中華蛸受精卵人工孵化研究

孫以康，李美帥，陳四清，邊力，劉永勝，常青

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071；3.煙臺市海洋經濟研究院，山東 煙臺 264006）

中華蛸（Octopus sinensis）[1-3]俗稱“八爪魚”、“章魚”、“母豬章”和“紅章”等，主要分布于溫帶、亞熱帶和熱帶海域，是我國南方重要經濟物種[4～6]。中華蛸肉細味美，蛋白質含量高，可生食也可制成干品，有補血益氣、收斂生肌的藥用價值，作為海味和滋補品深受人們喜愛，在日本、韓國有更大市場，是重要的出口產品[7-10]。近幾年，大量捕撈及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，中華蛸資源量衰減，不能滿足市場需求[11,12]。但中華蛸生長周期短、生長速度快、食物轉化率高和產卵量大，極具養(yǎng)殖潛力[13,14]。目前，中國、日本等國家已開始中華蛸人工養(yǎng)殖技術的研究。

蛸類產卵后雌蛸守護卵群，用漏斗不斷給卵群噴水，清理卵群表面雜物，確保卵群有充足的氧氣，護卵期間雌蛸幾乎不離開卵群，攝食量極少，往往因消耗過大等原因而死亡[15,16]。中華蛸繁育時，個別親蛸經常在護卵期間意外死亡或離開孵化巢，失去親體看護的受精卵孵化率極低，大多會出現腐敗死亡。有研究表明，在無親蛸看護下受精卵發(fā)育10 d左右便會滋生霉菌和原生動物停止發(fā)育[17,18]。中華蛸受精卵在無親體看護下，發(fā)育到何期可以孵出幼體，目前尚沒有研究報道。若可以實現中華蛸受精卵的全人工孵化，便可以通過運輸受精卵串的方式代替親蛸運輸，降低運輸成本，有利于中華蛸養(yǎng)殖產業(yè)的擴大；中華蛸親體在產卵后有衰老現象，并且在護卵期間攝食量極少，親體完成護卵后的體重較產卵前明顯變輕，肉質明顯變差，若能實現中華蛸受精卵全人工孵化，可以將中華蛸親體及時賣出而降低養(yǎng)殖成本。

本實驗觀察了中華蛸受精卵發(fā)育狀態(tài)，在受精卵不同發(fā)育時期從孵化巢取出，進行人工孵化，研究中華蛸受精卵人工孵化與中華蛸親體護卵孵化的差異，尋找中華蛸受精卵可進行人工孵化的最佳發(fā)育時期，可為中華蛸受精卵人工孵化技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 親體采捕及培育

實驗所用中華蛸親體捕自福建連江海域，體質量為0.68～1.74 kg，運至煙臺天源水產有限公司牟平實驗基地，放入水泥池（6 m×2 m×1.5 m）中培育。培育池中放置蛸巢（圖1），蛸巢間距在50 cm 以上。所用海水是經砂濾池過濾的自然海水，鹽度29～32，水溫21 ℃～25 ℃，日換水量150%～200%。

圖1 蛸巢Fig.1 The nest of O.sinensis

每日下午投喂菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）、凍蝦、日本蛤（Charybdis japonica）等，第二天上午清理殘餌。培育第一天親體便有交配現象（圖2），經過50 d 培育親體自然產卵。

圖2 中華蛸交配Fig.2 O.sinensis mating

1.2 卵串處置方法對孵化率影響試驗

中華蛸受精卵分次成熟，分批產出，卵串在孵化巢中如同麥穗緊密排列（圖3-a、圖3-b），卵粒半透明形如米粒[19]（圖3-c）。選取四只同一天產卵的親蛸，每天觀察卵串的產出情況，在相應位置做好標記，受精卵經親體看護孵化24 d 左右幼蛸破膜而出。通過觀察胚胎發(fā)育狀態(tài)，將特定時期的受精卵從蛸巢取出，放入篩盆人工孵化。篩盆固定于網筐上（圖4），周圍放置1～2 個氣石。篩盆網眼小于幼蛸，上沿稍高出水面，以防初孵幼蛸逃逸。孵化期間水溫22.8 ℃～26.4 ℃，鹽度29～32，日換水量180%～250%。

圖3 中華蛸受精卵串Fig.3 A cluster of O.sinensis fertilized eggs

圖4 實驗裝置Fig.4 Experimental device

根據中華蛸受精卵發(fā)育天數以及關鍵結構（色素斑、吸盤、眼點等）的發(fā)育程度，將受精卵分為A、B、C、D、E、F、G、H 8 個時期[20]，每個時期所取受精卵分為四組。對照組為卵串間隔3～4 cm 放置于篩盆；組1 為卵串間隔3～4 cm 放置于篩盆，每天用洗瓶吹洗卵串，每次間隔1 h；組2 為卵串緊密疊放置于篩盆；組3 為卵串緊密疊放置于篩盆，每天用洗瓶吹洗卵串，每次間隔1 h。受精卵孵化成功后，統(tǒng)計孵出和未孵出幼蛸的數量，計算孵化率。

1.3 由親蛸護卵和沒有親蛸護卵孵出的幼蛸7 日成活率比較

選取對照組F、G 和H 期孵出的幼蛸和組1 在F、G 和H 期孵化的幼蛸以及由親蛸護卵孵化的幼蛸各100 只，置于20 L 的水桶中，每組設三個平行。以鹵蟲無節(jié)幼體為幼蛸的開口餌料[21,22]，在轉移至水桶后的0 h、24 h、48 h 投喂相同重量的鹵蟲并吸底換水，日換水量為20%，每天及時吸出死亡幼蛸。

按下式計算孵化率和成活率：

實驗數據以平均值±標準差（means±SD）表示，用Excel 2019 和SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行正態(tài)性和方差齊性檢驗及單因素分析，以P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同時期受精卵的發(fā)育狀態(tài)

在蛸巢中不同發(fā)育期的受精卵串的發(fā)育狀態(tài)如圖5 和圖6 所示。水溫22.8～26.4 ℃時，A 時期為發(fā)育1 d 的呈半透明狀受精卵，外層具有膠質保護膜，無特殊分化的結構（圖5-a）；B 時期為發(fā)育8 d的受精卵，已分化發(fā)育出眼、腕、漏斗等胚胎原基（圖5-b）；C 時期為發(fā)育11 d 的受精卵，胚胎眼點呈紅色，此時的卵串每個受精卵上均有紅色眼點（圖5-c、圖6-a）；D 時期為發(fā)育14 d 的受精卵，胚胎眼點由紅色轉為紫黑色，腕足已清晰可見（圖5-d、圖6-b）；E 時期為發(fā)育16 d 的受精卵，胚胎身體上開始出現5～8 個色素斑，色素斑呈淺紅色，腕足上的吸盤清晰可見（圖5-e、圖6-c）；F 時期為發(fā)育18 d 的受精卵，胚胎身體上淺紅色素斑增至10～18 個（圖5-f、圖6-d）；G 時期為發(fā)育20 d 的受精卵，身體上的色素斑進一步增加至20～24 個，其中胴體背部上的色素斑顏色變深呈暗紅色，卵串整體呈灰色（圖5-g、圖6-e、圖7-a）；H 時期為發(fā)育23 d 的受精卵，卵串呈灰褐色，由于臨近自然孵化日期，此時將卵串取出胚胎會因外界環(huán)境刺激提前1 d 孵化。孵出的幼蛸腕部吸附有尚未吸收完全的卵黃（圖5-h、圖7-b）。

圖5 中華蛸發(fā)育狀態(tài)Fig.5 The developmental diagram of fertilized eggs in O.sinensis

圖6 中華蛸受精卵串Fig.6 The developmental diagram of fertilized egg cluster in O.sinensis

2.2 不同發(fā)育時期從蛸巢中取出對孵化率的影響

將發(fā)育至A、B 時期的受精卵從蛸巢中取出人工孵化時，無論哪種方式都無法孵出幼體，發(fā)育7 d左右便停止發(fā)育，此受精卵較正常受精卵輕微膨大，表面呈淺紅色，卵黃渾濁變白。發(fā)育至C 時期時將其和親蛸分離進行人工孵化，僅有卵串分散放置時（對照組、組1）有幼體孵出，孵化率極低。選取C、D、E 時期的受精卵進行人工孵化時，雖可以少量的孵化出幼蛸，但孵化出幼蛸的受精卵多數位于卵串上卵粒相對稀疏的位置，且未孵化的受精卵渾濁發(fā)灰沒有光澤（表1）。

表1 受精卵孵化率（%）Tab.1 Hatching rate of fertilized egg（%）

受精卵發(fā)育到F、G 時期時開始人工孵化，孵化率明顯升高，H 時期時孵化率可達99%。當受精卵發(fā)育至F、G 時期時，卵串中央以及卵串兩端的受精卵均可孵化成功，未孵化成功的受精卵卵黃變白，卵粒發(fā)灰失去光澤，在解剖鏡下觀察時，胚胎不蠕動。H 時期的受精卵串取出放入篩盆后便有幼蛸孵化，2 h 后卵串上的受精卵只有少數孵化失敗。

在人工孵化過程中，排列稀疏的卵串孵化率明顯高于排列緊密的卵串，且隨著受精卵臨近孵出日期，吹洗卵串對孵化率的影響逐漸減（表1、圖8）。

圖8 不同條件下受精卵孵化率與發(fā)育時期的關系Fig.8 The relationship between hatching rate and developmental period of fertilized eggs under different conditions

2.3 幼蛸7 日成活率比較

人工孵化和自然孵化的F、G 時期受精卵所得幼蛸7 日成活率無顯著差異（P>0.05）。由H 時期受精卵人工孵化所得幼蛸7 日成活率顯著低于自然孵化幼蛸和F、G 時期受精卵所孵化的幼蛸，其平均7 日存活率僅為11.7%（P<0.05）（表2）。因此，當受精卵發(fā)育至G 時期時取出人工孵化可得到較好的孵化效果。實驗過程中，F、G 時期受精卵所孵出的幼蛸以及自然孵出的幼蛸大多聚集在水體表面，只有少數位于水體的中下層，而H 時期提前1 d 孵化的幼蛸，大多聚集的水體中下層。此現象也表明，H時期提前孵化的幼蛸活力較差。

表2 幼蛸7 日成活率（%）Tab.2 Survival rate of 7 day old O.sinensis（%）

3 討論

3.1 不同發(fā)育時期脫離親體對孵化率的影響

波紋龍蝦（Panulirus homarus）、日本米蝦（Caridina japonica）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的胚胎離體孵化時，在任何發(fā)育時期均能孵化出健康的幼體，且隨著臨近出膜期，胚胎的孵化率逐漸升高[23-25]。中華蛸受精卵脫離親體進行人工孵化時，發(fā)育前期的受精卵無法孵出幼體，當卵串排列稀疏時，從黑珠期開始，受精卵也具有隨著臨近出膜期孵化率逐漸升高的趨勢。

將中華蛸不同發(fā)育時期受精卵串取出人工孵化時，A、B 時期的受精卵發(fā)育7 d 左右卵黃渾濁變白，內部有絲狀結構，停止發(fā)育，推測受精卵可能是被霉菌或者其它原生動物寄生，具體是何種生物還有待于進一步探究。當受精卵發(fā)育至G 時期取出時，胚胎已基本發(fā)育成型，在顯微鏡下觀察發(fā)現，胚胎有時會輕微扭動，卵黃也已較小，推測此時對于霉菌或其他寄生者來說，由于幼蛸免疫力增強、受精卵內營養(yǎng)物質減少、胚胎臨近孵出時間沒有充足的寄生時間等原因不再利于寄生。當受精卵發(fā)育至H 時期時已非常臨近自然孵出日期，將蛸巢提出水面取受精卵時，因為滲透環(huán)境變化劇烈，胚胎在卵膜內劇烈蠕動，提前1 d 破膜而出，因此H 時期孵化率高但成活率低。

3.2 卵串的疏密程度和吹卵對孵化率的影響

中華蛸親體在護卵期間會不斷用漏斗給卵群噴水，并時常用腕足撥弄卵群，這樣能清理受精卵上所粘附的雜物，使卵群有充足的氧氣。受精卵串排列緊密組的孵化率均低于卵串排列稀疏組，在相同疏密程度下吹洗卵串也可提高孵化率，這表明在人工孵化時，將卵串間隔開保持充足的溶氧是確保孵化成功的關鍵。在擬目烏賊（Sepia lycidas）的人工孵化過程中孵化率也會隨著孵化密度的升高而降低，且在相同密度下充氣與否會顯著影響孵化率[26]。

通過對照組、組1 和組3 的對比表明，隨著受精卵臨近孵出，吹洗卵串對孵化率的影響逐漸減小，推測這可能和霉菌、原生動物等沒有充足的寄生時間有關，因此在生產實踐過程中，只需保證卵串排列相對稀疏便可得到較高的孵化率。

3.3 剛出膜幼蛸7 日成活率的比較

幼蛸出膜后腕部會包裹有尚未吸收完全的外卵黃囊，經6～12 h 外卵黃囊被完全吸收，但被覆在消化腺周圍的內卵黃囊需2～3 d 才會被消化吸收完全[27]。在幼蛸7 日成活率實驗中，第3 d 時每個實驗組的幼蛸成活率均有明顯下降，推測和內卵黃囊消化吸收完全，能量供給不足有關。H 時期所孵幼蛸較正常孵化幼蛸提前1 d 孵出，其7 日成活率顯著低于自然孵化的幼蛸以及F、G 時期孵化的幼蛸，推測其原因是由早產所導致。