楊好，黃衍焱，易春霖，石軍，譚楮湉，任文芮，王文明

水稻位點(diǎn)6個(gè)稻瘟病抗性基因特異分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

楊好1，黃衍焱1，易春霖1，石軍2，譚楮湉1，任文芮1，王文明1

1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水稻研究所/廳市共建作物特色資源創(chuàng)制及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽 621023

【目的】水稻位點(diǎn)由多個(gè)串聯(lián)的同源基因組成，從中已克隆了超過10個(gè)優(yōu)良的稻瘟病抗性基因。論文旨在鑒別水稻親本位點(diǎn)抗性基因的組成，促進(jìn)該位點(diǎn)基因快速、精準(zhǔn)地應(yīng)用于水稻抗性育種?！痉椒ā繉Ρ任稽c(diǎn)已克隆抗性基因的序列，從中發(fā)掘各基因特異的核苷酸位點(diǎn)；然后將各目標(biāo)基因分別與數(shù)據(jù)庫（Rice Resource Center）中的155個(gè)水稻基因組進(jìn)行比對分析，進(jìn)一步從中篩選出特異最強(qiáng)的核苷酸位點(diǎn)，用于、、、、和6個(gè)抗性基因特異分子標(biāo)記的開發(fā)；以24個(gè)抗稻瘟病單基因系、陽性對照和110個(gè)四川盆地水稻親本為鑒定對象，通過優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件、測序或基因組數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于該位點(diǎn)基因的同源性較高、基因間常常擁有一些相同的特異位點(diǎn)，導(dǎo)致許多抗性基因很難用一對分子標(biāo)記進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，因此采用多對分子標(biāo)記共同鑒定的方式；另外許多特異位點(diǎn)為單堿基差異，因此需要對差異位點(diǎn)旁的堿基進(jìn)行特異突變，使引物的3′端具有兩個(gè)堿基的錯(cuò)配，以提高PCR擴(kuò)增的特異性?！窘Y(jié)果】最終為6個(gè)位點(diǎn)的抗性基因開發(fā)了有效的分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)32.09%的參試水稻材料含有位點(diǎn)抗性基因。、、、、和分別存在于1、7、8、14、23和33個(gè)水稻材料中，其中僅存在于單基因系中。這些抗性基因通常兩個(gè)或多個(gè)組合在一起，同時(shí)存在于一個(gè)水稻材料中。其中往往與或成對出現(xiàn)，僅在成恢993、HR2168和綿恢365 3個(gè)親本中單獨(dú)存在。雨恢38含有的位點(diǎn)抗性基因最多，分別有、、和。川谷B、川農(nóng)4B、內(nèi)香6B和雙1B中均同時(shí)含有、和3個(gè)抗性基因。千鄉(xiāng)654B中含有和兩個(gè)抗性基因?！窘Y(jié)論】為位點(diǎn)的6個(gè)同源稻瘟病抗性基因開發(fā)了特異的分子標(biāo)記，明確了四川盆地110個(gè)水稻親本位點(diǎn)的抗性基因組成，揭示了位點(diǎn)抗性基因豐富的組合形式，為水稻育種的抗原選擇提供了明確參考。

水稻；稻瘟??；位點(diǎn)；同源基因；分子標(biāo)記

0 引言

【研究意義】稻瘟病是威脅水稻安全生產(chǎn)的重要病害之一，通過抗性育種導(dǎo)入或聚合抗性基因是提高水稻抗性最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。在已知的抗性基因中，位點(diǎn)串聯(lián)的同源基因最多，一般在9—15個(gè)[1-4]，從中克隆了[5-6]、[7]、[8]、[7-8]、[3]、[1]、[2]和[9]等10余個(gè)廣譜抗性基因，其中、和等基因在全國各稻作區(qū)均具有良好的稻瘟病抗性，并得到了廣泛應(yīng)用[10-13]。為了在育種中更加高效而精準(zhǔn)地利用位點(diǎn)的稻瘟病抗性基因，需要有特異的分子標(biāo)記從眾多同源基因中精準(zhǔn)地鑒別各個(gè)抗性基因，從而明確水稻親本中位點(diǎn)的抗性基因組成。進(jìn)一步利用這些分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選育，促進(jìn)位點(diǎn)抗性基因在抗病育種中的應(yīng)用，提高水稻對稻瘟病的抗性，為水稻的安全生產(chǎn)提供保障。【前人研究進(jìn)展】水稻位點(diǎn)中串聯(lián)多個(gè)同源基因，導(dǎo)致該位點(diǎn)功能基因的克隆、區(qū)分及鑒別相對困難。在水稻抗病材料二八占中，位點(diǎn)包含12個(gè)同源基因，其中和-的DNA序列完全相同，介導(dǎo)了的廣譜抗性。和也有一樣的DNA序列，與僅有8個(gè)SNP的差異，但不具有抗稻瘟病的功能[2]。與基因序列相同的（），賦予了谷梅4號廣譜的稻瘟病抗性，其編碼的蛋白與無抗性功能的同源蛋白R4相比僅有4個(gè)氨基酸的差異[1]。不僅串聯(lián)的同源（旁系同源基因）同源性高，不同水稻材料中克隆的直系同源（orthologous gene）基因間也非常保守，例如中花11中克隆的與Toride 1中克隆的編碼相同的氨基酸序列，和C101A51中克隆的編碼的抗性蛋白間僅有8個(gè)氨基酸的差異[7-8]。而從地谷B中克隆的雖然與同位點(diǎn)的其他抗性基因的同源性較低，但與其他位點(diǎn)的抗性基因相比，仍然與同位點(diǎn)的其他抗性基因在同一進(jìn)化分支中[9]。【本研究切入點(diǎn)】由于位點(diǎn)抗性基因的同源性高，有的串聯(lián)在一個(gè)基因位點(diǎn)中，因此使用連鎖標(biāo)記等方法很難準(zhǔn)確地區(qū)分和鑒別該位點(diǎn)的抗性基因。另外，位點(diǎn)抗性基因具有廣譜的稻瘟病抗性，在水稻抗性育種中具有很高的應(yīng)用價(jià)值，然而絕大部分水稻親本沒有明確的抗性基因組成，因此本研究通過比對位點(diǎn)已知同源基因的DNA序列，分別篩選、、、、和特異的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，開發(fā)特異的分子標(biāo)記引物對。以24個(gè)抗稻瘟病單基因系、陽性對照和110個(gè)四川盆地水稻親本為鑒定對象，通過優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件、測序或基因組數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為位點(diǎn)的6個(gè)抗性基因、、、、和開發(fā)特異的分子標(biāo)記，明確110個(gè)參試水稻親本位點(diǎn)的抗性基因組成。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年9月至2023年7月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 水稻材料

24份抗稻瘟病單基因系水稻材料，110份四川盆地常用水稻育種親本材料，以及對照材料地谷B、谷梅4號、日本晴（Nipponbare，NPB）、中花11（Zhonghua 11，ZH11）和麗江新團(tuán)黑谷（Lijiangxintuanheigu，LTH）（表1）。

1.2 核苷酸多態(tài)性序列的篩選及引物設(shè)計(jì)

通過在線多序列比對網(wǎng)站（https://www.novopro. cn/tools/muscle.html）分析位點(diǎn)8個(gè)同源基因，、、、、、、和，在編碼區(qū)的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，然后在水稻資源中心（http://ricerc.sicau.edu.cn/）的155個(gè)水稻資源（包括秈稻、粳稻、非洲栽培稻和野生稻等）基因組中分析這些多態(tài)性位點(diǎn)的特異性，在特異性最強(qiáng)位置開發(fā)分子標(biāo)記。當(dāng)單核苷酸差異位點(diǎn)作為分子標(biāo)記引物的3′末端時(shí)，則將其相鄰的第二位堿基進(jìn)行特異突變，形成新的錯(cuò)配位點(diǎn)，使引物與非目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的3′末端始終保持兩個(gè)堿基的錯(cuò)配，減少PCR過程中非特異擴(kuò)增的產(chǎn)生。

1.3 水稻DNA提取

水稻DNA采用CTAB法提?。喝?00 mg水稻葉片裝入1.5 mL離心管中，液氮中磨碎后，加入500 μl CTAB溶液。然后放置在65 ℃烘箱中萃取，每隔10 min混勻一次。30 min后將樣品轉(zhuǎn)移到室溫，冷卻后加500 μL氯仿/異戊醇（24﹕1）溶液，混勻并在室溫靜置5 min。然后12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的1 mL離心管中，加入等體積無水乙醇，混勻后放置在-20 ℃冰箱中10 min。然后12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 L預(yù)冷的75%無水乙醇洗滌沉淀兩次，室溫下干燥沉淀，最后加入100 μL ddH2O溶解DNA，放置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 PCR擴(kuò)增條件及分子標(biāo)記引物對的準(zhǔn)確性檢驗(yàn)

PCR擴(kuò)增所用的DNA聚合酶來源于北京莊盟國際生物基因科技有限公司（貨號：ZT101），PCR擴(kuò)增體系：2.0 μL模板DNA（400 ng·μL-1），2.0 μL Buffer，0.5 μl dNTP（2.5 mmol·L-1each），0.5 μL正向引物（10 μmol·L-1），0.5 μL反向引物（10 μmol·L-1），0.5 μL Taq酶（2.5 U·μL-1），14.0 μL ddH2O，共20 μL。

為了提高分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性，以單基因系、NPB（）、ZH11（/）、谷梅4號（和）為陽性對照，感病材料LTH等為陰性對照，調(diào)整和優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件（表2）。為了檢驗(yàn)標(biāo)記結(jié)果，如果被標(biāo)記材料在水稻資源中心數(shù)據(jù)庫中有全基因組序列（蜀恢498、蜀恢527、蜀恢548、地谷B、雅恢2115、宜香1B、華占、五山絲苗、中花11、日本晴和LTH），則通過序列分析檢驗(yàn)標(biāo)記結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果標(biāo)記結(jié)果中沒有這些材料，將隨機(jī)進(jìn)行測序分析檢驗(yàn)，最終為、、、、和6個(gè)同源抗性基因開發(fā)有效而準(zhǔn)確的分子標(biāo)記引物對（表2）。

2 結(jié)果

2.1 Pi2和Piz-t分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

特異分子標(biāo)記引物對中，正向引物Pi2/z-t-F的特異性不強(qiáng)，而反向引物Pi2-R位于多態(tài)性豐富的區(qū)域，具有很強(qiáng)的特異性（圖1-A）。使用這對分子標(biāo)記，24個(gè)單基因系中僅含有的單基因系材料IRBLz5-CA被特異地標(biāo)記，在110個(gè)水稻親本中，有22個(gè)材料被標(biāo)記（圖1-B、表3），其中包括雅恢2115、華占、蜀恢548和五山絲苗4個(gè)有全基因組數(shù)據(jù)的材料。經(jīng)比對分析，這4個(gè)材料均含有，另外也有研究報(bào)道雅恢2115和蜀恢548含有[14-15]，蜀恢586經(jīng)過PCR擴(kuò)增和測序，確認(rèn)含有。說明的分子標(biāo)記具有很強(qiáng)的特異性。

由于擁有的核苷酸特異位點(diǎn)較少，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了3個(gè)特異分子標(biāo)記共同鑒別。如圖1-C所示，分子標(biāo)記引物對Piz-t-F4和Piz-t-R4不能區(qū)分、與3個(gè)基因；引物對Pi2/z-t-F和Piz-t-R2不能區(qū)分、與3個(gè)基因；引物對Pi2/z-t-F和Piz-t-R3不能區(qū)分與兩個(gè)基因。同時(shí)使用這3個(gè)分子標(biāo)記，24個(gè)單基因系中僅含有的材料IRBLzt-T被同時(shí)標(biāo)記，水稻親本材料中有13個(gè)被同時(shí)標(biāo)記（表4）。其中包括蜀恢498和中花11，分析其全基因組序列，證明含有，瀘恢8258、明恢86和蜀恢137經(jīng)過PCR擴(kuò)增和測序，確認(rèn)含有。說明使用這3對分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確地標(biāo)記含有的水稻材料。

表1 供試水稻品種

表2 分子標(biāo)記引物對及PCR擴(kuò)增條件

表3 含有Pi2的水稻材料

表4 含有Piz-t的水稻材料

2.2 Pi9和Pi9-type5分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

在分子標(biāo)記的引物對中，正向引物在其他同源基因中均有5個(gè)以上的錯(cuò)配位點(diǎn)，具有很高的特異性。反向引物在中無錯(cuò)配位點(diǎn)，但在其他同源基因中均有6個(gè)以上的錯(cuò)配位點(diǎn)（圖2-A）。使用這對引物鑒定，發(fā)現(xiàn)所有參試材料中，僅含有的單基因系IRBL9-W能夠被標(biāo)記。說明該分子標(biāo)記具有很高的特異性，不存在于110個(gè)水稻親本中。

A：Pi9分子標(biāo)記引物對Pi9-F和Pi9-R所在位置核苷酸的多態(tài)性分析The nucleotide polymorphism analysis of primer pair, Pi9-F and Pi9-R, for the molecular markers of Pi9。B：Pi9-type5分子標(biāo)記引物對Pi9-type5F1和Pi9-type5R1，Pi9-type5F2和Pi9-type5R2，Pi9-type5F3和Pi9-type5mR所在位置核苷酸的多態(tài)性分析。箭頭標(biāo)記引物位置及方向，*表示引物中引入的特異錯(cuò)配堿基，以提高PCR擴(kuò)增的特異性。灰色陰影標(biāo)記的小寫字母為核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，灰色陰影標(biāo)記的大寫字母為引物特異性突變創(chuàng)造的錯(cuò)配位點(diǎn)The nucleotide polymorphism analysis of primer pairs, Pi9-type5F1 and Pi9-type5R1, Pi9-type5F2 and Pi9-type5R2, Pi9-type5F3 and Pi9-type5mR, for the molecular markers of Pi9-type5. The arrows indicate the site and direction of primers. * indicates artificial mutated base in primer for improving specificity of PCR amplification. The shaded lowercase letters indicate the polymorphic nucleotide sites in homologous genes. The shaded uppercase letters indicate the primer mismatched site generated by artificial mutated base in homologous genes

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)需要用3個(gè)分子標(biāo)記引物對共同鑒定。引物Pi9-type5F1盡管在已知的同源基因中幾乎無特異性（圖2-B），然而其3′末端的兩個(gè)堿基在155個(gè)水稻種質(zhì)資源中的某些未知同源基因序列中有較高的特異性。經(jīng)Pi9-type5F1與Pi9-type5R1、Pi9-type5F2與Pi9-type5R2、Pi9-type5F3與Pi9-type5mR共同鑒定，發(fā)現(xiàn)它們標(biāo)記的材料完全相同（表5），包括兩個(gè)單基因系IRBLz5-CA（）和IRBLzt-T（），以及31個(gè)水稻親本材料。這3個(gè)分子標(biāo)記利用不同的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)得到了相同的結(jié)果，說明3個(gè)分子標(biāo)記對均有很好的特異性?？共位蛳礗RBLz5-CA（）和IRBLzt-T（）攜帶的抗性基因分別來源于克隆這兩個(gè)抗性基因的品種C101A51和Toride 1[16]，在這兩個(gè)材料中，與的啟動子及編碼區(qū)序列一致[8]。序列比對發(fā)現(xiàn)與的序列一致，因此單基因系IRBLz5-CA和IRBLzt-T分別攜帶的抗性基因與即為，另外，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，再次確認(rèn)兩個(gè)單基因系含有。分析雅恢2115、華占、蜀恢548和五山絲苗4個(gè)親本材料的基因組序列，發(fā)現(xiàn)它們均含有。雅恢2116和粵農(nóng)絲苗經(jīng)過PCR擴(kuò)增和測序，確認(rèn)含有。表明這3個(gè)分子標(biāo)記均有很好的特異性，能夠有效地鑒別。

表5 含有Pi9-type5的水稻材料

2.3 PigmR分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

在開發(fā)分子標(biāo)記的過程中，諸多基于特異性核苷酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記引物對依然能從中花11、NPB或者LTH等明確不含有的水稻材料中擴(kuò)增出標(biāo)記片段。經(jīng)過不斷篩選、試驗(yàn)和檢驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)Pigm-F2和Pigm-newmR1、Pigm-newmF1和Pigm-newmR1、Pigm-mF4和Pigm-mR5、Pigm-mF6和Pigm-mR7 4個(gè)分子標(biāo)記引物對可以準(zhǔn)確地將從參試水稻材料中鑒別出來（圖3）。在110個(gè)水稻親本中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)含有的材料（表6）。其中包含地谷B，使用序列在地谷B的基因組中比對，明確地谷B中含有。另外隨機(jī)挑選水稻親本材料蓉18B和川谷B，通過PCR對進(jìn)行克隆及測序分析，明確蓉18B和川谷B中含有。說明使用這些分子標(biāo)記共同鑒定具有良好的特異性。

箭頭標(biāo)記引物位置及方向，*表示引物中引入的特異錯(cuò)配堿基，以提高擴(kuò)增的特異性?；疑幱皹?biāo)記的小寫字母為核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，灰色陰影標(biāo)記的大寫字母為引物特異性突變創(chuàng)造的錯(cuò)配位點(diǎn)

2.4 Pid4分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

由于在DNA序列上與其他同源基因、、和等有明顯的差異（圖4-A），特異的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)很難通過與這些基因的同源比對中獲得。而水稻資源中心的155個(gè)水稻資源（包括秈稻、粳稻、非洲栽培稻和野生稻等）基因組數(shù)據(jù)為分析的特異核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)提供了充足的同源基因資源。通過比對分析，最終將分子標(biāo)記設(shè)計(jì)在特異性最強(qiáng)位點(diǎn)（圖4-A）。以克隆的地谷B為陽性對照，最終從參試材料中鑒定出了7個(gè)水稻親本含有，而所有的單基因系不含該基因（圖4-B、表7），川農(nóng)4B、內(nèi)香6B和雙1B經(jīng)過PCR擴(kuò)增和測序，確認(rèn)含有。

表6 含有PigmR的水稻材料

A：Pid4分子標(biāo)記引物對的核苷酸多態(tài)性分析。箭頭標(biāo)記引物位置及方向，*表示引物中引入的特異錯(cuò)配堿基，以提高擴(kuò)增的特異性?；疑幱皹?biāo)記的小寫字母為核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，灰色陰影標(biāo)記的大寫字母為引物特異性突變創(chuàng)造的錯(cuò)配位點(diǎn)The nucleotide polymorphism analysis of primer pairs for the molecular marker of Pid4. The arrows indicate the site and direction of primers. * indicates artificial mutated base in primer for improving specificity of amplification. The shaded lowercase letters indicate the polymorphic nucleotide sites in homologous genes. The shaded uppercase letters indicate the primer mismatched sites generated by artificial mutated base in homologous genes。B：分子標(biāo)記鑒定參試水稻品種中的Pid4 The molecular marker was used to characterize the Pid4 in tested rice varieties。M：DNA marker

表7 含有Pid4的水稻材料

2.5 Pi9位點(diǎn)同源稻瘟病抗性基因在四川盆地水稻親本中的應(yīng)用現(xiàn)狀

根據(jù)鑒定結(jié)果，32.09%的參試水稻材料含有位點(diǎn)抗性基因，、、、、和分別存在于1、7、8、14、23和33個(gè)材料中（表3—表7）。其中僅在陽性單基因系IRBL9-W中存在，因此在參試的水稻親本中均不存在。根據(jù)表8所展示的水稻親本在位點(diǎn)的抗性基因組成，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)材料同時(shí)含有多個(gè)同源抗性基因。和同時(shí)存在于23個(gè)水稻材料的位點(diǎn)中，其中包括單基因系IRBLz5-CA（）、華占、蜀恢548和五山絲苗。分析華占、蜀恢548和五山絲苗的基因組數(shù)據(jù)，證實(shí)同時(shí)含有和。另外還有8個(gè)水稻材料中同時(shí)含有和，其中包括單基因系材料IRBLzt-T（）和蜀恢498，分析蜀恢498的基因組數(shù)據(jù)，證實(shí)蜀恢498的位點(diǎn)同時(shí)含有和。

分子標(biāo)記鑒定結(jié)果顯示，地谷B中含有和，分析其基因組序列證實(shí)了這一鑒定結(jié)果。另外，千鄉(xiāng)654B中含有和；川谷B、川農(nóng)4B、內(nèi)香6B和雙1B中均同時(shí)含有、和3個(gè)抗性基因；雨恢38中含有、、、4個(gè)抗性基因。

位點(diǎn)中，僅含有一個(gè)抗性基因的水稻材料較少，如含有的單基因系IRBL9-W，含有的成恢993、HR2168和綿恢365，含有的蓉18B。這些結(jié)果表明，四川盆地主要水稻親本材料中，位點(diǎn)的抗性基因組合形式豐富，為水稻抗性育種貢獻(xiàn)了重要的基因資源。

3 討論

3.1 基因編碼區(qū)開發(fā)分子標(biāo)記的優(yōu)勢

分子標(biāo)記是PCR擴(kuò)增出的特異片段，一般通過其大小、多少、有無或是否能被酶切等方式標(biāo)記和鑒別特定的基因，分子標(biāo)記的引物對一般位于基因的連鎖區(qū)或基因內(nèi)。連鎖區(qū)的分子標(biāo)記，如SSR等利用基因連鎖區(qū)的差異進(jìn)行特異標(biāo)記。這樣的分子標(biāo)記往往受連鎖累贅或遺傳背景等問題的限制，有可能因染色體發(fā)生交換而出現(xiàn)錯(cuò)選和漏選目標(biāo)基因的情況[17]，在遺傳背景相近或者標(biāo)記位點(diǎn)無差異的兩個(gè)材料間很難進(jìn)行有效的鑒定與篩選。更不能鑒別出不同遺傳背景材料中所含的相同抗性基因，比如中花11中克隆的和Toride 1中克隆的，它們編碼氨基酸序列相同的抗性蛋白[7-8]，二八占中克隆的與谷梅4號中克隆的擁有完全一樣的DNA序列[1-2]，本研究通過分子標(biāo)記及基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，地谷B中也含有。說明相同的抗性基因可能來源于血緣遺傳，但也可能源于相同或相似選擇壓力下趨同的進(jìn)化。

在目標(biāo)基因的編碼區(qū)開發(fā)分子標(biāo)記，可以有效地?cái)[脫分子標(biāo)記輔助篩選過程中面臨的連鎖累贅和遺傳背景等問題的制約，更精準(zhǔn)地鑒別目標(biāo)基因。由于位點(diǎn)是由多個(gè)串聯(lián)的同源基因組成，有些基因間的同源性非常高，導(dǎo)致分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性面臨著很大的挑戰(zhàn)。例如與附近串聯(lián)的無抗性功能的編碼的蛋白僅有4個(gè)氨基酸差異[1]。在實(shí)驗(yàn)過程中，有些的分子標(biāo)記引物對能在LTH或不含有目標(biāo)基因的陰性對照材料中擴(kuò)增出標(biāo)記片段。為了解決這一問題，首先將目標(biāo)基因的特異核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)排列出來，分析這些位點(diǎn)在不同同源基因中的分布特點(diǎn)，然后從中篩選多個(gè)特異位點(diǎn)開發(fā)分子標(biāo)記，通過多重PCR篩選，逐步將高度同源的基因排除，從而提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管目前位點(diǎn)的多個(gè)抗性基因均開發(fā)了特異的分子標(biāo)記[17-21]，有些標(biāo)記成功地應(yīng)用到了分子輔助育種中[22-25]，但這些分子標(biāo)記局限于材料的遺傳背景，只能對特定材料進(jìn)行分子輔助選育。本研究開發(fā)的分子標(biāo)記，不僅能用于分子標(biāo)記輔助育種，還能突破遺傳背景的限制，用于鑒別水稻親本及資源材料中的抗性基因組成，為水稻抗性育種明確更多種質(zhì)資源的抗性基因組成，促進(jìn)抗性育種的發(fā)展。

表8 水稻親本基因組中Pi9位點(diǎn)稻瘟病抗性基因的組成

3.2 Pi9位點(diǎn)的抗性可能由多個(gè)抗性基因協(xié)同產(chǎn)生

位點(diǎn)串聯(lián)著多個(gè)同源基因，大多數(shù)情況下由其中一個(gè)抗性基因賦予了水稻廣譜的稻瘟病抗性，如、[8][5]和[2]等。本研究通過分子標(biāo)記鑒別，揭示了位點(diǎn)抗性基因組成的復(fù)雜性。在參試水稻材料中，僅有5個(gè)材料的位點(diǎn)含有單個(gè)抗性基因。其他位點(diǎn)含有抗性基因的材料中，除了和不能同時(shí)存在外，該位點(diǎn)的抗性基因均能以不同的組合方式聚合在一起，其中主要以與或基因組合的方式存在（表8）。在以往的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)，如中花11中串聯(lián)同源基因（）對（）的抗性功能有重要貢獻(xiàn)[3]。谷梅4號中，和兩個(gè)基因在抗性中起著相反的作用，相互協(xié)作，平衡抗性與產(chǎn)量[1]。位點(diǎn)之所以只能克隆出其中某一個(gè)抗性基因，原因可能在于該位點(diǎn)不同抗性基因所編碼的蛋白識別不同的效應(yīng)因子。因此串聯(lián)多個(gè)同源基因的位點(diǎn)可能是一個(gè)聚合了多個(gè)抗性基因的位點(diǎn)，賦予了水稻更廣譜的抗性。在全國各個(gè)稻作區(qū)，位點(diǎn)的抗性基因一般比其他位點(diǎn)的抗性基因具有更強(qiáng)的稻瘟病抗性[26-28]，而且、、和等廣譜抗病基因在全國均有廣泛的應(yīng)用[29-32]。由于不同材料中位點(diǎn)串聯(lián)著不同數(shù)量的基因，因此雜交時(shí)該位點(diǎn)的重組可能使子代形成不同于雙親的基因組合方式，這可能是該位點(diǎn)快速進(jìn)化和一直保持較高稻瘟病抗性的原因之一。另外，尚不清楚位點(diǎn)不同抗性基因如何共同發(fā)揮抗病功能，這為深入解析位點(diǎn)的抗病機(jī)制提供了新的思路。

4 結(jié)論

成功地為位點(diǎn)的6個(gè)同源稻瘟病抗性基因、、、、和開發(fā)了特異的分子標(biāo)記，明確了四川盆地110個(gè)水稻親本位點(diǎn)的抗性基因組成。參試水稻親本中不存在，而、、、和5個(gè)基因通常以兩個(gè)或多個(gè)基因組合的方式存在于36.36%的水稻親本中。

致謝：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)趙文生教授提供了24份抗稻瘟病單基因系水稻材料，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)黃富教授和王玉平教授、四川省綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院石軍研究員和四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院李小艷博士提供了110份四川盆地常用水稻育種親本材料，四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所彭云良教授提供了地谷B和谷梅4號。在此一并表示感謝！

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Development and application of specific molecular markers for six homologous rice blast resistance genes inLocus of rice

YANG Hao1, HUANG YanYan1, YI ChunLin1, SHI Jun2, TAN ChuTian1, REN WenRui1, WANG WenMing1

1State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;2Institute of Rice Research, Mianyang Academy of Agricultural Sciences/Crop Characteristic Resources Creation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Mianyang 621023, Sichuan

【Objective】Theresistance gene locus, conferring a broad-spectrum resistance against, is consist by several tandem homologous genes. over 10 resistance genes have been cloned from this gene locus. This study aims to clarify thegene composition atlocus in rice resource materials and promote the application of those genes in rice resistance breeding.【Method】Comparing the DNA sequence of clonedgenes atlocus, the specific nucleotide polymorphism sites were screened as the candidate sites. Subsequently, eachgene was blasted with 155 rice genomes in the database of Rice Resource Center. The most specific nucleotide polymorphism sites were picked out from the candidate site in each gene to develop primer pair of molecular markers. The PCR product of primer pairs was used to mark indicatedgene in tested rice materials via parameter optimization. To verify the results, thegenes were cloned from indicated rice variety randomly and examined by Sanger sequencing, or analyzed thegenes from the genome database if the genome sequence of indicated rice variety exists in Rice Resource Center. Thegenes inlocus have high homology, which cause same specific nucleotide polymorphism sites existing in differentgenes. Therefore, somegenes are hardly identified by one molecular marker. For this case, several molecular markers were employed to identify the indicatedgene simultaneously. Moreover, some specific nucleotide polymorphism sites are single nucleotide polymorphism (SNP), in where the primers of molecular markers have a mismatched base. In order to improve the specificity of PCR amplification, the adjacent base of SNP was mutated to generate two mismatched bases at 3′ site of primer.【Result】Finally, the valid molecular markers were developed for eachgene and identified 32.09% tested materials containinggenes atlocus.,,,,andare present in 1, 7, 8, 14, 23 and 33 tested materials, respectively. Theonly presents in monogenic line but not in rice parent lines. The other genes are usually present in two or more gene combinations in rice parent lines. Theoften presents in pair withand, and presents alone in three rice parents, Chenghui 993, HR2168 and Mianhui 365. Yuhui 38 contains the mostgenes atlocus, including,,and. Chuangu B, Chuannong 4B, Neixiang 6B and Shuang 1B contain,and. Qianxiang 654B containsand.【Conclusion】This study successfully developed specific molecular markers for six homologous rice blast resistance genes inlocus and identified thegene composition inlocus for 110 rice parent lines that used in rice breeding in Sichuan basin. It also discovered different types ofgenes combination atlocus and provided a clear reference for choosing the resistance source in rice breeding.

rice; rice blast;locus; homologous gene; molecular marker

2023-07-23；

2023-09-06

國家自然科學(xué)基金（U19A2033，31901839）、四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)（2022JDTD0023）

楊好，E-mail：2365657091@qq.com。黃衍焱，E-mail：h1985yy@163.com。楊好和黃衍焱為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王文明，E-mail：j316wenmingwang@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）