顧華香 程 驗(yàn) 李鵬飛 張國(guó)偉 季 敏 管懷進(jìn)

2017年,亞洲干眼協(xié)會(huì)在其新共識(shí)中明確指出干眼(DE)是一種多因素引起的以淚膜不穩(wěn)定為核心特征的慢性疾病。淚膜由內(nèi)側(cè)的黏液層、中間的水液層和外側(cè)的脂質(zhì)層組成,炎癥、淚液滲透壓升高、瞼板腺功能障礙、屈光手術(shù)、結(jié)膜松弛等均會(huì)導(dǎo)致淚膜的不穩(wěn)定[1]?；贒E的新定義,該共識(shí)提出了淚膜導(dǎo)向型治療的新概念,并強(qiáng)調(diào)了以淚膜作為治療目標(biāo)和穩(wěn)定淚膜在DE治療中的重要作用[2]。干細(xì)胞是具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,在一定條件下可以定向分化成機(jī)體內(nèi)的功能細(xì)胞,具有很強(qiáng)的可塑性,目前發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞主要有造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、組織特異性祖細(xì)胞等[3]。來(lái)自眼部的干細(xì)胞以及其他來(lái)源如骨髓、脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞因其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能、營(yíng)養(yǎng)作用和分化能力已被嘗試用于各種眼表疾病的治療[4-6],可有效彌補(bǔ)藥物治療的不足,使病變的組織精準(zhǔn)再生,維持眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來(lái),DE受到廣泛關(guān)注,而淚膜導(dǎo)向型治療的提出以及再生醫(yī)學(xué)的新興發(fā)展使得DE的治療更傾向于精準(zhǔn)化再生醫(yī)療模式。因此,本文將主要對(duì)干細(xì)胞在DE再生治療中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 淚膜動(dòng)力學(xué)及生物學(xué)功能

與既往國(guó)際上提出的DE定義相比,此次亞洲干眼協(xié)會(huì)提出的新定義首次指出淚膜不穩(wěn)定是引起眼部癥狀和視力損害的關(guān)鍵病理機(jī)制,眼表?yè)p傷不再作為DE確診的必要條件,出現(xiàn)眼部不適癥狀結(jié)合淚膜不穩(wěn)定即可確診為DE[1]。

1.1 淚膜動(dòng)力學(xué)及淚膜破裂

淚膜是眼表的重要組成部分,淚膜穩(wěn)定是保護(hù)眼表上皮免受干燥應(yīng)激的重要機(jī)制之一[7]。淚膜形成的過(guò)程大致分兩步,首先,水液層隨著眼瞼瞬目涂布在眼表上皮表面,沉積時(shí)其厚度由上瞼對(duì)淚液向上的抽吸力和眼表上皮對(duì)淚液向下的黏性阻力之間的平衡所決定[8];其次,瞼板腺持續(xù)分泌脂質(zhì),再由下瞼的脂質(zhì)覆蓋表面和缺乏脂質(zhì)層的上淚液表面之間的張力梯度驅(qū)動(dòng)而向上擴(kuò)散形成脂質(zhì)層[9]。隨后黏蛋白沿著新形成的水—脂質(zhì)界面擴(kuò)散,進(jìn)一步促進(jìn)淚液和脂質(zhì)在眼表的均勻分布[10]。因此,淚膜三層結(jié)構(gòu)不應(yīng)被看作獨(dú)立的功能單位,而是相互協(xié)作的整體,其中任一成分的改變均會(huì)影響淚膜動(dòng)力學(xué)改變,進(jìn)而導(dǎo)致淚膜破裂[11]。研究表明,各類型的DE其淚膜破裂模式不同,如水液缺乏型DE表現(xiàn)為線條狀或區(qū)域狀淚膜破裂,脂質(zhì)缺乏型DE表現(xiàn)為隨機(jī)淚膜破裂,黏蛋白缺乏型DE表現(xiàn)為點(diǎn)狀或酒窩狀破裂,這均為眼科醫(yī)生在臨床診療中精準(zhǔn)評(píng)估DE的分型及決定后續(xù)適用的治療方案提供了新的診療思路[12]。

1.2 淚膜不穩(wěn)定在DE發(fā)病機(jī)制中的作用

1.2.1 淚膜不穩(wěn)定影響高階像差

淚膜是光線接觸到的第一個(gè)折射表面,在保持角膜表面光滑方面起著關(guān)鍵作用[13]。當(dāng)系統(tǒng)出現(xiàn)波前像差時(shí),折射光線不會(huì)再聚到預(yù)期的唯一像點(diǎn),導(dǎo)致圖像散焦或失真。研究表明,淚膜不穩(wěn)定會(huì)增加患者不規(guī)則的高階像差并引起眼球光學(xué)界面的異常,從而導(dǎo)致視覺(jué)功能和光學(xué)質(zhì)量受損[14]。

1.2.2 淚膜不穩(wěn)定對(duì)眼表的損害

在角膜上皮之前,淚膜是抵御環(huán)境和病原體的第一道細(xì)胞防線。淚膜不穩(wěn)定會(huì)使眼表直接接觸外界病原體,并導(dǎo)致機(jī)會(huì)性暴露,增加角膜上皮感染和損傷的機(jī)會(huì)[15]。同時(shí),淚膜含有許多生長(zhǎng)因子、抗菌肽、分泌型 IgA 和維生素等[16],它們通過(guò)維持免疫穩(wěn)態(tài)并提高宿主防御能力對(duì)眼表健康至關(guān)重要[17]。一旦淚膜屏障破壞,先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)被激活將進(jìn)一步引起眼表炎癥,繼而加劇上皮細(xì)胞的損傷。角膜上皮屏障的破壞是中重度DE的標(biāo)志,常被用作評(píng)估DE嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)之一[18]。

1.2.3 淚膜不穩(wěn)定引起角膜神經(jīng)病理性疼痛

研究顯示,眼表受到刺激會(huì)增加瞬目率,而滴用麻醉藥會(huì)導(dǎo)致瞬目率降低[19]。由于眼表干燥或淚膜不穩(wěn)定常會(huì)引起DE患者的眼表刺激,導(dǎo)致DE患者瞬目增加。當(dāng)覆蓋眼表的淚膜變薄時(shí),淺表上皮細(xì)胞對(duì)頻繁的瞬目運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力增高,從而會(huì)損傷終末神經(jīng)分支,引起角膜慢性疼痛。這啟動(dòng)了神經(jīng)退化和再生的循環(huán),導(dǎo)致角膜和結(jié)膜神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[20]。再生后的神經(jīng)興奮性也會(huì)發(fā)生改變,接受刺激的閾值降低,導(dǎo)致DE患者出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏或異常性疼痛[21]。

2 干細(xì)胞在修復(fù)淚膜各層結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用

2.1 水液層

水液缺乏型DE是DE的一個(gè)主要亞型,淚腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生和分泌初級(jí)淚液,構(gòu)成淚膜中最主要的水液層,其分泌不足會(huì)嚴(yán)重影響眼表的穩(wěn)態(tài)[18]。當(dāng)淚腺受到急性或慢性損傷時(shí),淚腺會(huì)被淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞浸潤(rùn),破壞腺泡、導(dǎo)管和肌上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致淚腺功能的喪失,最終引起水液缺乏型DE[22]。Dietrich等[23]誘導(dǎo)缺水型小鼠模型后,通過(guò)移植骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞使萎縮的腺泡細(xì)胞恢復(fù)到總淚腺組織的62.0%,與注射鹽水后的自發(fā)再生相比,腺泡細(xì)胞增加了25.0%,并恢復(fù)了模型鼠的淚液總量。此研究證實(shí)了體外干細(xì)胞移植的高治療潛力,并表明當(dāng)內(nèi)在再生潛力不足以恢復(fù)淚腺功能時(shí),外用細(xì)胞療法可實(shí)現(xiàn)更高的治療效果。Gromova等[24]成功從小鼠淚腺中分選出表達(dá)細(xì)胞黏附分子的淚腺上皮祖細(xì)胞(EPCPs),分離出來(lái)的EPCPs在體外培育1周后可重新聚集分化為導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu);進(jìn)一步研究證實(shí),將EPCPs注射到血小板反應(yīng)蛋白-1敲除(TSP-1-/-) 的DE小鼠淚腺中,這些 EPCPs可以成功地移植到病變導(dǎo)管和腺泡中并恢復(fù)腺泡結(jié)構(gòu),同時(shí),EPCPs 可以增加患有慢性淚腺功能障礙的TSP-1-/-小鼠的淚液分泌。這證明了內(nèi)源性祖細(xì)胞移植可用于治療淚腺功能障礙所致的水液缺乏型DE。綜上所述,與常規(guī)的人工淚液療法相比,外源性干細(xì)胞或內(nèi)源性祖細(xì)胞對(duì)治療嚴(yán)重缺水型DE患者是一種更有希望的方法。

2.2 黏蛋白層

黏蛋白對(duì)淚膜的穩(wěn)定性至關(guān)重要,其位于淚膜的最內(nèi)層,多種黏蛋白嵌入角結(jié)膜上皮細(xì)胞的微絨毛之間,確保水液能均勻的涂布于眼表,結(jié)膜杯狀細(xì)胞是分泌黏蛋白的主要來(lái)源[10]。然而患有嚴(yán)重眼表疾病者,如斯-約綜合征、瘢痕型類天皰瘡、移植物抗宿主病和累及結(jié)膜的嚴(yán)重堿燒傷,通常會(huì)存在結(jié)膜杯狀細(xì)胞在眼表上皮細(xì)胞中完全喪失,引發(fā)黏蛋白缺乏型DE[25]。結(jié)膜上皮是由結(jié)膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞雙類型細(xì)胞組成,其分化和發(fā)育尚未得到很好的表征,有研究一直在不斷嘗試各種策略來(lái)培養(yǎng)結(jié)膜上皮尤其是杯狀細(xì)胞[26]。Nomi等[27]使用生長(zhǎng)因子輔助培養(yǎng)策略,通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子首先驅(qū)動(dòng)多能干細(xì)胞發(fā)育成為結(jié)膜上皮譜系,接著利用角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分離的細(xì)胞促進(jìn)杯狀細(xì)胞的成熟,成功培育出能產(chǎn)生黏蛋白的功能性結(jié)膜上皮細(xì)胞片。Zhong等[28]使用無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)成功地?cái)U(kuò)增了兔衍生的結(jié)膜干細(xì)胞,免疫熒光顯示干細(xì)胞標(biāo)志物和杯狀細(xì)胞黏蛋白MUC5AC和MUC16呈陽(yáng)性表達(dá);接著將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞封裝在水凝膠中,使用注射器將其輸送到兔結(jié)膜囊下,通過(guò)使用慢病毒載體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞,結(jié)果顯示,第5天水凝膠微結(jié)構(gòu)成功將細(xì)胞遞送到球結(jié)膜上皮中。這項(xiàng)研究成功地將3D打印技術(shù)與干細(xì)胞移植相結(jié)合,為干細(xì)胞將來(lái)能夠治療嚴(yán)重眼表疾病包括黏蛋白缺乏型DE的微創(chuàng)治療提供了重要臨床思路。除了干細(xì)胞移植工程,由干細(xì)胞脫細(xì)胞技術(shù)制成的脫細(xì)胞組織也被用于組織修復(fù)。一項(xiàng)結(jié)膜缺損的兔模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性制造了脫細(xì)胞基質(zhì),與羊膜移植組相比,脫細(xì)胞基質(zhì)組兔治療后具有更好的分層上皮結(jié)構(gòu)且含有更多的杯狀細(xì)胞,且在促進(jìn)傷口愈合方面顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)[29]。在眼表重建中,源于此類干細(xì)胞的脫細(xì)胞基質(zhì)也可作為一種有前途的結(jié)膜組織替代物。隨著對(duì)結(jié)膜杯狀細(xì)胞表型的探索,利用細(xì)胞療法或組織工程均有望在未來(lái)的臨床治療中使退化的杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)再生并恢復(fù)其分泌功能,也為治療黏蛋白缺乏型DE提供了新的視角。

2.3 脂質(zhì)層

脂質(zhì)層位于淚膜的最外側(cè),由瞼板腺分泌并通過(guò)眼瞼瞬目促使其釋放,通過(guò)保護(hù)水液層不蒸發(fā)來(lái)維持眼表的穩(wěn)態(tài),同時(shí)還保護(hù)眼免受環(huán)境威脅和感染[30]。當(dāng)瞼板腺功能障礙影響瞼脂生成時(shí),可導(dǎo)致脂質(zhì)缺乏型DE,且瞼板腺功能障礙通常伴隨著腺體萎縮缺失,這也是脂質(zhì)缺乏型DE無(wú)法治愈的主要原因[31]。瞼板腺由圍繞中央導(dǎo)管組織的幾個(gè)腺泡組成,腺泡包含分泌瞼脂的瞼板腺上皮細(xì)胞,在瞼板腺細(xì)胞成熟并最終分化后,它們會(huì)破裂并釋放其脂質(zhì)成分[32]。因此,瞼板腺細(xì)胞群在整個(gè)生命過(guò)程中需要不斷更新補(bǔ)充,那么可能存在調(diào)節(jié)瞼板腺細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的成體干細(xì)胞群。一項(xiàng)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,Krox20細(xì)胞系可誘導(dǎo)產(chǎn)生完整且成熟的瞼板腺,若敲除Krox20則會(huì)導(dǎo)致瞼板腺標(biāo)志物K14和PPARγ的缺失,同時(shí)在眼瞼中也檢測(cè)不到油紅O染色標(biāo)記的脂質(zhì),這提示Krox20為瞼板腺干細(xì)胞標(biāo)志物,敲除Krox20可能會(huì)影響瞼板腺的發(fā)育[33]。除干細(xì)胞標(biāo)志物外,干細(xì)胞“生態(tài)位”的特征也尚未得到很好的表征,尋找瞼板腺發(fā)育過(guò)程祖細(xì)胞起源的潛在位點(diǎn)也是一直在探索的方向。Parfitt等[34]通過(guò)使用H2B-GFP/K5tTA小鼠,在3D重建中利用譜系追蹤轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn),熒光標(biāo)記細(xì)胞主要局限于腺泡內(nèi)導(dǎo)管上皮的末端區(qū)域,這表明導(dǎo)管上皮的末端是瞼板腺干細(xì)胞的潛在位點(diǎn),而不是如先前闡明的那樣位于外周或中央導(dǎo)管[35]。近年來(lái)的研究中,雖然瞼板腺的形態(tài)發(fā)育得到了很好的描述[36],但瞼板腺功能障礙介導(dǎo)DE的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)尚未完全清楚,能夠成功鑒定出產(chǎn)生瞼板腺的干細(xì)胞群對(duì)于恢復(fù)瞼板腺的功能并再生腺體具有臨床價(jià)值,這提示干細(xì)胞可作為脂質(zhì)缺乏型DE的有效治療策略。

3 結(jié)束語(yǔ)

2017亞洲干眼共識(shí)將淚膜不穩(wěn)定定義為DE的核心特征,并在此基礎(chǔ)上提出了淚膜導(dǎo)向型治療策略, DE治療需先確定哪一層淚膜受到影響,進(jìn)而針對(duì)性治療。鑒于DE的個(gè)體差異性和復(fù)雜性,僅僅是對(duì)癥治療仍停留在“治標(biāo)”層面,仍有大量患者表現(xiàn)出久治難愈,因此,對(duì)常規(guī)治療無(wú)效的個(gè)體亟待一種新型療法。本文主要闡述了干細(xì)胞在各類DE中發(fā)揮的再生和替代作用。各層眼表組織中均存在干細(xì)胞的生態(tài)位,而且將各類型干細(xì)胞靶向移植治療DE模型動(dòng)物受損的外分泌腺取得顯著效果。隨著對(duì)干細(xì)胞分化潛能的深入研究和臨床應(yīng)用的不斷探索,干細(xì)胞有望為更高效、更精準(zhǔn)的DE治療提供新的思路與方向。