每孔5×103個接種于96孔板中(每孔200 μL),20 h后加入MTT(每孔50 μL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入二甲基亞砜(每孔200 μL),用酶標儀在540 nm處測定吸光度(OD),計算細胞增殖率,細胞增殖率=(OD實驗組-OD空白孔)/(OD對照組-OD空白孔)×100%。

1.6 細胞劃痕實驗檢測LEC細胞遷移

以每孔5×104個LEC接種于6孔板中(每孔2 mL),待細胞貼壁后,用100 μL滅菌槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕,用無血清DMEM低糖培養(yǎng)基清洗,按1.4分組處理LEC 24 h后,用ImageJ軟件測量劃痕寬度,計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測LEC中MDA和SOD水平

按1.4分組處理LEC,以1×106個·mL-1接種于6孔板中(每孔3 mL),24 h后收集細胞,離心棄上清,加入1 mL磷酸鹽緩沖液,用細胞超聲破碎儀處理30 s,離心取上清,按試劑盒說明書檢測各組LEC中MDA和SOD水平。

1.8 RT-PCR檢測LEC中miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA表達

按1.4分組處理LEC,以1×106個·mL-1接種于6孔板中(每孔3 mL),24 h后收集細胞,離心棄上清,加入Trizol試劑,從LEC中提取總RNA,再將總RNA反轉錄為cDNA,用RT-PCR試劑盒進行擴增,40個循環(huán),采集熒光(61 ℃),PCR反應成分:一步法反轉錄PCR緩沖液5 μL,前置引子(10 μmol·L-1)和反置引子(10 μmol·L-1)各0.4 μL、超級酵素混合物0.2 μL、RNA模板0.6 μL、雙蒸水3.4 μL),各目標mRNA的引物序列見表1,采用 2-△△Ct法計算miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA的相對表達量(以β-actin為內參)。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白表達

按1.4分組處理LEC,以1×106個·mL-1接種于6孔板中(每孔3 mL),24 h后收集細胞,離心棄上清,用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解20 min,離心棄上清,進行電泳(每孔20 μg),將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上,將膜與MDM4(1：200)、TGF-β2(1：300)、β-catenin(1：300)、E-cadherin(1：400)和β-actin(1：1 000)抗體進行孵育,4 ℃過夜,將二抗(1：10 000)在室溫下孵育30 min。進行顯色,采集圖像進行分析(以β-actin 為內參)。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-34a-5p對MDM4的靶向調節(jié)作用

檢索Targetscan數據庫發(fā)現,miR-34a-5p對MDM4有潛在的結合位點(圖1)。與對照組和miR-NC組(1.00±0.29、1.04±0.07)相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中MDM4-MUT熒光素酶活性(0.64±0.10)均明顯降低(均為P<0.05),對照組和miR-NC組LEC中MDM4-MUT熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);對照組、miR-NC組及miR-34a-5p抑制物組LEC中MDM4-WT熒光素酶活性分別為1.00±0.15、0.97±0.12、1.05±0.10,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明miR-34a-5p與MDM4存在靶向調節(jié)作用。

圖1 miR-34a-5p與MDM4 mRNA的互補配對系列

2.2 miR-34a-5p對LEC細胞增殖和遷移的影響

四組LEC細胞增殖率及劃痕愈合率比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=31.053、20.679,均為P<0.001)。與對照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC細胞增殖率和劃痕愈合率均增加(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC細胞增殖率和劃痕愈合率均降低(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組LEC細胞增殖率和劃痕愈合率差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表2)。

表2 各組LEC細胞增殖率和遷移率

2.3 miR-34a-5p對LEC中MDA和SOD的影響 四組LEC中MDA及SOD比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=38.216、30.318,均為P<0.001)。與對照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC中MDA均增加,SOD均降低(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中MDA均降低,SOD均增加(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組LEC中MDA、SOD差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表3)。

表3 各組LEC中MDA和SOD水平

2.4 miR-34a-5p對LEC中miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA的影響

四組LEC中miR-34a-5p、MDM4及TGF-β2 mRNA比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=19.196、14.062、28.533,均為P<0.001)。與對照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC中miR-34a-5p和TGF-β2 mRNA均增加,MDM4 mRNA均降低(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中miR-34a-5p和TGF-β2 mRNA均降低,MDM4 mRNA均增加(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組LEC中miR-34a-5p、NDM4、TGF-β2 mRNA差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表4)。

表4 各組LEC中miR-34a-5p、MDM4和TGF-β2 mRNA表達

2.5 miR-34a-5p對LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白的影響

表5 各組LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白表達

四組LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=42.435、12.034、15.362、30.411,均為P<0.001)。與對照組相比,高糖組、miR-NC組和miR-34a-5p抑制物組LEC中TGF-β2和β-catenin蛋白均增加,MDM4和E-cadherin蛋白均降低(均為P<0.05);與高糖組和miR-NC組相比,miR-34a-5p抑制物組LEC中TGF-β2和β-catenin蛋白均降低,MDM4和E-cadherin蛋白均增加(均為P<0.05);高糖組與miR-NC組MDM4、TGF-β2、β-catenin、E-cadherin蛋白差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(表5、圖2)。

A:對照組;B:高糖組;C:miR-NC組;D:miR-34a-5p抑制物組。圖2 miR-34a-5p對LEC中MDM4、TGF-β2、β-catenin和E-cadherin蛋白的影響

3 討論

目前,白內障唯一有效的治療方法是手術干預,而白內障術后2～5年內,很多患者出現了晶狀體后囊膜混濁(PCO),導致20%～40%的患者視力下降[7]。PCO主要是白內障術后殘余LEC發(fā)生了EMT、增殖和遷移等多種細胞病理過程[8]。EMT是PCO發(fā)展的主要原因,在EMT過程中,LEC分化為成纖維細胞,失去細胞極性和上皮細胞特性,獲得間充質性質,如運動性、侵襲性和抗凋亡能力[9]。因此,抑制EMT可以防止PCO的發(fā)展,而調控PCO發(fā)展的潛在分子機制尚不清楚。

表達異常的miRNA已在眼病中被發(fā)現,包括伴有糖尿病的年齡相關性白內障(ARC),并且miRNA參與多種眼病的發(fā)病機制已被認識,這意味著miRNA是ARC中重要的靶向治療的生物標志物[10]。miR-34a-5p在白內障的LEC中表達上調,miR-34a-5p在TGF-β2誘導的原發(fā)性白內障的LEC中表達水平上調[11]。TGF-β2被認為是PCO中EMT相關變化的關鍵觸發(fā)因素。TGF-β2通過Smads通路、蛋白激酶B(Akt)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路等途徑在LEC中激活和促進EMT過程中起著至關重要的作用[12-13]。此外,TGF-β2是房水中TGF-β家族的主要亞型[14]。因此,TGF-β2誘導的LEC可用于模擬PCO中EMT微環(huán)境。本研究結果顯示,高糖誘導后,LEC中miR-34a-5p和TGF-β2水平升高,證實了上述的研究結果,也證實了高糖誘導的LEC的EMT模型成功。在胰腺癌細胞和組織中發(fā)現miR-34a-5p升高,在胰腺癌細胞系中miR-34a-5p的下調通過抑制間充質標志物和上調上皮標志物來抑制EMT[15]。同時,miR-34a-5p表達升高促進肺癌的轉移和EMT[16]。本研究結果顯示,通過轉染miR-34a-5p抑制劑,β-catenin表達降低,E-cadherin表達升高,證明LEC的EMT受到抑制,細胞增殖和遷移實驗也證實上述結論。

miRNA通過調控下游靶基因的表達來發(fā)揮其功能。通過生物信息學預測和進一步的熒光素酶報告顯示,miR-34a-5p與MDM4之間存在結合位點,且直接靶向MDM4。MDM4是EMT的生物標志物,MDM4表達不足已被認為是EMT的一個顯著特征[17]。同時,miR-34a-5p在調節(jié)胃癌進展過程中通過MDM4調控EMT發(fā)揮重要作用。有研究顯示,MDM4在TGF-β2誘導PCO附著的LEC中表達降低[18],這與本研究結果一致。因此,本研究推測miR-34a-5p/MDM4參與了LEC的EMT過程。MDM4也是一種轉錄因子,可以調節(jié)包括γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亞基血紅素氧合酶1(HO-1)在內的抗氧化酶的表達,以防止脂質介導的損傷和氧化應激[19]。敲低MDM4導致轉染miR-34a-5p抑制劑的人單核/巨噬細胞1(THP-1)脂質積累和氧化應激損傷上調,這表明MDM4部分抵消了miR-34a-5p對THP-1來源的巨噬細胞脂質積累、氧化應激損傷和凋亡的抑制作用,發(fā)揮抗氧化應激作用[20]。本研究結果也證實,通過轉染miR-34a-5p抑制劑,高糖誘導的LEC中MDA降低,SOD升高,也進一步為氧化應激和EMT的調控搭建了一個橋梁。

4 結論

miR-34a-5p在糖尿病性白內障LEC細胞模型中表達上調,下調miR-34a-5p可以靶向促進MDM4的表達,抑制高糖誘導的LEC的EMT進程,提示miR-34a-5p/MDM4可能成為糖尿病性白內障治療的一個新的靶點。然而,這些發(fā)現是基于體外有限數量的細胞,應使用動物模型來進一步證實這些結論。即便如此,這項研究也為糖尿病性白內障提供了一種有前景的基于miRNA的治療策略。