鏡鯉體質(zhì)量、體長(zhǎng)、體高和體厚的QTL 定位分析

張曉峰，欒培賢，戶國(guó)，李超，魯翠云，曹頂臣

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚(yú)類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

水產(chǎn)品是人類的重要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，特別是在食物缺乏的國(guó)家和地區(qū)[1,2]。持續(xù)改良和提高水產(chǎn)品的產(chǎn)量性狀,滿足人們不斷增長(zhǎng)的對(duì)水產(chǎn)品的需求,一直是水產(chǎn)育種者面臨的長(zhǎng)期挑戰(zhàn)之一[3,4]。作為全球最重要的養(yǎng)殖魚(yú)類之一，鯉（Cyprinus carpio）在全球100 多個(gè)國(guó)家養(yǎng)殖，全球年產(chǎn)量超過(guò)400 萬(wàn)公噸（http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en）。鑒于鯉對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要性，在過(guò)去幾十年中，開(kāi)發(fā)了各種基因組資源和遺傳工具，以促進(jìn)鯉遺傳改良和育種計(jì)劃[5-10]。鯉育種方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的選擇發(fā)展到現(xiàn)代生物技術(shù)，如標(biāo)記輔助選擇（MAS）和分子育種等[11-13]。

魚(yú)類多數(shù)經(jīng)濟(jì)性狀都為數(shù)量性狀，如生長(zhǎng)、抗病性、性別和肌肉品質(zhì)等，由多個(gè)基因控制，稱為數(shù)量性狀座位（quantitative trait locus，QTL）[14-16]。這些性狀的表型變異被認(rèn)為是由多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）等位基因分離產(chǎn)生的數(shù)量遺傳變異引起。通過(guò)傳統(tǒng)常規(guī)選育費(fèi)時(shí)費(fèi)力，分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection,MAS）可以利用分子標(biāo)記直接選擇基因型，使得優(yōu)勢(shì)基因型快速富集，提高目標(biāo)性狀的改良效率。MAS 的實(shí)施需要通過(guò)QTL定位或關(guān)聯(lián)分析獲得與感興趣的性狀緊密連鎖的DNA 標(biāo)記[17,18]。QTL 定位的目的是了解決定性狀的基因的數(shù)量和作用，并協(xié)助育種選擇，以加速重要性狀的遺傳改良[19]。

生長(zhǎng)性狀作為鯉的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，揭示其性狀復(fù)雜的分子機(jī)制并挖掘影響該性狀的重要功能基因,可以為鯉生長(zhǎng)性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)隨著鯉基因組資源的快速開(kāi)發(fā)利用，鯉重要性狀相關(guān)QTL 定位分析已開(kāi)展了很多研究。例如生長(zhǎng)[20-25]、抗性[5,26]、肌肉品質(zhì)[16,27]和飼料轉(zhuǎn)化率[28,29]等，大大促進(jìn)了鯉分子標(biāo)記輔助選擇和分子育種進(jìn)程。尤其是，不同品種和家系鯉生長(zhǎng)相關(guān)QTL 定位分析取得了很多研究結(jié)果。雖然關(guān)于鏡鯉生長(zhǎng)相關(guān)性狀的QTL 已有多篇報(bào)道，但由于作圖群體的樣本量和使用的標(biāo)記數(shù)量相對(duì)較少，并不是所有性狀相關(guān)的DNA 變異完全被捕獲。因此，亟需構(gòu)建高密度相對(duì)較高的遺傳連鎖圖譜，以利于QTL 精細(xì)定位和候選基因的篩選。

本研究擬對(duì)鏡鯉F1家系進(jìn)行SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）測(cè)序，利用SNP 標(biāo)記構(gòu)建鯉高密度遺傳連鎖圖譜。利用該高密度圖譜對(duì)鏡鯉主要生長(zhǎng)性狀進(jìn)行QTL 精準(zhǔn)定位，挖掘與這些性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及候選基因，為鯉MAS 育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用鏡鯉采自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。F0（祖父母本）為早期由國(guó)家原種和良種審定委員會(huì)鑒定為良種的德國(guó)鏡鯉選育系的后代，經(jīng)微衛(wèi)星分子標(biāo)記檢測(cè)親本間的遺傳距離，選取遺傳距離大的一對(duì)親本構(gòu)建F1家系，池塘養(yǎng)殖6 個(gè)月后，隨機(jī)選取200 尾子代個(gè)體，測(cè)量表型性狀。

1.2 方法

表型性狀的測(cè)量：根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《養(yǎng)殖魚(yú)類種質(zhì)檢驗(yàn)》（GB/T 18654.3-2008），測(cè)量了研究群體的體質(zhì)量（BW）、體長(zhǎng)（SL）、體高（H）和體厚（TH）4 個(gè)性狀，獲取試驗(yàn)群體生長(zhǎng)性狀表型值。利用SPASS 19.0 對(duì)性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析和正態(tài)分布檢驗(yàn)。

基因型分析：表型值測(cè)量結(jié)束將實(shí)驗(yàn)魚(yú)麻醉，尾靜脈抽血0.5 mL。采用QIAampDNA Blood Midi Kit 血液提取試劑盒，參照標(biāo)準(zhǔn)流程提取血液樣本的DNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，利用NanoDrop-1000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA 濃度，檢測(cè)合格的DNA 樣本置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ邪龠~克生物有限公司，利用Illumina HiseqTM 平臺(tái)進(jìn)行SLAF-seq 和SNP 標(biāo)記的鑒定分型。

遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL 定位：選擇符合孟德?tīng)栠z傳的多態(tài)性SNP 標(biāo)記用于進(jìn)一步的連鎖分析。連鎖分析采用雙偽測(cè)交策略（CP）。根據(jù)分離模式將SNP 分為三類：ABxAA 或ABxBB（僅在母本中1∶1 分離）、AAxAB 或BBxAB（僅在父本中1∶1 分離）和ABxAB（雙親中1∶2∶1 分離）。利用Join-Map 4.0 軟件構(gòu)建鏡鯉高密度遺傳圖譜[30]。分析模型為CP（cross pollinators），作圖函數(shù)為Kosambi 函數(shù)。以極大似然法構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，LOD 值設(shè)置為6.0；采用Kosambi 函數(shù)計(jì)算標(biāo)記間的遺傳距離（cM）。圖譜繪制軟件為MapChart 2.2[32]。

用MapQTL5.0[31]軟件包中區(qū)間作圖（interval mapping，IM）對(duì)四個(gè)生長(zhǎng)性狀進(jìn)行QTL 定位分析，取LOD 閾值為2.5。通過(guò)逐步回歸（stepwise regression）估計(jì)表型方差（PVE）。QTL 最近的SNP 標(biāo)記附近的生長(zhǎng)基因做為候選基因，注釋基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀的統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS19.0 對(duì)生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，計(jì)算了性狀的平均值、偏度、峰度、最小值、最大值和P 值（表1）。表1 表明，體質(zhì)量測(cè)量值介于88.90～273.30 g，平均（162.84±42.71）g；體長(zhǎng)測(cè)量值介于11.73～17.90 cm，平均為（15.91±1.32）cm；體高測(cè)量值介于5.58～8.32 cm，平均為（6.83±0.66）cm；體厚測(cè)量值介于2.94～4.59 cm，均值為（3.51±0.33）cm。根據(jù)Shapiro-Wilk 正態(tài)分布檢驗(yàn)的顯著性閾值，四個(gè)性狀P 值均大于0.05，符合正態(tài)分布（圖1）。

圖1 體質(zhì)量、體長(zhǎng)、體高和體厚性狀的正態(tài)分布Fig.1 The normal distribution of body weight（BW）（a）,body length（SL）（b）,body depth（H）（c）and body thickness（TH）（d）

表1 4 種性狀表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及正態(tài)分布檢驗(yàn)Tab.1 Descriptive statistics of phenotypic data of growth-related traits.

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

SNPs 標(biāo)記基因分型數(shù)據(jù)由百邁克生物有限公司自主開(kāi)發(fā)的軟件進(jìn)行處理分析，剔除低質(zhì)量的基因分型和不符合孟德?tīng)枠?biāo)記后，剩余4 026 個(gè)均勻分布鯉基因組的高質(zhì)量的多態(tài)性SNPs 標(biāo)記用于鏡鯉遺傳連鎖構(gòu)建圖譜。為提高構(gòu)建圖譜的準(zhǔn)確性，將個(gè)體基因型缺失20%以上的個(gè)體剔除，剩余107個(gè)子代用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。用JoinMap4.0 軟件的“CP”作圖模型對(duì)這4 026 個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，共得到50 個(gè)連鎖群，最終構(gòu)建的圖譜包含3 903 個(gè)SNP 標(biāo)記，圖譜總長(zhǎng)度為3 923.31 cM，全基因組覆蓋度97.26%，每個(gè)連鎖群有78.06.1 個(gè)標(biāo)記，連鎖群長(zhǎng)度范圍為40.83～120.01 cM，標(biāo)記間平均距離為0.998 cM。

2.3 生長(zhǎng)性狀的QTL 定位

采用MapQTL5.0 軟件的區(qū)間定位作圖，取LOD值2.5 做為閾值，共檢測(cè)到29 個(gè)與鏡鯉生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTLs，分別定位到11 個(gè)連鎖群（LG3、LG5、LG6、LG7、LG12、LG16、LG30、LG38、LG44、LG46 和LG47）上，LOD 值介于2.50～4.09 之間，解釋表型變異介于9.0%～24.2%之間（表2、圖2）。其中，與體質(zhì)量相關(guān)的QTLs 最多，為20 個(gè)，其次為體高和體厚性狀，均為15 個(gè)，體長(zhǎng)最少，為11 個(gè)。從連鎖群分布看，LG5、LG6 和LG38 連鎖群最多，均為6 個(gè)QTL區(qū)間。其次是LG30 和LG12，分別為3 個(gè)和2 個(gè)，其余6 個(gè)連鎖群（LG3、LG7、LG16、LG44、LG46 和LG47）均含有1 個(gè)QTL 區(qū)間。本研究中的29 個(gè)生長(zhǎng)性狀QTLs 中，3 個(gè)QTLs（QTL6_5、QTL6_6 和QTL44_1）的單個(gè)QTL 解釋表型變異率大于20%，為生長(zhǎng)性狀的主效QTL 區(qū)間。解釋表型變異最大的為QTL6_5，分別解釋體質(zhì)量和體長(zhǎng)性狀表型變異的24.2%和24.1%。

圖2 QTLs 在聯(lián)鎖群中的分布Fig.2 QTL mapping of growth-related traits distribution in linkage groups

本研究共檢測(cè)到17 個(gè)QTL 區(qū)間在不同生長(zhǎng)性狀間共享，其中與4 個(gè)性狀都相關(guān)的QTL 區(qū)間3個(gè)，分別為QTL5_3、QTL6_2 和QTL38_4。4 個(gè)性狀解釋表型變異9.1%～13.7%；12.0%～13.3%；和10.6%～16.3%。與3 個(gè)性狀相關(guān)的QTL 區(qū)間有9 個(gè)，分別為QTL3_1、QTL5_2、QTL5_4、QTL5_5、QTL6_3、QTL6_6、QTL30_1、QTL38_5 和QTL44_1；與兩個(gè)生長(zhǎng)性狀相關(guān)QTLs 有5 個(gè)，分別為QTL5_6、QTL6_5、QTL12_2、QTL38_1 和QTL38_6；其余12 個(gè)QTLs（QTL5_1、QTL6_1、QTL6_4、QTL7_1、QTL12_1、QTL16_1、QTL30_2、QTL30_3、QTL38_2、QTL38_3、QTL46_1 和QTL47_1）僅與一個(gè)性狀相關(guān)。

2.4 生長(zhǎng)性狀的候選基因鑒定

對(duì)所有與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的29 個(gè)QTL 區(qū)間與鯉全基因組物理圖譜進(jìn)行了比對(duì)分析，在所有QTL 區(qū)間上基因進(jìn)行生長(zhǎng)基因篩選（圖3），結(jié)果在12 個(gè)QTL 區(qū)間篩選到了生長(zhǎng)相關(guān)候選基因（表3），分別為：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 受體（Transforming growth factor beta receptor type I b，tgfbr1b）、生長(zhǎng)因子非依賴性新蛋白（Novel protein similar to growth factor independent，gfi）、生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的TBC 蛋白2（Growth hormone_regulated TBC protein 2，grtp2）、生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的TBC 蛋白1（Growth Hormone Regulated TBC Protein 1，grtp1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 受體3（Transforming growth factor beta receptor 3，tgfb3）、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ受體（Insulin-like growth factor II receptor，igf2r）、含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 樣結(jié)構(gòu)域蛋白（Transforming growth factor beta like domain containing protein，tgfb）、生長(zhǎng)激素受體Ⅱ型（Growth hormone receptor type II，ghr2）、表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白6（Epidermal growth factor like protein 6，egf6）、表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白8（Epidermal growth factor-like protein 8，egf8）、生長(zhǎng)因子受體相關(guān)結(jié)合蛋白2（Growth factor receptor bound protein 2-associated，grb2）和生長(zhǎng)激素受體Ⅰ型（Growth hormone receptor type I，ghr1）等，這些候選功能基因?yàn)殓R鯉生長(zhǎng)相關(guān)的分子機(jī)理研究提供了有價(jià)值的信息。

圖3 QTL 定位及生長(zhǎng)相關(guān)的候選基因分析Fig.3 QTL mapping and association analysis of candidate growth-related genes

表3 四個(gè)生長(zhǎng)性狀候選基因Tab.3 Summary of candidate genes for four growth-related traits

3 討論

在過(guò)去二十年中，魚(yú)類育種方法已從傳統(tǒng)選擇發(fā)展到現(xiàn)代生物技術(shù)，如標(biāo)記輔助選擇（MAS）和分子育種[11]。魚(yú)類最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，大都由多個(gè)被稱為QTL 的基因控制。這些性狀的表型變異是由多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）等位基因分離產(chǎn)生的數(shù)量遺傳變異引起[18]。這些QTL 中的大多數(shù)對(duì)性狀影響較小，但多個(gè)QTL 位點(diǎn)的累加效應(yīng)可能對(duì)性狀產(chǎn)生重大影響。如果識(shí)別出與感興趣的性狀相關(guān)的基因和遺傳標(biāo)記，遺傳變異可作為MAS 分析的工具[33]。

高質(zhì)量的遺傳圖譜是進(jìn)行高效、準(zhǔn)確定位QTL分析所必需的至關(guān)重要的工具。然而，傳統(tǒng)標(biāo)記數(shù)量有限，難以覆蓋整個(gè)基因組[34]。隨著高通量測(cè)序成本的降低，利用高通量測(cè)序可快速、批量地開(kāi)發(fā)SNP 標(biāo)記，構(gòu)建高密度遺傳圖譜，為后續(xù)經(jīng)濟(jì)性狀QTL 精準(zhǔn)定位提供重要工具。SNP 標(biāo)記是基因組中最豐富的多態(tài)性標(biāo)記，非常適合構(gòu)建高密度連鎖圖譜。本研究利用SLAF-seq 高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)鏡鯉F1全同胞家系進(jìn)行高通量測(cè)序，構(gòu)建了鏡鯉含有3 903 個(gè)SNP 標(biāo)記的高密度遺傳連鎖圖譜，圖譜平均標(biāo)記間隔0.998 cM，較之前用于鏡鯉生長(zhǎng)相關(guān)性狀QTL 定位的圖譜的平均圖距（5.77～16.8 cM）小很多，標(biāo)記數(shù)量也明顯增多[20-23]。

用高密度圖譜對(duì)生長(zhǎng)性狀進(jìn)行QTL 定位，可快速、批量獲得生長(zhǎng)相關(guān)的標(biāo)記和基因。本研究利用新構(gòu)建的高密度連鎖圖譜對(duì)6 月齡鏡鯉四個(gè)生長(zhǎng)性狀進(jìn)行QTL 精準(zhǔn)定位，共檢測(cè)到29 個(gè)QTLs 與鏡鯉幼魚(yú)生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。這些QTLs 多數(shù)（18 個(gè)）呈簇狀分布于第5、6 和38 連鎖群上，少數(shù)（11 個(gè)）位 于LG3、LG7、LG12、LG16、LG30、LG44、LG46 和LG47 上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，鏡鯉幼魚(yú)體質(zhì)量相關(guān)的20 個(gè)QTLs 中有17 個(gè)均不同程度與其他4 個(gè)性狀中至少1 個(gè)生長(zhǎng)性狀QTL 位點(diǎn)一致。與本研究中的4 個(gè)生長(zhǎng)性狀均共享的QTLs 有3 個(gè)，分別為QTL5_3、QTL6_2 和QTL38_4，說(shuō)明生長(zhǎng)性狀之間存在高度的相關(guān)性，這與其表型數(shù)據(jù)相關(guān)性結(jié)果一致。在獲得的29 個(gè)鯉長(zhǎng)相關(guān)的QTLs 中，絕大多數(shù)單個(gè)QTL 對(duì)性狀的貢獻(xiàn)率在10%以上，3 個(gè)QTLs（QTL6_5、QTL6_6 和QTL44_1）的單個(gè)QTL 解釋表型變異率大于20%，為生長(zhǎng)性狀的主效QTL 區(qū)間。其中，解釋表型變異最大的為QTL6_5，分別解釋體質(zhì)量和體長(zhǎng)性狀表型變異的24.2%和24.1%。

為了獲得生長(zhǎng)相關(guān)的候選基因，本研究比對(duì)29個(gè)QTL 區(qū)間對(duì)應(yīng)的鯉全基因組序列，篩選了12 個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)的候選基因。包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 受體tgfbr、生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的TBC 蛋白grtp、胰島素樣生長(zhǎng)因子igf2r 和生長(zhǎng)激素受體ghr 等。這些基因的功能涉及脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞增殖和分化等[35-38]，其基因參與魚(yú)體生長(zhǎng)的具體生理生化即代謝過(guò)程還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究采用的6 月齡早期階段的鏡鯉家系檢測(cè)和估計(jì)了QTL 效應(yīng)，對(duì)后期和收獲產(chǎn)量存在高度的遺傳相關(guān)性，幼魚(yú)早期生長(zhǎng)速度也會(huì)影響最終的收獲質(zhì)量[39,40]。這些研究結(jié)果暗示，本研究獲得的生長(zhǎng)相關(guān)的QTLs，可在早期實(shí)施對(duì)該性狀的遺傳改良，縮短選育周期。