高蕓, 王中群, 李麗華

江蘇大學附屬醫(yī)院 1.病理科, 2.心內(nèi)科,江蘇鎮(zhèn)江 212001

醫(yī)學影像學技術(shù)是人體組織結(jié)構(gòu)重建的主要手段。利用微型CT對血管組織進行重建,但受限于儀器分辨率不足等因素,血管壁鈣化斑塊和細胞外基質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)難以呈現(xiàn)[1]。依賴計算機優(yōu)化算法能精準呈現(xiàn)影像技術(shù),但由于所需運算量大,運算時間過長,反而限制了實際的臨床應用[2]。隨著計算機輔助人體組織連續(xù)切片(serial sections,SS)后三維重建技術(shù)的高速發(fā)展,不僅能精確展示人體組織復雜結(jié)構(gòu),并且可以多維度查看[3];通過與測量軟件的結(jié)合應用,對重建的目標組織進行不同參數(shù)的測量,還可便于分析其空間結(jié)構(gòu)[4]。本文綜述基于計算機輔助組織連續(xù)切片后三維重建的研究進展,對其過程方法和應用進行了總結(jié),旨在為其應用于臨床提供理論基礎。

1 三維重建前的組織切片準備

1.1 組織包埋

1.1.1 石蠟包埋法 組織標本在10%多聚甲醛溶液中固定24 h[5]。待標本固定完全后,依據(jù)需求切取合適部位,分成厚度約3 mm,面積約2 cm×1.5 cm的連續(xù)小塊,區(qū)分近心端和遠心端,按順序標號,保證取材過程中切面的平整。所取標本組織放入包埋盒經(jīng)脫水處理完畢后取出,按所標順序?qū)⑶忻尜N于裝有液態(tài)石蠟的金屬包埋盒底模并輕壓組織防止出現(xiàn)氣泡,待組織冷卻凝固后進行切片。石蠟包埋法所做切片具有能夠完整展現(xiàn)組織形態(tài)的優(yōu)勢,但因處理過程較長,石蠟浸入組織導致細胞形態(tài)發(fā)生改變,組織體積縮小,對后期進行特殊染色和完整結(jié)構(gòu)重建的效果產(chǎn)生一定的影響[6]。

1.1.2 冷凍切片法 常規(guī)冷凍技術(shù)是將所取新鮮組織切取合適大小并用冷凍切片包埋劑完全包裹后,直接置于冷凍切片機中等待冷凍凝固后切片,亦可采用液氮直接冷凍標本。孫紅星等[7]將液氮冷凍包埋技術(shù)分為液氮浸入法(快速冷凍)、液氮漂浮法(較慢冷凍)和直接-80 ℃法。對于骨骼肌適合采用液氮浸入法處理,而心肌和平滑肌則適合采用液氮漂浮法處理。用冷凍包埋方法所做的切片能更好地保持組織細胞抗原的活性,但對操作技術(shù)要求較高,處理方法受組織組成成分的影響較大[8];脂肪較多的組織,冷凍的時間有所增加;而較致密的組織冷凍時間則不宜過長[9]。冷凍切片雖不會對組織的體積和細胞的形狀造成影響,但對于組織內(nèi)微小結(jié)構(gòu)的展示上有一定的缺陷[10]。

1.1.3 瓊脂石蠟雙包埋法 瓊脂石蠟雙包埋法是將所需組織切成合適的大小后,用配比好的瓊脂液將其完全包裹后,再采用常規(guī)石蠟包埋法進行處理。賓業(yè)健等[11]對小鼠血管采用瓊脂石蠟雙包埋法處理,在切片中可以觀察到完整的血管內(nèi)膜,且管腔圓潤不皺縮。Dahele等[12]將肺非小細胞肺癌的標本采用瓊脂石蠟雙包埋處理后連續(xù)切片重建了三維模型,發(fā)現(xiàn)此方法可以保證肺組織在切片時不會發(fā)生塌陷。瓊脂石蠟雙包埋法既保證了組織能夠在切片上完整展現(xiàn),又避免了組織因為脫水而產(chǎn)生的變形問題;但操作結(jié)果受瓊脂含量影響較大,不同的組織處理時所需瓊脂含量有所差異,過稀會產(chǎn)生組織脫水后變形,過于濃稠會導致組織脫水不完全發(fā)生垮塌等問題。

1.2 組織連續(xù)切片和切片染色

完整組織的連續(xù)切片是后續(xù)三維重建的基礎,切片時需厚度一致,組織平整,連貫等距[4],避免攤片溫度不合適導致組織不能完全攤開或散開過大,以及因為刀片缺損產(chǎn)生不必要的刀痕。

在切片厚度的選擇上,常規(guī)石蠟切片的厚度一般為3～5 μm。吉佳樂等[13]對不同石蠟切片厚度進行相同的免疫標記,經(jīng)對比,6、8 μm厚度的切片比2 μm厚度切片的非特異性染色多,且組織結(jié)構(gòu)存在脫落的現(xiàn)象;而切片厚度為4 μm時,組織結(jié)構(gòu)相對完整,背景干凈更利于細胞計數(shù)。冷凍切片的厚度可稍大,一般為8～10 μm;當組織較致密時,切片厚度5 μm即可;對于脂肪含量較多的組織,可大于10 μm,以保證組織結(jié)構(gòu)的完整[9]。對于較小、較干的組織,為防止脫片,宜選用膠片來保證切片完整[10]。

完整組織的三維重建要求染色清晰易區(qū)分,常規(guī)HE染色可滿足基本的三維重建需求。除此之外,某些組織或結(jié)構(gòu)可采用特殊的染色方法使其更清晰易識別;例如用CD31抗體染色顯示斑塊表面的內(nèi)皮剝脫程度[14];α-action抗體染色可以顯示動脈粥樣硬化斑塊富含平滑肌細胞[14];通過EVG染色對彈力纖維進行染色[15];通過茜素紅S鈣染色法或馮·科薩染色法,可以對組織中的鈣化成分進行染色識別等[1]。

2 計算機輔助下的圖片配準和重建

2.1 圖片配準

圖片配準是組織結(jié)構(gòu)三維重建前的重要步驟。如果要使所構(gòu)建的三維模型準確,需找到精準且高效的定位點,以保證相鄰組織切片吻合連貫。配準采用的定位一般分為硬定位和軟定位兩種方法。

2.1.1 硬定位 指采用各種機械方法在組織連續(xù)的切片上標記參考點,通過連續(xù)的參考點對齊來達到定位效果。硬定位方法又分為內(nèi)定位法和外定位法兩種。內(nèi)定位法是根據(jù)組織的解剖結(jié)構(gòu)特點,在切片圖像中尋找特定的定位結(jié)構(gòu)進行定位,存在因生物組織結(jié)構(gòu)形態(tài)復雜,導致定位誤差較大的缺點。外定位法是在目標組織上作標記進行定位,通常利用細針、激光或微電極穿孔,再通過基孔的對齊來實現(xiàn)切片的對位[16]。

2.1.2 軟定位 指依據(jù)生物組織的連續(xù)性和完整性,通過一定的配準算法和計算機軟件的輔助實現(xiàn)兩幅連續(xù)切片圖像間的對齊[15]。

由于軟定位法繁瑣、耗時長,目前主要采用硬定位方法,基于定位誤差考慮,又以外定位法最為常用。不同于以往直接用細針或是激光穿孔等常規(guī)手段,現(xiàn)一般將女性頭發(fā)貼附于所取組織,一起用冷凍切片包埋劑包埋后冷凍切片,或?qū)㈩^發(fā)粘在針灸針末端,在周圍脂肪組織內(nèi)穿3～4根女性發(fā)絲,作為后期三維重建的定位標識[17]。高鴿等[18]認為,頭發(fā)會在組織切片上留下明顯刀痕,導致圖片的完整性受到破壞,同時在染色的過程中容易發(fā)生脫片等現(xiàn)象;對此可采用在伊紅染液中浸泡了24 h的苞米穗代替頭發(fā),以解決脫片和圖片破壞的問題。

2.2 三維重建

染色完成的切片借助光學顯微鏡的觀察適當描出組織邊界,以便于后續(xù)采用高清掃描儀將完整切片圖片導入計算機內(nèi)[19]。將掃描完成的圖片導入Adobe Photoshop軟件內(nèi),以第1張切片圖片為基準,通過預先設置的定位點,將其余圖片依次導入、配準,調(diào)節(jié)圖片透明度為50%～60%。連續(xù)切片配準完成后,導入三維重建軟件進行三維重建[16]。

3 應用和展望

目前,國內(nèi)外很多學者已將組織連續(xù)切片三維重建技術(shù)運用在實踐中?，F(xiàn)有研究在HE染色下進行組織三維重建的基礎上,開始結(jié)合免疫組化、免疫熒光等技術(shù),進一步完善和優(yōu)化組織三維重建技術(shù),探索和拓展其在臨床診斷與疾病治療等方面的應用。

基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù),由于其準確性和易于觀測等特點,在組織的結(jié)構(gòu)性研究上有著顯著的優(yōu)勢。熊波等[17]發(fā)現(xiàn),高血壓犬腎動脈近端的腎交感神經(jīng)數(shù)量較非高血壓犬顯著增多;Enderle等[20]結(jié)果表明,腫瘤芽主要與病變的主要腫塊有關(guān),并闡明了腫瘤間的異質(zhì)性;Kuwajima等[21]研究不僅揭示了突觸結(jié)構(gòu)之間的連接,還檢測到多泡小體分布的變化以及刺突等高度復雜的神經(jīng)纖維成分的結(jié)構(gòu)變化。三維重建技術(shù)不僅僅局限于組織病理學,王博等[22]針對細胞進行了連續(xù)切片后的三維重建,可以更全面、客觀地展示細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。

通過結(jié)合免疫組化、免疫熒光等技術(shù),基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)在腫瘤組織的研究應用方面更為廣泛和深入。錢立宇等[23]通過對乳腺癌的前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node,SLN)進行連續(xù)切片后三維重建,發(fā)現(xiàn)可以增加SLN微轉(zhuǎn)移的檢出率;Yagi等[24]發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞通過肺泡中的空氣傳播并且對附著的血管具有選擇性。在Fujisawa等[25]的研究中,通過實驗對比提出了組織連續(xù)切片的適宜厚度,同時也針對不同免疫組化標記對配準的影響提出了相關(guān)建議,例如Ki67對細胞核的免疫標記不適宜作為配準的參照,并在一系列對比實驗的基礎上對乳腺腫瘤的血管、被癌細胞包裹的腦血管以及混合性纖維瘤的主要血管分別進行了免疫標記后的三維重建;Wang等[26]證明了全層組織連續(xù)切片后三維重建是研究腫瘤的侵襲模式和對切緣評估的最理想方式。Ueda等[27]發(fā)現(xiàn),組織三維重建技術(shù)更有助于了解腫瘤表面的微結(jié)構(gòu)和微血管。

基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)可廣泛應用于各類組織中[4-5,28-33]。相較于傳統(tǒng)醫(yī)學影像學技術(shù),基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)在揭示血管結(jié)構(gòu)、探究血管病變機理等方面可以提供更準確與精細的結(jié)果(表1)。

表1 部分血管三維重建技術(shù)的應用

4 結(jié) 語

基于組織連續(xù)切片的三維重建技術(shù)所得到的組織結(jié)構(gòu),可以清晰、準確、完整地呈現(xiàn)各部位細節(jié)結(jié)構(gòu)。盡管該技術(shù)存在操作復雜、大量重復性工作等弊端,但并不影響其為病理組織復雜的結(jié)構(gòu)提供了真實還原的解剖結(jié)構(gòu)基礎,因此,基于組織連續(xù)切片后三維重建技術(shù)成為醫(yī)務工作者及相關(guān)研究人員理解病理組織的強有力的工具,也為基礎科學和臨床科學的學生提供了一種高效的學習工具。組織三維重建技術(shù)的發(fā)展與進步為未來3D生物打印技術(shù)的實用化提供了最重要的理論基礎,為人類保障健康,延續(xù)生命帶來新的希望。