蘿卜SCPL3 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

李紫薇，霍燕琦，徐銘婕，張文靜，劉同金

（金陵科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，南京 210000）

絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases，SCP）是一類真核生物水解酶，主要存在于真菌或植物的液泡以及動物的溶酶體中［1］。絲氨酸羧肽酶類蛋白（Serine carboxypeptidase-like proteins，SCPL）是與SCP 在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似的一類蛋白，二者同屬于SC 族羧肽酶中的S10 蛋白家族［2］。S10 蛋白家族是催化功能蛋白成熟的龐大蛋白水解酶家族，可分為溶酶體Pro-Xaa 羧肽酶、絲氨酸D-Ala-D-Ala羧肽酶、羧肽酶C、羧肽酶D 四大類酶，植物中的SCP/SCPL 蛋白基本都屬于羧肽酶C 和羧肽酶D［3］。根據(jù)氨基酸序列特征，SCP/SCPL蛋白可分為羧肽酶Ⅰ、羧肽酶Ⅱ、羧肽酶Ⅲ三大類［4］，動植物中的SCPL 蛋白多屬于羧肽酶Ⅰ和羧肽酶Ⅱ，而羧肽酶Ⅲ主要存在于植物、酵母和絲狀真菌中［5］。此外，有些SCPLs 除了具有肽酶活性外，還具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性［6］。

結(jié)構(gòu)上，SCP/SCPL 蛋白均含有高度保守的“α/β水解酶折疊”三級結(jié)構(gòu)以及獨特的拓撲結(jié)構(gòu)催化中心［7］，存在1 個與底物結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域和3 個催化作用的保守結(jié)構(gòu)域，含有多個N-糖基化位點，1 個細胞內(nèi)分泌和轉(zhuǎn)運信號肽［5］。功能上，SCP/SCPL 蛋白參與調(diào)控植物多種生理過程，主要涉及種子萌發(fā)過程中儲存蛋白的水解反應(yīng)［8］、植物創(chuàng)傷應(yīng)答反應(yīng)［9］、油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［10］、細胞程序性死亡時胞內(nèi)組分的自溶［11］、植物次生代謝物的?；揎椉皩δ婢车捻憫?yīng)［12］。

蘿卜（Raphanus sativusL.）為一年或二年生十字花科草本植物，是世界重要的蔬菜作物，具有較高的經(jīng)濟、藥用和食用等價值。但在蘿卜的生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受多種生物和非生物脅迫，嚴重影響其產(chǎn)量與品質(zhì)。發(fā)掘蘿卜抗逆性相關(guān)基因，不僅能揭示其抗性分子機制，也能加快蘿卜抗性育種進程。SCPL 蛋白在調(diào)控高等植物的多種生理過程中發(fā)揮重要作用，但蘿卜SCPL基因的功能和表達調(diào)控研究鮮見報道。本研究通過RT-PCR 技術(shù)克隆了蘿卜SCPL3（RsSCPL3）基因CDS 全長序列，并對其進行生物信息學(xué)分析，旨在為進一步開展該基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 心里美蘿卜高代自交系CCHX17-6。

1.1.2 供試試劑 RNA 提取試劑盒FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit、DL2000 Plus DNA Marker（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），KOD-Plus-Neo 高保真酶［東洋紡（上海）生物技術(shù)有限公司］，pENTR?/D-TOPO?cloning kit（Invitrogen），瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（天根生化科技有限公司），瓊脂糖、50×TAE 緩沖液、硫酸卡那霉素、瓊脂粉、LB 培養(yǎng)基［生工生物工程（上海）股份有限公司］，GelRed 核酸染料（Biosharp），DH5α 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器 MIKRO220R 型高速冷凍離心機（德國Hettich 公司），S1000TM型PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司），DYY-2C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GenoSens1880 型凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），DW-86L286 型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司產(chǎn)品），SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），HVA-85 型高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成將蘿卜自交系CCHX17-6 種植于金陵科技學(xué)院園藝實驗站，取成熟期肉質(zhì)根于液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用RNA 提取試劑盒從蘿卜肉質(zhì)根中提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與PCR 擴增根據(jù)已發(fā)表的蘿卜基因組數(shù)據(jù)［13］，設(shè)計并合成RsSCPL3基因的特異性引物SCPL-F：（5′-caccATGGCTAAGAAGTTGCTTC TGCTTC-3′）和SCPL-R：（5′-TTAGAGAGGTTGACCACTAATCCACCTC-3′）。以cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為50 μL，其中cDNA 模板3 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，酶（1U）1 μL，ddH2O 30 μL；PCR 擴增程序使用兩步法：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，68 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)。

1.2.3 目的片段的回收、載體構(gòu)建與測序 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA 回收試劑盒進行目的條帶的切膠回收，將回收產(chǎn)物連接到pENTER-TOPO 載體上，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，菌液PCR 篩選陽性進行克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）進行RsSCPL3蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析；利用ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測蛋白親疏水性；利用Signalp 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）分析信號肽；利用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預(yù)測；利用NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域；利用SPOMA（http：//www.ibcp.fr/predict.html/）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；運用MEGA 軟件構(gòu)建RsSCPL3 蛋白系統(tǒng)進化樹（Neighbor-joining法，Bootstrap 值設(shè)置為1 000）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RsSCPL3 基因克隆

以蘿卜肉質(zhì)根的cDNA 為模板，經(jīng)PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳獲得了1 500 bp 左右的目的片段（圖1）。測序結(jié)果表明，RsSCPL3基因CDS 序列大小為1 434 bp，編碼477 個氨基酸。

圖1 RsSCPL3 基因克隆

2.2 RsSCPL3 蛋白理化性質(zhì)的分析

預(yù)測RsSCPL3蛋白分子式為C2493H3762N632O709S21，相對分子質(zhì)量為54.6 kD，原子總數(shù)為7 617，理論等電點（PI）為6.33。RsSCPL3 蛋白帶負電荷殘基（Asp+Glu）為49，正電荷電殘基（Arg+Lys）為45，脂肪系數(shù)為81.30，不穩(wěn)定系數(shù)為39.26，屬于穩(wěn)定蛋白。

ProtScale 預(yù)測RsSCPL3 蛋白平均親水值為-0.227，且第9 位和第10 位的亮氨酸（Leu）表現(xiàn)最大疏水性，疏水均值為3.956，第63 位的天冬酰胺（Asn）表現(xiàn)最大親水性，分值為-3.122，說明其為親水性蛋白。

2.3 RsSCPL3 蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細胞定位

信號肽主要功能為促進蛋白質(zhì)連續(xù)進入分泌途徑并將蛋白質(zhì)運送至細胞外，本研究利用Signalp 4.1 預(yù)測RsSCPL3 蛋白具有1 個信號肽（圖2）。TMHMM 2.0 預(yù)測該蛋白存在3 個跨膜區(qū)域（圖3），WoLF PSORT 預(yù)測其最有可能定位于液泡中，在細胞外基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上也可能有分布，表明其可能為分泌蛋白。

圖2 RsSCPL3 蛋白信號肽預(yù)測

圖3 RsSCPL3 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.4 RsSCPL3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用NCBI 的Conserved Domains 工具，預(yù)測發(fā)現(xiàn)RsSCPL3 蛋白具有1 個屬于SC 族羧肽酶中的S10蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。

圖4 RsSCPL3 的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

SPOMA 預(yù)測RsSCPL3 蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其分別包含147、34、89 和207 個氨基酸，占比分別為30.82%、7.13%、18.66%和43.40%（圖5）。

圖5 RsSCPL3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 RsSCPL3 蛋白系統(tǒng)進化樹

為明確RsSCPL3 與其他植物的系統(tǒng)進化關(guān)系，利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，RsSCPL3 蛋白與甘藍型油菜（Brassica napus）、甘藍（Brassica oleracea）、芝麻菜（Eruca vesicariasubsp.sativa）、菥蓂（Thlaspi arvense）、鹽芥（Eutrema salsugineum）等十字花科植物同源蛋白聚為一類，親緣關(guān)系較近，而與苦瓜（Momordica charantia）、甜橙（Citrus sinensis）、大豆（Glycine max）、茶（Camellia sinensis）、曼陀羅（Datura stramonium）等親緣關(guān)系相對較遠（圖6）。

圖6 RsSCPL3 與其他植物同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

3 討論

SCP/SCPL基因參與調(diào)控植物的多種生理過程。擬南芥（Arabidopsis thaliana）BRI1 在油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用［14］。通過表達AtECS1可增加油菜植株的心皮數(shù)、莢果種子數(shù)以及千粒重，且ECS1也可能參與油菜素內(nèi)酯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［15］。水稻（Oryza sativaL.）GS5基因調(diào)控谷粒大小，在提高水稻產(chǎn)量方面具有重要意義［16］。煙草（Nicotiana tabacum）NtSCP1和NtSCP2基因參與調(diào)控細胞生長［17］，在植株形態(tài)發(fā)育方面起作用。豌豆（Pisum sativum）PsCP基因在種子生長發(fā)育中起重要作用［18］。

此外，SCP/SCPL基因在植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)過程中也發(fā)揮重要作用。水稻OsBISCPL1能被BTH、JA、SA、ACC 等抗病信號分子誘導(dǎo)表達，并且在水稻和稻瘟病菌的非親和性互作中上調(diào)表達［10］。干旱、鹽、ABA、MeJA 和BR 誘導(dǎo)小麥TaSCPL184-6D顯著上調(diào)表達［19］。玉米（Zea mays）Zm-SCP響應(yīng)立枯絲核菌脅迫，且ABA、JA、高鹽和低溫處理均誘導(dǎo)其上調(diào)表達［20］。赤霉素誘導(dǎo)豌豆PsCP基因上調(diào)表達，而多效唑抑制其表達［18］。黃瓜（Cucumis sativusL.）中多個SCPL基因響應(yīng)鹽脅迫和白粉病菌侵染［21］。

4 小結(jié)

本研究從心里美蘿卜中克隆出SCPL3基因并對其進行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，其分子式為C2493H3762N632O709S21，是穩(wěn)定親水性分泌蛋白，含有SC 族羧肽酶中的S10 蛋白家族結(jié)構(gòu)域，可能定位于液泡，存在1 個信號肽和3 個跨膜結(jié)構(gòu)域，與甘藍型油菜、芝麻菜等十字花科植物同源性較高。研究結(jié)果為下一步RsSCPL3基因的功能和表達調(diào)控機制研究奠定了基礎(chǔ)。