9種花椒果實的揮發(fā)性成分比較分析

黎禮謙, 張付豪, 羅英艦, 鄭元利, 楊玉霞, 姚華開

(遵義市農(nóng)業(yè)科學研究院, 貴州 遵義 563000)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)為蕓香科花椒屬落葉小喬木或灌木,主要生長于我國的四川、貴州、陜西、重慶等省(市),是一種藥食同源的木本油料樹種?；ń废銡鉂庥?、味辛麻,果皮可用作調料,也可入藥,用于治療胸部、腹部及胃的寒痛等[1]。目前,我國花椒約有45種,各品種花椒的風味評價及生長環(huán)境亦有所差異,而花椒的風味評價主要受其香氣成分及辛麻味的影響[2]。

花椒香氣主要源于花椒果皮中的檸檬烯、檜烯、芳樟醇、月桂烯、乙酸松油酯、桉樹腦等120余種[3]揮發(fā)性物質,這些物質在醫(yī)藥方面具有麻醉、止痛、逐寒、抗腫瘤等功效[4]。不同地區(qū)和品種的花椒香氣類型不同,主要原因是其所含的揮發(fā)性物質種類及含量有所差異[5]。蒲鳳琳等[6]通過特征香氣主成分分析,證實了在四川漢源、重慶江津等4個地區(qū)的青花椒中存在著相似和不相似的香氣成分物質。樊丹青等[7]研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的花椒揮發(fā)油中主要香氣成分含量差異顯著。目前,常見的植物酰胺類物質的測定分析方法主要有氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS)[8]、電子鼻技術[9]、氣相色譜技術[10]、超高效液相色譜串聯(lián)質譜分析[11]、紅外光譜法[12]和分光光度法[13]等。本研究以我國花椒盛產(chǎn)地的9種花椒為試驗品種,采用氣相色譜-質譜聯(lián)用分析技術,結合聚類分析和主成分分析等對9種花椒揮發(fā)性成分進行比較分析,為進一步探究我國各地花椒品種的品質差異,促進優(yōu)質花椒品種選育及花椒產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

9個試驗品種由遵義市農(nóng)業(yè)科學研究院花椒試驗基地提供,品種及樣品編號見表1。

表1 9種花椒樣品信息

1.2 試驗方法

1.2.1樣品前處理

頂空進樣參數(shù):稱取適量花椒樣品放于頂空瓶中,密封后轉移至80 ℃水浴鍋加熱0.5 h,用固相微萃取針萃取樣品0.5 h,將萃取針放至進樣口解吸5 min。

GC條件:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣流速:1.0 mL/min;四級桿溫度:180 ℃;進樣口溫度:250 ℃;分流比:不分流。升溫程序:起始溫度:45 ℃,保持時間4 min,以6 ℃/min的速率升至130 ℃,保持時間6 min,再以10 ℃/min的速率升至230 ℃,保持時間8 min。

MS條件:電子轟擊源;離子源溫度:230 ℃;接口溫度:250 ℃;電子能量70 eV;質量掃描范圍:35～500 m/z

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1GC-MS數(shù)據(jù)分析

在NIST17標譜庫中對采集到的質譜圖進行檢索,選取其中匹配度大于80%的物質,通過面積歸一化法分析各成分的相對含量。以檢測到的物質保留時間為有效響應點,以保留時間-峰面積歸一化法為數(shù)據(jù)集,對花椒揮發(fā)性成分進行定性定量分析。

1.3.2聚類分析

利用組間連接法,探究花椒樣品中揮發(fā)性成分的構成種類及含量之間的差異性。

1.3.3主成分分析

采用SIMCA14.1軟件對花椒樣品中的揮發(fā)性成分進行主成分分析,通過在PCA散點圖中轉換得PCA第1主成分和第2主成分貢獻率,計算兩者的總貢獻率。一般總貢獻率超過70%,說明主要成分具有代表性,以此確定花椒中主要特征風味成分[14-15]。

2 結果與分析

2.1 9種花椒揮發(fā)性成分及含量分析

采用GC-MS方法分析,對9種花椒揮發(fā)性成分進行測定,鑒定出揮發(fā)性成分137種,占揮發(fā)油含量的98.55%～99.51%,其中,包含烴類 (55種)、醇類(36種)、酯類 (21種)、醛類 (7種)、酮類 (10種)及其他 (8種),9種花椒揮發(fā)性成分中共有成分26種,非共有成分111種。9種花椒各自的揮發(fā)性成分構成及相對含量如圖1所示,由圖1A可知,ZBM9中檢測出的揮發(fā)性成分種類最多,為83種;其次為ZBM5和ZBM6,均檢測出82 種;ZBM8、ZBM7、ZBM4、ZBM3、ZBM1和ZBM2分別為80種、79種、78種、75種、73種和70種。在9種花椒揮發(fā)性成分中,烴類及其衍生物種類最多,醇類以及酯類物質種類占比次之;醛類、酮類和其他類物質較少。

注:A為9種花椒各類別揮發(fā)性物質成分堆積圖;B為9種花椒揮發(fā)性成分類別及相對含量。

如圖1B所示,9種花椒各種物質相對含量差異明顯,ZBM1中醇類、脂類相對含量最高(51.22%和26.62%),烴類物質次之(20.07%),醛酮類及其他物質均不足1.5%。其余花椒品種均以烴類、醇類物質相對含量最高(26.22%～56.96%和36.06%～58.63%),酯類物質次之(2.82%～18.03%),醛酮類物質較少(0.16%～3.04%),其他類物質相對含量最低,小于1.5%。結合表2、表3可知,9種花椒相對含量較高的揮發(fā)性成分主要有括D-檸檬烯、大根香葉烯-D、芳樟醇、β-月桂烯等單萜類化合物和乙酸芳樟酯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇乙酸酯、乙酸松油酯等。通過查閱相關文獻可知[16-17],花椒中香氣活性物質主要有提供植物、柑橘、檸檬等香氣的萜烯類氧化物,提供甜香、果香的脂類化合物以及提供椒麻味、典型胡椒香氣的胡椒酮、芳樟醇類化合物等。鑒于9種花椒烴類、醇類及脂類之間種類數(shù)量及含量差異,說明9種花椒間的香氣存在差異[18],這與陳光靜等[19]的研究結果相似。

表2 9種花椒共有揮發(fā)性成分及其相對含量

表3 9種花椒非共有揮發(fā)性主要成分及其相對含量

2.1.19種花椒共有揮發(fā)性成分分析

如表2所示,9種花椒中包含26種共有揮發(fā)性成分,主要為崖柏烯(1.85%～4.99%)、β-月桂烯(3.18%～7.08%)、α-水芹烯(0.57%～2.12%)、4-蒈烯(0.64%～2.71%)、3,6,6-三甲基-2-降蒎烯(1.69%～4.46%)、γ-松油烯(1.27%～6.55%)、α-蒎烯(0.03%～0.36%)、β-蒎烯(0.02%～0.11%)、大根香葉烯-D(1.02%～6.04%)、Δ-杜松烯(0.23%～2.55%)、Α-杜松烯(0.02%～0.28%)在內的11種烴類物質;桉葉油醇(3.85%～9.00%)、芳樟醇(0.03%～35.10%)、反式-4-側柏醇(0.14%～37.07%)、4-萜品醇(1.12%～5.74%)、異胡薄荷醇(0.02%～0.08%)、T-杜松醇(0.26%～0.82%)在內的6種醇類;乙酸異戊酯(0.05%～0.12%)、Δ-乙酸松油醇酯(0.07%～0.73%)、乙酸桃金娘烯酯(0.05%～0.31%)、乙酸松油酯(1.36%～12.81%)、乙酸橙花酯(0.02%～0.26%)、棕櫚酸甲酯(0.02%～0.04%)等在內的7種酯類;以及2-乙基呋喃(0.18%～0.82%)和石竹素(0.02%～0.13%)兩種其他成分;這與孟佳敏等[20]關于花椒風味物質的研究結果相比,主要揮發(fā)性成分種類相對一致,但其相對含量具有一定差異。

鑒定出的26種共有成分占各花椒揮發(fā)油總含量的63.46%～85.81%,其中主要共有成分(相對含量>1%) 相對含量相差較大。如表2和圖2所示,26種共有揮發(fā)性成分主要為醇類和烴類物質,分別占31.51%～53.17%和14.39%～25.81%;烴類物質當中萜烯類物質占比較大,為12.64%～21.18%。9種花椒檢測出的主要共有成分有崖柏烯、β-月桂烯、桉葉油醇、3,6,6-三甲基-2-降蒎烯、γ-松油烯、芳樟醇、反式-4-側柏醇、乙酸松油酯、大根香葉烯-D、Δ-杜松烯等。

圖2 9種花椒共有揮發(fā)性成分類別及相對含量

這些主要共有成分在9種花椒中相對含量均比較高,差異較為明顯,且香氣閥值較低,大部分為花椒中重要的香味物質[21]。如芳樟醇香氣閥值為10 bpm,具有濃厚的柑橘香、玫瑰木香、鈴蘭與玫瑰的花香[22];β-月桂烯香氣閥值為13～15 bpm,具有清淡的香脂香氣[23];桉葉油醇具有草藥、松油、樟腦的氣息[24];乙酸松油脂具有一定的木香和花香;反式-4-側柏醇和大根香葉烯-D具有強烈的膏香、木清香[25];崖柏烯具有藥草青香[26];4-萜品醇則賦予品種花香及菠蘿香、梨香等果香[27]。9種花椒中ZBM1和ZBM2中的共有揮發(fā)性成分含量類似,均以芳樟醇含量最高(35.10%和26.40%),桉葉油醇(8.68%和6.94%)、β-月桂烯(3.53%和6.82%)和崖柏烯(2.61%和3.71%)含量次之,其他成分相對較少,因此,這兩種花椒的香氣以濃厚的柑橘香、玫瑰木香為主,輔雜著少量的草藥、松油香脂的氣息。但ZBM1中含有4.03%的4-萜品醇,故還有淡淡的果香味。ZBM3～ZBM6、ZBM8和ZBM9中反式-4-側柏醇含量最高,分別為37.07%,18.69%,35.19%,18.27%,22.45%,21.52%,其次為芳樟醇、桉葉油醇、β-月桂烯、崖柏烯和乙酸松油脂,相對含量均為3%～10%,其他成分含量相對較低,故這6種花椒以強烈的膏香、木清香為主,輔雜著一些柑橘香、花香及草藥香,但ZBM6、ZBM9中分別有3.97%和5.74%的4-萜品醇,故帶有一絲果香。ZBM7中共有揮發(fā)性成分相對含量最高的為反式-4-側柏醇(27.4%)、乙酸松油脂(12.81%),其次為桉葉油醇(9.0%)和大根香葉烯-D(6.04%),但其幾乎不含芳樟醇(0.03%),故其仍以膏香、木清香和花香為主,輔雜著少量的草藥香、松油香。這些共有化合物在9種花椒中的含量差異是造成不同花椒香氣差異的主要原因。

2.1.29種花椒非共有揮發(fā)性物質成分及含量分析

鑒定出的111種非共有成分主要為烴類、醇類、酯、醛酮類,這些非共有成分數(shù)量占比高于共有揮發(fā)性成分,但其相對含量基本低于共有揮發(fā)性成分。

如圖3A所示,9種花椒非共有揮發(fā)性成分中烴類、醇類、酯、醛酮類物質數(shù)量規(guī)律和共有成分類似,烴及其衍生物數(shù)量最多,其次是醇類、醛酮類和脂類,其他物質數(shù)量最少。由圖3B可知,9種花椒非共有揮發(fā)性成分相對含量有所差異,ZBM2～ZBM5、ZBM7中,以烴類相對含量最高(5.78%～38.28%),醇類、脂類物質次之(2.28%～7.64%和0.38%～3.53%),醛酮類及其他物質均不足1.5%;ZBM1以脂類非共有揮發(fā)性成分最高(24.86%),烴類、醇類物質次之(5.68%和2.56%),醛酮類及其他物質不足1.5%;ZBM8和ZBM9以烴類物質相對含量對多,脂類物質次之,醇類物質較少,醛酮類及其他類物質均不足1.5%。而醇類物質的香氣多為花香、醇香,烴類物質所散發(fā)的香氣多為松節(jié)油香和木香,脂類物質則以濃郁的奶油/奶酪香氣為主[28],這進一步說明9種花椒的香氣存在差異。

注:A為9種花椒各類別揮發(fā)性物質成分堆積圖;B為9種花椒揮發(fā)性成分類別及相對含量。

如表3所示為110種非共有揮發(fā)成分中相對含量大于1.5%的物質(其中1種花椒的相對含量大于1.5%即統(tǒng)計)。由表3可知,9種花椒的非共有揮發(fā)性主要物質有D-檸檬烯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇乙酸酯、乙酸芳樟酯、α-松油醇、L-α-松油醇、羅勒烯和胡椒酮等,且這些物質的相對含量在9種花椒間有所差異,且香氣閥值較低。如D-檸檬烯香氣閥值為10 bpm,具有橙皮香味,羅勒烯具有花草香和橙花油的氣息,胡椒酮具有類似薄荷和樟腦的香氣[29]。D-檸檬烯在ZBM2中相對含量為32.54%,在ZBM4、ZBM6、ZBM8中含量分別為13.69%,18.08%和15.89%,在其他幾種花椒中沒有檢測出;1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇乙酸酯僅在ZBM1、ZBM3中檢測出,ZBM1中的相對含量遠大于ZBM3(23.22%>0.09%),羅勒烯和胡椒酮分別僅在ZBM3和ZBM6中檢測出,其含量分別為2.61%和2.39%。因此,9種花椒除共有揮發(fā)性成分所散發(fā)的香氣外,ZBM4、ZBM6和ZBM8也具有較為濃烈的橙香味,ZBM2則橙香味更濃;ZBM6中也帶有一絲少量的薄荷香氣。另外,在9花椒品種中還存在許多相對含量小于1.5%的非共有揮發(fā)性成分,如僅在ZBM1和ZBM9中檢測到的對薄荷-1,3,8-三烯和僅在ZBM1和ZBM2花椒樣品中檢測到的順式橙花醇等,這些不同品種花椒的特有成分也可能是造成它們氣味差異的原因。

2.2 聚類分析

將9種花椒共有揮發(fā)性成分相對含量作為變量,采用系統(tǒng)聚類對9種花椒樣品進行聚類分析。結果見圖4,可將9種花椒聚為3組,ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8聚為一組,ZBM1和ZBM2聚為一組,ZBM6和ZBM9聚為一組。

圖4 基于共有揮發(fā)性成分的9種花椒系統(tǒng)聚類分析

在ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8一組中檢出的揮發(fā)性物質相對含量在1%以上的平均有11種,烴類最多,均在20%左右;其次是醇類,值得注意的是,其中反式-4-側柏醇含量均為最高,分別為37.07%,18.69%,35.19%,27.40%和22.45%,因此這5種花椒可歸為一類。ZBM1和ZBM2一組的相對含量在1%以上的揮發(fā)性物質均為10種,其中芳樟醇含量均為最高,分別為35.10%和26.4%;桉葉油醇含量次之,分別為8.68%和6.94%。說明這兩種花椒揮發(fā)性物質成分具有較高的相似性,且物質相對含量差異較小。ZBM6和ZBM9一組的相對含量在1%以上的揮發(fā)性物質均為10種,各類揮發(fā)性物質含量非常相近,其中含量最高的均為反式-4-側柏醇,分別是18.27%和21.52%。這些結果表明,系統(tǒng)聚類分析能夠將這9種不同花椒品種很好的區(qū)分并且歸類,組內揮發(fā)性物質成分相似度較高,組間有較明顯的差異。

2.3 主成分分析

通過對9種花椒的關鍵風味化合物進行主成分分析,得出不同產(chǎn)地花椒關鍵風味化合物的主成分分析(圖5),得分圖和載荷圖反映了關鍵風味化合物對主成分的影響程度大小,確定了9種花椒的主要風味物質特征。由圖5A可知,9種不同產(chǎn)地花椒仍然可以有效區(qū)分為三組,其中ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8聚為一組,ZBM1和ZBM2聚為一組,ZBM6和ZBM9聚為一組,與上述聚類分析結果一致。從坐標看,樣品間越接近說明他們之間的氣味越相近,揮發(fā)性成分越相同,反之說明氣味差異越大[30]。由此看出這9個品種花椒組內香氣特征相似度較高,組間各個花椒有較明顯的差異。綜合聚類分析與主成分分析的結果來看,四川、貴州及重慶的這幾種花椒揮發(fā)性成分類別及相對含量基本相似,且西南地區(qū)的氣候環(huán)境等因素也較為相同,因此這幾個地方的花椒易于相互引種栽培,并開展良種選育等相關研究,而陜西等西北地區(qū)的花椒品種則與西南地區(qū)的這幾種花椒區(qū)別較大,可能不適宜在西南地區(qū)種植。

注:A為得分圖;B為載荷圖。圖B中1～137表示9種花椒檢測出的137種揮發(fā)性成分。

如圖5B所示,2個主成分因子PC1(25.2%) 和PC2(46.8%) 的累積貢獻率達到72%,說明可以用2個因子代替原來的數(shù)據(jù)來評價9個不同產(chǎn)地花椒的香氣品質。PC1中載荷值正向較高的成分序號為32((1R,3R,4R,5S)-1-異丙基-4-甲基雙環(huán)[3.1.0]己烷-3-乙酸乙酯)、28 ((Z)-胡椒醇),它們的載荷值分別是0.135和0.137;負向較高的是37(2-氧雜環(huán)[2.2.2]辛烷-6-醇,1,3,3-三甲基,乙酸酯)和104 (8-乙酰氧香芹艾菊酮),它們的載荷值分別是-0.162和-0.157;PC2中載荷值正向較高的分別是序號為40 (α-蒎烯)、58 (Δ-杜松烯),它們的載荷值分別是0.179和0.178;負向較高的是20 (α-側柏酮)、49 (順式橙花醇),它們的載荷值分別為-0.129和-0.125?；衔镞h離坐標軸原點表明這個化合物對主成分有強烈的影響,說明這些物質對這9種花椒整體香氣貢獻度相對較大。綜合第1主成分和第2主成分,如圖5B所示,從兩個主成分方向上的坐標位置來看,序號為19 (芳樟醇)、22 (反式-4-側柏醇)、32((1R,3R,4R,5S)-1-異丙基-4-甲基雙環(huán)[3.1.0]己烷-3-乙酸乙酯)、38 (乙酸松油酯)、102 (大根香葉烯B)這5種物質在第1主成分和第2主成分的特征向量絕對值較其他物質高,整體香氣貢獻度大。值得注意的是,其中芳樟醇、反式-4-側柏醇、乙酸松油酯這3種物質含量在9種花椒樣品中總體占比較大,為9種花椒香氣特征的形成提供物質基礎;同時,這幾種物質的含量也存在差異,ZBM1、ZBM2中芳樟醇含量最高,達35.1%、26.4%,但反式-4-側柏醇的含量卻很低,均小于1%。ZBM3-ZBM9的芳樟醇含量較低,但反式-4-側柏醇含量均在10%以上,其中ZBM3最高為37.07%。ZBM5和ZBM7中乙酸松油酯的含量則最高,分別是9.67%和12.8%。

這些具有不同特征香氣的物質不僅共同構成了不同產(chǎn)地花椒的主體香氣,還可能是區(qū)分不同產(chǎn)地花椒的關鍵化合物。ZBM1和ZBM2的芳樟醇含量遠遠高于其他幾種花椒,說明ZBM1和ZBM2在多種揮發(fā)性香氣物質形成的復合香氣特征中表現(xiàn)出具有突出的柑橘香,玫瑰木鄉(xiāng)香,區(qū)別于其他花椒;ZBM3-ZBM9乙酸松油酯含量高于ZBM1和ZBM2,木香和花香、膏香較為突出;其中ZBM6和ZBM9的芳樟醇含量高于另外5種花椒,僅次于ZBM1和ZBM2,說明這2種花椒除了具有較為突出的木香和花香,柑橘香和甜香味也比較濃郁。同時,除了這些香氣貢獻度較大的成分,其余揮發(fā)性香氣物質為花椒的整體香氣也起到一定的輔助作用。

3 結論與討論

本研究通過氣質聯(lián)用分析對9種花椒的揮發(fā)性成分進行了分析,共鑒定出137種揮發(fā)性成分,其中,烴類55種、醇類36種、酯類21種、醛7種、酮類10種及其他8種。9種花椒品種內的揮發(fā)性成分數(shù)量有所差異,ZBM9中檢測出的揮發(fā)性成分種類最多,ZBM5和ZBM6次之,ZBM2最少。在9種花椒揮發(fā)性成分中,以烴類及其衍生物種類最多,醇類以及酯類物質種類占比次之;醛類、酮類和其他類物質較少。9種花椒共存在26種共有成分,其相對含量差異較大。在ZBM1和ZBM2共有揮發(fā)性成分中,芳樟醇相對含量最高,呈濃厚的柑橘香、玫瑰木香;ZBM3～ZBM6、ZBM8和ZBM8中反式-4-側柏醇相對含量最高,呈強烈的膏香、花香及木香;ZBM7中以反式-4-側柏醇、乙酸松油脂含量最高,呈膏香及花木香。9種花椒非共有成分有111種,主要成分有D-檸檬烯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇乙酸酯、乙酸芳樟酯、松油醇、羅勒烯和胡椒酮等。除共有揮發(fā)性成分所散發(fā)的香氣外,ZBM4、ZBM6和ZBM8中由于含有較多的D-檸檬烯,所以具有較為濃烈的橙香;ZBM6中由于含有少量的胡椒酮,所以帶有一絲薄荷香氣。另外,在9花椒品種中還存在許多相對含量小于1.5%的非共有揮發(fā)性成分,這些特有成分也對花椒的香氣產(chǎn)生影響。聚類分析和主成分分析結果顯示,ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8聚為一組,ZBM1、ZBM2聚為一組,ZBM6和ZBM9聚為一組,ZBM1、ZBM2的復合香氣特征中以突出的柑橘香,甜香,區(qū)別于其他花椒;ZBM3-ZBM9乙酸松油酯含量高于ZBM1和ZBM2,木香、花香和膏香較為突出;其中ZBM6和ZBM9的芳樟醇含量高于另外5種花椒,僅次于ZBM1和ZBM2,說明這兩種花椒除了具有較為突出的木香和花香,柑橘香和甜香味也比較濃郁,這與GC-MS分析結果基本一致。主成分分析也進一步證實,芳樟醇、反式-4-側柏醇、(1R,3R,4R,5S)-1-異丙基-4-甲基雙環(huán)[3.1.0]己烷-3-乙酸乙酯、乙酸松油酯、大根香葉烯香氣貢獻相對較大,特別是芳樟醇、反式-4-側柏醇、乙酸松油酯,其相對含量在九種花椒中有較大差異,這些揮發(fā)性物質能夠用于區(qū)分這9種花椒。本研究中9種花椒具有由多種揮發(fā)性香氣物質形成的復合香氣特征,這些具有不同香味的揮發(fā)性香氣物質共同構成了花椒的主體香氣,同時一些含量差異明顯且香味特征突出的成分還可能是區(qū)分不同產(chǎn)地花椒的關鍵化合物,為區(qū)分不同品種花椒奠定基礎。