胡煜，王含夢，陳然眾，彭昌民，李樂，唐雙陽

1 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽 421001；

2 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所

宮頸癌是發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。放射治療是指利用由輻射產(chǎn)生的粒子束治療惡性腫瘤的方法，是治療包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤的常用手段，但放療對晚期宮頸癌的治療效果較差［1］。免疫治療指利用宿主免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞從而治療癌癥［2］，對于標準化治療失敗的宮頸癌患者，免疫治療是可改善其預(yù)后的一種治療手段［3］。放射治療在殺死腫瘤細胞的同時可以產(chǎn)生深遠的免疫刺激作用，有助于使免疫治療不敏感腫瘤變得敏感，因此放射治療及免疫治療聯(lián)合應(yīng)用對惡性腫瘤具有良好的治療前景。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展、輻射敏感性、免疫刺激反應(yīng)都受細胞內(nèi)某些基因的調(diào)控，尋找在這三者中均發(fā)揮作用的基因可能有助于更好的了解宮頸癌的免疫放射聯(lián)合治療機制。2022 年10 月—2023 年6月，本研究通過生物信息學(xué)方法篩選影響宮頸癌輻射敏感性的相關(guān)差異基因并進行表達驗證以及免疫相關(guān)性分析，以期為宮頸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌輻射敏感性差異基因的篩選

1.1.1 數(shù)據(jù)來源及處理 從Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm. nih.gov/geo/）中下載基因表達數(shù)據(jù)集GSE6213、GSE166466、GSE6791、GSE64217，分別基于平臺GPL2895，GPL23126，GPL570 及GPL10588，其中GSE6213 數(shù)據(jù)集包含放療前后宮頸癌組織共28個樣本，GSE166466、GSE6791、GSE64217 數(shù)據(jù)集分別包含14、16、4 個正常宮頸組織及宮頸癌組織樣本。對4 個數(shù)據(jù)集中的樣本數(shù)據(jù)均進行標準化處理。

1.1.2 差異基因篩選 基于R 3.40.2軟件的limma包對GEO得到4個數(shù)據(jù)集的mRNA表達譜進行校正和歸一，分析調(diào)整后的P值以糾正假陽性結(jié)果。以調(diào)整后P＜0.05 且|log2FC|＞1 作為宮頸癌輻射敏感性差異基因篩選的閾值。使用韋恩圖將得到的差異基因取交集。

1.2 宮頸癌輻射敏感性差異基因的表達驗證

1.2.1 差異基因的表達分析 從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫及Genotype-Tissue Expression（GTEx）數(shù)據(jù)庫收集306 例宮頸癌組織樣本、22例正常宮頸組織樣本的表達數(shù)據(jù)及患者臨床資料、隨訪數(shù)據(jù)，通過Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫對篩選出的宮頸癌輻射敏感性差異基因進行表達分析，驗證所選差異基因是否可靠。以P＜0.01 且|log2FC|＞1 作為基因差異表達的閾值，其中P＜0.01 且|log2FC|＞1 為基因在宮頸癌組織中高表達，P＜0.01且|log2FC|＜1為基因在宮頸癌組織中低表達。

1.2.2 差異基因的生存分析及關(guān)鍵差異基因篩選通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫進行生存分析，將差異基因在腫瘤中的中位數(shù)作為高、低表達的分界線，以P＜0.05 為標準，篩選不同基因表達水平對患者預(yù)后有影響的差異基因為宮頸癌輻射敏感性關(guān)鍵差異基因。

1.2.3 關(guān)鍵差異基因的預(yù)后分析 通過TCGA 數(shù)據(jù)庫及GTEx 數(shù)據(jù)庫收集宮頸癌患者臨床資料及隨訪數(shù)據(jù)，通過R 軟件“forestplot”包對數(shù)據(jù)進行單因素、多因素COX 回歸分析，驗證篩選出的關(guān)鍵差異基因是否為宮頸癌患者預(yù)后的影響因素。

1.2.4 關(guān)鍵差異基因的蛋白表達驗證 通過The Human Protein Atlas（HPA）數(shù)據(jù)庫比較篩選出的關(guān)鍵差異基因在宮頸癌以及正常宮頸組織中的蛋白表達。

1.3 宮頸癌輻射敏感性差異基因的免疫相關(guān)性分析

1.3.1 關(guān)鍵差異基因GO功能及KEGG信號通路富集分析 基于LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫通過基因集富集分析得到關(guān)鍵差異基因的GO 功能及KEGG 信號通路富集分析結(jié)果，其中GO 分析包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞成分（CC）。

1.3.2 關(guān)鍵差異基因免疫相關(guān)性分析 通過Tumor Immune Estimation Resource（TIMER）數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵差異基因在宮頸癌中的表達與免疫細胞浸潤水平的關(guān)系。通過TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)使用CIBERSORT 進行免疫評分并觀察免疫檢查點相關(guān)基因的表達情況，通過R 軟件包“ggplot2”及“pheatmap”對結(jié)果進行可視化，將關(guān)鍵差異基因與宮頸癌高度相關(guān)的免疫檢查點基因使用Spearman 進行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌輻射敏感性差異基因篩選結(jié)果GSE6213、GSE166466、GSE6791、GSE64217GSE6213數(shù)據(jù)集中分別篩選出差異基因417、2 799、2 347、4 092 個，通過韋恩圖將差異基因取交集，篩選出共同差異基因10 個，分別為HELLS、TOP2A、KIF23、TAP1、WDR76、LMNB1、RFC4、TFRC、IFI44L、IFIT3。見OSID碼圖1

2.2 宮頸癌輻射敏感性差異基因表達驗證結(jié)果表達分析結(jié)果顯示，10 個差異基因均在宮頸癌組織中高表達（OSID 碼圖2）；生存分析結(jié)果顯示，TFRC 高表達的宮頸癌患者總生存率及無病生存率低于TFRC 低表達的患者，其他差異基因高、低表達患者總生存率及無病生存率比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義（OSID 碼圖3）。故選擇TFRC 為宮頸癌輻射敏感性關(guān)鍵差異基因進行后續(xù)研究。單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，TFRC 及宮頸癌TNM 分期是宮頸癌患者預(yù)后的影響因素（OSID 碼圖4）；多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，TFRC 及宮頸癌TNM 分期是宮頸癌患者預(yù)后的獨立影響因素（OSID 碼圖5）。通過HPA 數(shù)據(jù)庫驗證TFRC 在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的蛋白表達，結(jié)果顯示TFRC 在正常宮頸組織中未檢測到，在宮頸癌組織中呈高表達（OSID碼圖6）。

2.3 宮頸癌輻射敏感性差異基因的免疫相關(guān)性分析結(jié)果 GO 功能分析顯示，TFRC 主要涉及染色體分離、RNA 定位、適應(yīng)性免疫反應(yīng)等BP（OSID 碼圖7），染色體區(qū)、核糖前體、免疫突觸等CC（OSID 碼圖8），解旋酶活性、組蛋白結(jié)合、抗原結(jié)合等MF（OSID 碼圖9）。KEGG 信號通路富集分析顯示，TFRC 主要與RNA 轉(zhuǎn)運、細胞周期、同種異體移植物排斥反應(yīng)等信號通路有關(guān)（OSID 碼圖10）。TIMER 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，宮頸癌中TFRC 表達與細胞純度呈正相關(guān)，與CD8+T 淋巴細胞呈負相關(guān)，TFRC 表達影響記憶B 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、巨噬細胞M0、靜息肥大細胞的浸潤程度（OSID 碼圖11）。Spearman 相關(guān)性分析顯示，TFRC 表達與大部分宮頸癌免疫檢測點相關(guān)基因呈負相關(guān)（OSID碼圖12）。

3 討論

目前，放射與免疫聯(lián)合治療是一種較有潛力的，可改善宮頸癌患者預(yù)后的治療方法，因此尋找宮頸癌輻射敏感性差異基因并探討其免疫功能及致病機制對宮頸癌的治療有重要意義。本研究通過生物信息學(xué)分析，篩選出了同時影響宮頸癌發(fā)生進展及輻射敏感性的關(guān)鍵差異基因TFRC。

TFRC 是一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其主要功能是與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合從而影響細胞對鐵的吸收。而細胞內(nèi)過量的鐵會誘導(dǎo)芬頓反應(yīng)，造成DNA 損傷或細胞死亡［4］。鐵死亡是一種新型的程序性細胞死亡，其特征是線粒體的改變、過量鐵的異常積累以及脂質(zhì)堆積，積累的脂質(zhì)過氧化物會損傷細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，TFRC 在宮頸癌中高表達。同時，多項研究表明，TFRC 在其他腫瘤中也存在高表達，如在神經(jīng)母細胞瘤中，TFRC 過表達并誘導(dǎo)了神經(jīng)母細胞瘤對鐵死亡的選擇性敏感［5］；在膠質(zhì)瘤中，TFR2 高表達與患者不良預(yù)后相關(guān)，且TFR2 過表達能通過促進膠質(zhì)瘤細胞中活性氧的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化促進鐵死亡［6］；在胰腺癌中，TFRC 表達水平增加且與不良預(yù)后相關(guān)［7］；在卵巢癌中，TFRC 通過上調(diào)AXIN2 表達促進卵巢癌上皮細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［8］；在結(jié)腸癌中，TFRC 高表達可促進結(jié)腸上皮細胞存活，抑制TFRC表達能增強DNA 損傷反應(yīng)，降低結(jié)腸腫瘤生長速度［9］。在宮頸癌中，TFRC 能通過影響HeLa 細胞的基因表達和選擇性剪接參與宮頸癌的進展［10］，且TFRC高表達可上調(diào)EIF4A3從而促進宮頸癌細胞的增殖［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，TFRC 表達上調(diào)對宮頸癌預(yù)后不利。但也有研究發(fā)現(xiàn)，TFRC 作為鐵代謝重要蛋白，其表達升高可以增加氧氣的運輸，改善缺氧，使HIF-α 蛋白更容易羥基化，從而抑制宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移［12］。因此，TFRC 可能通過多種機制影響宮頸癌的進展。

在TFRC 影響腫瘤細胞輻射敏感性方面，有研究表明，在人外周血B 淋巴細胞AHH-1 中，TFRC 的表達對低劑量輻射敏感［13］。而由于TFRC 可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白來參與細胞內(nèi)鐵的調(diào)節(jié)，有研究表明在三陰性乳腺癌中，沉默轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達可以減少輻射誘導(dǎo)的細胞死亡［14］；在鼻咽癌中，放療前的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平會影響鼻咽癌患者放射敏感性［15］。關(guān)于TFRC 在宮頸癌中如何影響輻射敏感性目前還缺乏研究，但推測其可能通過轉(zhuǎn)鐵蛋白影響宮頸癌的輻射敏感性，后續(xù)可以進行相關(guān)實驗進行論證。同時，本研究對TFRC 進行KEGG 信號通路富集分析顯示，TFRC 可通過影響細胞周期發(fā)揮作用，而細胞周期可能是影響輻射敏感性的重要因素之一，這也提示TFRC 能夠影響宮頸癌的輻射敏感性［16］。

在TFRC 影響免疫學(xué)效應(yīng)方面，有研究發(fā)現(xiàn)TFRC 突變會導(dǎo)致小鼠聯(lián)合免疫缺陷，提示TFRC 在適應(yīng)性免疫中具有重要作用［17］；在胰腺癌和肝細胞癌中，TFRC 與免疫細胞浸潤有關(guān)［7，18］；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，患者疾病嚴重程度與TFRC 表達相關(guān)，且體外阻斷TFRC 能降低T 淋巴細胞內(nèi)鐵攝取水平并抑制mTORC1 信號，從而導(dǎo)致T 淋巴細胞功能障礙［19］。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌中TFRC 與CD8+T淋巴細胞的浸潤有關(guān)。通過對TFRC進行GO功能分析發(fā)現(xiàn)，TFRC 可能與適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)。對TFRC 進行免疫相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TFRC 與大部分宮頸癌相關(guān)的免疫檢測點基因呈負相關(guān)，這些都提示其可在宮頸癌的免疫治療中發(fā)揮作用，但具體機制仍不明確。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TFRC 為宮頸癌輻射敏感性差異基因，其可能與適應(yīng)性免疫反應(yīng)、宮頸癌相關(guān)的免疫檢測點相關(guān)；這提示TFRC 可在宮頸癌的放射免疫治療中發(fā)揮作用，從而影響宮頸癌的進展和預(yù)后。TFRC 可以作為預(yù)測宮頸癌患者免疫放射治療效果及其預(yù)后的潛在靶點，但其具體作用機制仍需后續(xù)實驗論證。