鄧云雙　李桃　鄧曉玲　鄭正

關鍵詞：柑橘黃龍病；癥狀；茶枝柑；橘絡；病原分布

中圖分類號：S436.66 文獻標識碼：A

柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生產中最具毀滅性的病害之一，對全球的柑橘產業(yè)造成巨大的經濟損失。黃龍病病原為α- 變形菌綱（ Alphaproteobacteria ）， 根瘤菌科（Rhizobiaceae），候選韌皮部桿菌屬細菌（Candidatusliberibacter spp.）[1]。根據病原16S rDNA 和β-操縱子基因的序列特征，以及傳病媒介和病原性質，可分為亞洲種（Candidatus Liberibacterasiaticus， CLas）、非洲種（Candidatus Liberibacterafricanus， CLaf）和美洲種（Candidatus Liberibacteramericanus， CLam），其中CLas 的分布范圍最廣，危害最大[2]。通過對我國柑橘黃龍樣品進行16SrRNA 基因的擴增以及測序分析發(fā)現(xiàn)，我國柑橘黃龍病菌均為CLas[3-4]。柑橘感染黃龍病后葉片會出現(xiàn)均勻黃化、斑駁黃化以及缺素狀黃化等癥狀，同時植株不定期抽稍，開花多而早，座果率低，果實小而畸形，果實成熟期出現(xiàn)“紅鼻子”果、“青果”等典型癥狀[5]。

黃龍病作為系統(tǒng)性侵染病害，其病原在染病植株內分布并不均勻[3， 6-16]。郭亨玉等[7]發(fā)現(xiàn)染病貢柑橘絡中的CLas 濃度最高且顯著高于其他部位（果實中軸、新葉等）。陳燕玲等[8]發(fā)現(xiàn)同一病枝的“紅鼻子果”中CLas 濃度高于葉片的，而斑駁老葉的CLas 濃度低于新葉。健康植株在染病后，體內的病原菌濃度分布并不均勻，不同組織間也存在差異[9]。婁兵海等[11]發(fā)現(xiàn)柑橘花器和種子中的CLas 分布不均，其中種皮組織濃度最高，花粉濃度最低。FANG 等[13]發(fā)現(xiàn)CLas 在染病沙糖桔的果皮內分布不均勻，傾向于定植于果皮的中間或遠端（莖端）區(qū)域。KUNTA 等[14]發(fā)現(xiàn)葡萄柚和甜橙的花梗、果軸、葉中脈的CLas 濃度明顯高于其他部位。LOUZADA 等[15]發(fā)現(xiàn)在樹的北側CLas 濃度顯著高于南、西兩側；而對于樹的根部，土壤表層及水平生長根中的CLas 濃度高于深層垂直生長的根。TATINENI 等[16]發(fā)現(xiàn)在染病柑橘果柄處的CLas 濃度最高，且顯著高于其他部位。

茶枝柑（Citrus reticulata cv. chachiensis）又稱新會柑，在廣東新會栽培歷史悠久，是廣東地區(qū)的特色農業(yè)產品[17]。利用其果皮加工制成的陳皮具有一定的藥用價值和經濟價值[18]。茶枝柑在感染黃龍病菌后，會出現(xiàn)植株衰退，甚至大幅度減產的情況，嚴重制約了產業(yè)的發(fā)展[19]。目前，尚無茶枝柑感染黃龍病后的癥狀表現(xiàn)及病原在植株中分布情況的系統(tǒng)報道。本研究以廣東新會地區(qū)感染黃龍病的茶枝柑為材料，對茶枝柑感染黃龍病后的癥狀進行系統(tǒng)描述，并通過實時熒光定量PCR 對CLas 在茶枝柑枝條不同部位中的含量及分布情況進行分析，為進一步探究CLas 在茶枝柑中的轉運規(guī)律提供基礎，同時也可為篩選高濃度的黃龍病菌材料提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感染黃龍病的茶枝柑枝條 2021 年11 月于廣東省新會市采集具有黃龍病典型癥狀的茶枝柑帶果枝條若干，經Real-time PCR 檢測后挑選攜帶黃龍病菌的帶果枝條作為試驗材料。挑選來自不同植株的25 枝具有黃龍病典型癥狀的茶枝柑帶果枝條，作為25 個生物學重復。如圖1 所示，將每個帶果枝條依次分為：新葉、新梢枝條韌皮部、果蒂、橘絡、果實中軸、果實枝條葉片、果實枝條韌皮部、下部老葉8 個部分。樣品收集后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 感染黃龍病的茶枝柑果實橘絡 挑選14 個直徑較大且經過檢測攜帶黃龍病菌的茶枝柑果實作為材料，用工具使橘絡從果實中完整分離。如圖2 所示，每個果實挑取3 條較長并且長度超過5 cm 的橘絡，按從果蒂到果實底部的方向進行切段，每1 cm 為一段，只保留前5 段，切碎置于2 mL收集管中，舍棄多余橘絡（不足1 cm），收集的橘絡用于DNA 提取及CLas 定量檢測。

1.2 方法

1.2.1 植物DNA 提取 所有樣品分別處理切碎取0.1 g 進行DNA 提取，其中柑橘葉片僅切取葉中脈。提取總DNA 的方法選用OMEGA BIO-TEK公司的植物DNA 提取試劑盒HP Plant DNA Kit（200） （2485-02）。提取的DNA 樣品使用超微量紫外-可見光分光光度計NanoDrop one（ThermoFisher Scientific）進行濃度和純度的測定，并置于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柑橘黃龍病菌的檢測與定量 使用實時熒光定量PCR 對CLas 進行檢測與定量。檢測方法參考BAO 等[20]的CLas 定量PCR 檢測方法，對所有DNA 樣品進行TaqMan 實時熒光定量PCR檢測。以已知含有CLas 的茶枝柑DNA 樣本為陽性對照，健康茶枝柑DNA 樣本為陰性對照，ddH2O 為空白對照，以提取的所有DNA 樣品為模板，進行熒光定量PCR 擴增。根據反應后得到的CT 值來判斷樣品中是否含有柑橘黃龍病病菌（CT 值<32）。

qPCR 使用含有引物目的片段pEASY-T1（TransGen Biotech，全式金生物）重組質粒制作標準曲線，共設置8 個梯度（10 倍稀釋），得到標準方程以量化在總DNA 中的CLas 含量。同一枝條不同部位中的CLas 含量以每1 ng DNA 含有的CLas 拷貝數來表示。同一橘絡不同片段中的CLas含量=每1 μL DNA 的CLas 拷貝數×提取的總DNA 體積。

1.3 數據處理

使用SPSS 26 和Microsoft Excel 2019 軟件進行試驗數據的統(tǒng)計學分析。運用SPSS 26（IBMCorp.，Armonk， N.Y.， USA）單因素方差分析（ANOVA）中的鄧肯式復極差檢驗法（DMRT）進行多重比較，利用Origin 2018（OriginLab Corp.， Northampton，MA 01060， USA）對所得數據進行可視化。

2 結果與分析

2.1 感染黃龍病茶枝柑的癥狀觀察

茶枝柑植株在感染黃龍病后，枝條上部葉片表現(xiàn)為斑駁型、缺素狀黃化，尤其是枝條新葉癥狀較為明顯，而下部老葉顏色深綠無黃化，質地較硬（圖1）；而感染柑橘黃龍病的茶枝柑果實（圖3A～圖3C）與健康茶枝柑果實（圖3D～圖3F）相比，果實著色不均勻，由果蒂向下呈橘紅色，接近果實底部顏色接近青綠色，為典型的“紅鼻子”果癥狀，同時感染黃龍病的果實與健康果實相比，大小不均勻，果身不正，呈不對稱畸形狀；切開果實可見種子極小，種子呈敗育癥狀。

2.2 黃龍病菌在茶枝柑枝條不同部位的分布

通過對感染黃龍病茶枝柑枝條的8 個部位樣品進行CLas 檢測發(fā)現(xiàn)，在25 個染病枝條中，除果實橘絡、中軸及老葉能穩(wěn)定檢測到CLas 外，其他部位均有部分樣本未檢測到CLas，尤其是新梢部位（包括新葉中脈和新梢韌皮部）的陰性樣本比其他部位多（表1）。定量結果表明，CLas 在染病茶枝柑枝條中的分布并不均勻（圖4），其中果實中軸的CLas 含量最高，橘絡次之，2 種組織中的CLas 含量接近均顯著高于其他部位（P<0.05）。染病茶枝柑枝條不同部位的CLas 含量從高到低依次為：果實中軸（2 770 162.87±544 972.11）>橘絡（2 721 335.84±528 771.21）>果實枝條葉片（530 145.21±382 295.05）>果蒂（339 704.79±67 481.43）>新葉（168 229.39±30 035.39 ） > 果實枝條韌皮部（ 150 789.13±26 500.31）>新梢韌皮部（131 369.40±20 451.80）>老葉（51 952.04±6987.41）。

2.3 黃龍病菌在同一果實同一橘絡中的分布

基于染病果實中軸和橘絡中具有較高的CLas 含量，本研究進一步以易剝離的橘絡組織為材料，探究CLas 在橘絡組織中的分布規(guī)律。如圖5 所示，通過對同一橘絡不同長度片段（每1 cm）中的CLas 含量進行比較分析，發(fā)現(xiàn)CLas 在同一條茶枝柑橘絡中呈不均勻的分布規(guī)律，其中位于1～2 cm 位置的橘絡片段組織中所含有的CLas 含量（670 933 419.18±133 913 902.91）最高，其次為位于2-3 cm 處的橘絡組織片段（595 644 317.71±121 200 818.51）。統(tǒng)計分析表明，位于1～2 cm 和2～3 cm 位置的橘絡片段組織中的CLas 含量顯著高于位于前端（0～1 cm）和后端（4～5 cm）中的CLas 含量（P<0.05）。

3 討論

本研究中觀察發(fā)現(xiàn)茶枝柑在感染黃龍病后，葉片會出現(xiàn)斑駁黃化及花葉癥狀，果實呈現(xiàn)典型“紅鼻子”果，果實畸形不對稱，種子敗育等癥狀，這些癥狀與砂糖橘感染黃龍病后的癥狀表現(xiàn)極為相似[8， 21]。由于CLas 在果實中分布不均勻，采取更為靈敏的qPCR 方法對柑橘黃龍病菌的檢測和定量分析至關重要，而本研究中所采取的TaqMan 實時熒光定量PCR 特異性好，較普通qPCR 更為靈敏[20]，也被廣泛使用于CLas 的檢測分析中。本研究通過分析感染黃龍病的茶枝柑帶果枝條不同部位的CLas 含量，發(fā)現(xiàn)CLas 在茶枝柑枝條各部分分布不均勻，主要富集于果實及附近部位（庫器官），這一結果與其他品種[7-10， 12]的研究結果類似，本研究中果實中軸的CLas 含量最高，而作為源器官的老葉部分CLas 則最低。TATINENI 等[16]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CLas 可通過篩孔在植株中移動，并推測CLas 在植株體內的移動方向與營養(yǎng)流動方向一致，可以從制造營養(yǎng)的源器官（如成熟老葉）轉向儲存或消耗營養(yǎng)的庫器官（如果實、新葉、花等），這可以進一步解釋眾多研究中CLas 均富集于果實的原因。大多數對柑橘類CLas 分布規(guī)律的研究結果表明，橘絡上的病菌濃度最高且顯著高于其他部位[7-8， 12]，而柚類則是果實中軸的CLas 含量遠高于其他部位[12]；本研究中則是在茶枝柑果實中軸上的CLas 含量最高，橘絡次之，二者差異雖然不顯著，但均顯著高于其他部位，與上述2 個品種中的CLas 分布規(guī)律有所不同，這可能與果實品種、成熟度、采樣時間等因素有關。

對CLas 在橘絡中分布規(guī)律的研究結果顯示，CLas 主要聚集在橘絡中部，在靠果蒂處含量最低，與郭亨玉等[7]的研究結果一致。橘絡中含有韌皮部和木質部共同組成的維管束組織，為果實運輸發(fā)育所需的各類營養(yǎng)物質，且與汁囊即果實果肉相連，能夠為CLas 的生長提供良好的營養(yǎng)條件和場所[13]，推測由于橘絡中部恰好對于果實膨大部位即汁囊更多，營養(yǎng)更豐富，CLas 則能在此處更好地繁殖生長，因此含量更高。果蒂是植株向整個果實輸導營養(yǎng)成分的樞紐，張培等[10]通過掃描電鏡觀察到感染黃龍病的果實果柄的韌皮部篩管細胞雜亂無章，有大量淀粉堆積，堵塞篩管，推測篩管堵塞會阻礙黃龍病菌的移動是造成黃龍病菌分布不均勻的原因之一。另外FANG 等[13]通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CLas 在橘絡的韌皮部細胞中也呈不均勻分布，有的韌皮部細胞中充滿CLas，而相鄰韌皮部細胞則含較少甚至未發(fā)現(xiàn)CLas 的存在，這從解剖學上進一步解釋了CLas在橘絡中分布不均勻的原因。

綜上所述，CLas 在染病茶枝柑枝條及同一橘絡均呈不均勻分布，并且CLas 在茶枝柑果實中軸及橘絡中的濃度顯著高于其他部位，CLas 在茶枝柑同一條橘絡1～3 cm 片段含量稍高于其他片段，本研究結果可為研究CLas 在侵染柑橘后的轉運規(guī)律提供理論基礎，同時也可為今后快速獲得高含量黃龍病菌尋找理想植物材料提供參考依據。