水生動物致病菌sRNA 研究進展

王荃生，劉蘇，王朵，胡永華

（1.河北農(nóng)業(yè)大學海洋學院，河北 秦皇島 066000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

細菌中的sRNA（small RNA）是一類長度在40～500 nt（Nucleotide）的非編碼的起調(diào)控作用的小分子RNA，主要通過與靶mRNA 或靶蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮生物學功能，是基因表達的重要調(diào)控因子[1]。研究表明，大部分sRNA 需要依靠分子伴侶蛋白才能有效地發(fā)揮其調(diào)控作用[2]。病原菌在與其宿主長時間的互作過程中，產(chǎn)生了能感知宿主信號變化的調(diào)節(jié)基因。當宿主環(huán)境改變且釋放相關信號因子時，相應的病原菌sRNA 會即刻調(diào)控相關基因的表達，以抵抗宿主環(huán)境因子的脅迫。目前已發(fā)現(xiàn)多種在細菌毒力調(diào)控中起重要作用的sRNA。這些sRNA 通常只需要經(jīng)轉(zhuǎn)錄過程就能發(fā)揮作用，大大減少細胞代謝的各種消耗，使其快速適應新的環(huán)境[3]。在與人類密切相關的致病菌中，如大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和沙門氏菌（Salmonella）等，sRNA 的研究較為深入，其研究結(jié)果極大促進了病原菌致病機制的闡析[4-9]。

相比于人類致病菌，水生動物致病菌所處環(huán)境特殊性，導致包括sRNA 在內(nèi)的許多基因功能出現(xiàn)明顯差異。在溶藻弧菌中，sRNA srvg23535 參與該病原菌對碳源和氮源的利用、對滲透壓的耐受性和pH 脅迫反應[10]；sRNA srvg17985 參與該病原菌對Gly-Glu 碳源的利用、對NaCl 的耐受性、對尿素的耐受性和堿脅迫反應[11]；sRNA Qrr 參與該病原菌的生長能力、運動性、形成生物膜能力、細胞外多糖含量、產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶的能力和對宿主的侵染能力等[12]。在殺魚愛德華氏菌中，sR082 與該病原菌抵御酸脅迫相關，sR012 與氧化壓力密切相關，而EsR240 與酸脅迫和氧化壓力都有關相關[13-15]。在無乳鏈球菌中，SQ18、SQ485 和SQ893 三個sRNA 調(diào)控相鄰基因的表達，并且SQ18 asRNA 通過反義機制下調(diào)Sip 基因的表達[16]。目前，水生動物致病菌sRNA 的研究起步較晚，其功能和機制仍亟待闡明。

本文概述了sRNA 的調(diào)控機制及其在水生動物致病菌如溶藻弧菌、殺魚愛德華氏菌、無乳鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、維氏氣單胞菌、副溶血性弧菌中的研究進展。

1 sRNA 調(diào)控基因表達的機制

隨著對sRNA 調(diào)控細菌基因表達機制研究的深入，人們對sRNA 在細菌生命活動中扮演的角色有了更深刻、更多元化的認識。以下是目前比較清晰的sRNA 調(diào)控機制。

1.1 sRNA 與靶mRNA 堿基配對調(diào)控目的基因表達

細菌sRNA 通過堿基配對與靶mRNA 的編碼區(qū)或非翻譯區(qū)結(jié)合，這是sRNA 調(diào)控基因表達的主要方式，主要影響靶mRNA 的翻譯或（和）穩(wěn)定性產(chǎn)生，促進或降低mRNA 的翻譯和降解。

1.1.1 順式編碼的sRNA

順式編碼的sRNA，亦稱反義RNA，通常是由其所調(diào)控靶標基因的互補鏈轉(zhuǎn)錄而來，位于與其所調(diào)控的mRNA 互補的位置上，且編碼在相反的鏈上，二者的堿基完全互補配對[17]。順式編碼的sRNA 主要分布在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子中[18]，可與靶標mRNA 完全互補配對調(diào)控目標基因的表達，該類sRNA 調(diào)控的基因大都與細菌毒力有關，例如大腸桿菌中的gadXW 操縱子受順式編碼sRNA 的調(diào)節(jié)[19]。

1.1.2 反式編碼的sRNA

反式編碼的sRNA 從與其靶RNA 基因完全不同的基因組位置轉(zhuǎn)錄而來[18]，與其靶mRNA 的堿基通過不完全互補配對的方式結(jié)合。有限的互補性使得反式編碼的sRNA 能夠與多個mRNA 結(jié)合，這一特征使其能全面地調(diào)控細菌的生理反應[20]。細菌sRNA 多為反式編碼RNA，這類sRNA 發(fā)揮功能通常需要分子伴侶蛋白協(xié)助。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的能在sRNA與mRNA 的結(jié)合中起作用的分子伴侶有Hfq 和ProQ 兩種。目前對Hfq 蛋白介導sRNA 與mRNA 結(jié)合的機制有兩種推測：一種是Hfq 改變了與之結(jié)合的sRNA 的結(jié)構(gòu)，使其暴露出與靶mRNA 配對的序列，縮短了配對所需的時長；另一種是Hfq 增加了該空間某一區(qū)域內(nèi)sRNA 和mRNA 的含量，使它們的結(jié)合幾率增大[21]。最新研究在細菌中檢測出一種新的分子伴侶蛋白ProQ，雖然它與sRNA 結(jié)合并穩(wěn)定sRNA 的分子機制尚未清楚，但已證實能促進sRNA 和所調(diào)控的mRNA 的堿基配對[22]。

1.2 sRNA 與靶蛋白質(zhì)作用從而影響其功能

sRNA 除了以堿基配對的方式發(fā)揮其調(diào)控功能外，能直接與靶蛋白相互作用影響毒力基因的表達。細菌中的6S RNA 能保證細菌各階段生存所需要的營養(yǎng)，降低對外界各種緊張性刺激物引起的細胞生理反應而儲存能量。6S RNA 能通過模擬一個開放的啟動子復合體，將RNA 聚合酶從靶啟動子置換下來，從而調(diào)節(jié)特定基因的表達[23]。例如CsrA蛋白最近被證明與細菌的毒力有關，它的表達受到CsrB 和CsrC 這兩種sRNA 的調(diào)控[24]。

1.3 sRNA 本身具有特殊活性

除上述sRNA 作用機制外，有一類sRNA 本身就具有特殊活性，如4.5S RNA、tmRNA 和M1 RNA等。4.5S RNA 能結(jié)合信號識別顆粒和它的受體共同把蛋白質(zhì)運輸?shù)教囟ǖ膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)或細菌質(zhì)膜，影響蛋白質(zhì)的分泌過程。倘若該基因缺失，將抑制蛋白質(zhì)的合成。tmRNA 在各種細菌中均有發(fā)現(xiàn)，既具有tRNA 的功能，又具有mRNA 的作用[25]。tmRNA 可監(jiān)控細菌蛋白質(zhì)合成的過程和停滯蛋白質(zhì)水解的過程，有助于調(diào)控基因表達的速度和精確度[26]。M1 RNA 具有典型的內(nèi)切酶活性，能夠?qū)RNA 5' 末端進行剪切并形成成熟的tRNA[27]。

2 sRNA 在水生動物致病菌中的研究進展

目前在溶藻弧菌中已被鑒定的sRNA 有750 余個，在殺魚愛德華氏菌中已被鑒定的sRNA 有150余個，在無乳鏈球菌中已被鑒定的sRNA 有197 個，在魯氏耶爾森氏菌中已被鑒定的sRNA 有2 個，在維氏氣單胞菌中已被鑒定的sRNA 有1 個，在副溶血性弧菌中已被鑒定的sRNA 有1 個，已經(jīng)進行研究的sRNA 大都被發(fā)現(xiàn)與細菌抗逆性、運動性和致病性相關，個別sRNA 與細菌對碳源和氮源的利用、細胞外多糖含量和產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶的能力相關，具體內(nèi)容如下。

2.1 溶藻弧菌sRNA

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是革蘭氏陰性病原菌[28]，是一種機會性病原體[29]，可感染、引發(fā)多種水生動物疾病[30]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。Liu 等[31]發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌中sRNA 伴侶Hfq 的缺失導致溶藻弧菌對滲透壓力、高溫和鐵饑餓等環(huán)境壓力更加敏感，運動性和生物膜形成能力消失，毒力基因表達下調(diào)等，表明sRNA 可能與溶藻弧菌的逆境適應及毒力相關。2018 年Deng 等[10]鑒定了溶藻弧菌sRNA srvg23535，發(fā)現(xiàn)srvg23535 保守性高且僅存在于弧菌中；通過構(gòu)建sRNA 的敲除株發(fā)現(xiàn)srvg23535 在碳源和氮源的利用以及滲透壓和pH脅迫反應中發(fā)揮了重要作用。Deng 等[11]發(fā)現(xiàn)sRNA srvg17985 的缺失導致溶藻弧菌對Gly-Glu 碳源的利用減少，對NaCl 耐受性更強，但對尿素的耐受性更弱；在pH=9.5 時sRNA srvg17985 抑制L-絲氨酸的脫氨基作用，促進X-β-d-葡糖苷酸的水解，影響堿脅迫反應。

直到2019 年，溶藻弧菌sRNA 才得到系統(tǒng)性鑒定。Peng 等[32]鑒定了溶藻弧菌中749 個sRNA，其中128 個sRNA 響應氧化應激壓力，相應地有1 870 個基因也響應氧化應激壓力；并發(fā)現(xiàn)這些sRNA 可能調(diào)控與鐵轉(zhuǎn)運、過氧化氫酶、GSH 依賴性防御系統(tǒng)、電子傳遞和應激反應等相關基因的表達。周欣等[33]鑒定了溶藻弧菌5 個細胞密度依賴性sRNA，發(fā)現(xiàn)它們均具有Hfq 結(jié)合位點區(qū)，對群體感應系統(tǒng)核心元件LuxR 和AphA 具有調(diào)控作用；發(fā)現(xiàn)這些sRNA或通過激活周生鞭毛合成蛋白LafK 和LafA 調(diào)控細菌的泳動能力，或作用于極生鞭毛合成相關蛋白FliS 和FlaK 影響游動能力，或調(diào)控生物被膜調(diào)控因子SypG 來影響生物被膜的形成。最近，Liu 等[12]發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，溶藻弧菌sRNA Qrr 突變體的生長能力顯著減弱，運動性減弱，形成生物膜的能力增強，細胞外多糖含量增加，產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶的能力增強，LD50值增大。

2.2 殺魚愛德華氏菌sRNA

殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida），又稱遲緩愛德華氏菌（E.tarda）是一種重要的魚類病原菌，每年給全世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[34]。雖然殺魚愛德華氏菌中的多種毒力因子（或系統(tǒng)）如黏附因子、鐵攝取調(diào)節(jié)因子、抗血清能力、Ⅲ與Ⅵ型分泌系統(tǒng)已被鑒定和闡析[35]，但對sRNA的研究可以從一個新角度揭示殺魚愛德華氏菌復雜的毒力基因調(diào)控網(wǎng)絡。早在2014 年，Hu 等[36]發(fā)現(xiàn)sRNA 分子伴侶Hfq 的缺失下調(diào)了殺魚愛德華氏菌多個毒力基因的表達，降低了細菌的抗逆性和致病性。2017 年，通過生物學信息學分析，Sun 等[37]在殺魚愛德華氏菌中預測了10 個sRNA，其中2 個sRNA 與tmRNA 和GcvB 同源，其余8 個為未報道的sRNA。這些sRNA 預測的靶基因直接或間接與毒力相關，表明sRNA 可能參與了殺魚愛德華氏菌致病性。2018 年，Du 等[38]利用RNA-seq 技術(shù)首次系統(tǒng)鑒定了殺魚愛德華氏菌sRNA，發(fā)現(xiàn)了148 個sRNA，其中129 個為新sRNA。在逆境（酸性、缺鐵和氧化壓力）條件下，103 個sRNA 表達出現(xiàn)差異（DEsRNA），同時1 615 個mRNA 的表達也發(fā)生了顯著變化（DEmRNA）?；贗ntaRNA 預測、DEsRNA與DEmRNA 之間的相關性分析，預測有103 個DEsRNA 調(diào)節(jié)769 個靶mRNA。靶基因的功能分析表明，sRNA 廣泛參與多種生理活動，包括抗逆性和致病性，進一步的感染試驗證實sRNA 參與了E.piscicida 的致病性。靶基因中包含了大量的轉(zhuǎn)錄因子，表明sRNA 很可能與殺魚愛德華氏菌復雜的基因調(diào)控系統(tǒng)有非常密切的關系。這些結(jié)果表明，sRNA 在殺魚愛德華氏菌抗逆性和致病性中起著重要作用。隨后，周海珍等[13，14]通過構(gòu)建sRNA 的缺失突變株，發(fā)現(xiàn)sR082 參與了殺魚愛德華氏菌的耐酸壓力，而sR012 參與了殺魚愛德華氏菌的抗氧化壓力，明確了sR082 和sR012 在細菌感染宿主細胞、侵染組織等致病過程中起重要作用。Gao 等[15]鑒定了3 個sRNA，發(fā)現(xiàn)EsR240 與抗酸性、抗氧化性密切相關，EsR240 缺失突變株顯著降低了殺魚愛德華氏菌對宿主的侵染能力，其LD50升高了近7 倍。這些研究結(jié)果充分表明，sRNA 是殺魚愛德華氏菌的抗逆性和致病性重要的調(diào)節(jié)者。

2.3 其他水生動物致病菌sRNA

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是革蘭氏陽性病原菌[39]，還是一種人獸共患病原菌[40]，能引發(fā)魚類無乳鏈球菌病，該細菌經(jīng)常爆發(fā)已造成嚴重的經(jīng)濟損失。Pichon 等[16]鑒定了無乳鏈球菌中的197 個sRNA/asRNA 基因，并發(fā)現(xiàn)SQ18、SQ485 和SQ893 三個sRNA 對相鄰基因的表達有調(diào)控作用，而SQ18 asRNA 通過反義機制下調(diào)Sip 基因的表達。

魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）是一種革蘭氏陰性桿狀腸桿菌[41]，與許多腸道細菌一樣，它是一種兼性細胞內(nèi)病原體[42]，能引發(fā)腸炎紅嘴病[43]，導致全球鮭魚養(yǎng)殖業(yè)遭受重大經(jīng)濟損失。Acu?a等[44]發(fā)現(xiàn)，RyhB-1 和RyhB-2 兩個sRNA 對該致病菌的胞內(nèi)增殖能力具有調(diào)控作用，還調(diào)節(jié)與鐵穩(wěn)態(tài)、代謝和運動性相關基因的表達。

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是革蘭氏陰性病原菌[45]，一種水生環(huán)境中大量存在的魚-人-畜機會致病[46]，能引起淡水魚敗血癥和潰瘍綜合征[47]。研究發(fā)現(xiàn)，sRNA AvrA 能調(diào)控iscR mRNA 來增加該致病菌的SmpB 突變株對氧化應激的耐受性[48]。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水生革蘭氏陰性病原菌[49]，是一種模式海洋細菌[50]，作為一種機會致病菌導致全球范圍內(nèi)的海產(chǎn)品感染，造成巨大的經(jīng)濟損失[51]。不同于其他細菌中的sRNA Qrr2，副溶血性弧菌中的sRNA Qrr2 獨立于sigma-54 表達，可作為唯一的Qrr sRNA 來控制該菌中的群體感應，進而影響毒力的表達[52]。

3 結(jié)語和展望

近年來，科研工作者已在溶藻弧菌、殺魚愛德華氏菌、無乳鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、維氏氣單胞菌、副溶血性弧菌等水生動物致病菌中鑒定出上千個sRNA，現(xiàn)有的研究表明sRNA 是細菌適應環(huán)境變化和侵入宿主所需的調(diào)控網(wǎng)絡的一部分，在病原菌對碳源和氮源的利用、氧化壓力脅迫、缺鐵脅迫、pH 脅迫、運動性和毒力等方面發(fā)揮重要作用，但sRNA 調(diào)控機制研究的廣度和深度還明顯不夠。加強sRNA 調(diào)控機制的研究將對發(fā)展以sRNA 為靶標的疫病防控新技術(shù)提供理論基礎和新思路。