巨泌乳素與假性高泌乳素血癥實(shí)驗(yàn)室診斷路徑研究進(jìn)展

羅 薇,程歆琦,夏良裕

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 檢驗(yàn)科,北京100730)

泌乳素(prolactin,PRL)是一種肽類激素,在調(diào)節(jié)女性乳房發(fā)育和泌乳中具有重要作用,同時(shí)還有滲透調(diào)節(jié)、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等功能[1]。泌乳素的生理性增高主要見(jiàn)于運(yùn)動(dòng)、妊娠、產(chǎn)后及應(yīng)激狀態(tài)等;病理性升高時(shí)主要臨床表現(xiàn)為溢乳、閉經(jīng)和不育,見(jiàn)于垂體腫瘤、乳腺腫瘤、庫(kù)欣綜合征、肢端肥大癥、下丘腦腫瘤等。泌乳素檢測(cè)是診斷高泌乳素血癥的依據(jù),臨床實(shí)驗(yàn)室常用免疫法測(cè)定泌乳素,但是該方法常受巨泌乳素的干擾[2]而出現(xiàn)假性高泌乳素血癥,可能導(dǎo)致誤診誤治。因此,實(shí)驗(yàn)室有必要建立巨泌乳素血癥鑒別診斷的方法與路徑,識(shí)別假性高泌乳素血癥,降低臨床誤診風(fēng)險(xiǎn)。本文綜述巨泌乳素對(duì)泌乳素測(cè)定的干擾以及其實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展,以期對(duì)實(shí)驗(yàn)室建立巨泌乳素血癥診斷路徑提供幫助。

1 巨泌乳素血癥

1.1 巨泌乳素血癥的定義與發(fā)生率

泌乳素根據(jù)其結(jié)構(gòu)和分子量主要分為3種類型,即單體泌乳素、大泌乳素、巨泌乳素(macroprolactin,M-PRL)。泌乳素由于遺傳易感性或翻譯后修飾(例如糖基化、磷酸化、脫酰胺基化),導(dǎo)致其產(chǎn)生新的表位,分泌到血液后觸發(fā)了自身抗體IgG的產(chǎn)生,IgG與單體泌乳素絲氨酸殘基端結(jié)合生成巨泌乳素[3],分子量可達(dá)150 kDa甚至更高。正常人體內(nèi)60%～90%為單體泌乳素,15%～30%為大泌乳素,巨泌乳素含量一般<10%[4]。巨泌乳素血癥(macroprolactinemia)是指外周血單體催乳素水平正常,大量泌乳素與IgG結(jié)合生成過(guò)量的巨泌乳素。如果未被發(fā)現(xiàn),可能會(huì)導(dǎo)致誤診和管理不當(dāng)。研究顯示,在一般人群中,巨泌乳素血癥的總體患病率在3%～4%之間,但在高泌乳素血癥的患者中顯著增加,最高可達(dá)35%[1]。在英國(guó)和美國(guó)檢測(cè)的所有高泌乳素血癥病例中有5%～15%可能是由于巨泌乳素血癥引起的[5]。巨泌乳素血癥在女性中較為常見(jiàn),但是男性和兒童中也會(huì)出現(xiàn)巨泌乳素血癥。DONADIO等[6]回顧性研究發(fā)現(xiàn)在24名高泌乳素血癥男性中有11人(45.8%)存在巨泌乳素血癥。

1.2 巨泌乳素血癥的臨床特點(diǎn)

巨泌乳素血癥的出現(xiàn)與許多生理和病理狀況有關(guān),包括壓力、懷孕、劇烈運(yùn)動(dòng)、垂體腺瘤和癌癥以及對(duì)乳房的機(jī)械刺激、胸壁外傷、肝腎疾病、原發(fā)性甲狀腺功能減退、顱內(nèi)腫瘤壓迫垂體或下丘腦、空蝶鞍綜合征、用泌乳素刺激藥物等[7]。GIBNEY等[8]回顧了310例巨泌乳素血癥患者的臨床特征,發(fā)現(xiàn)0～45%的患者有溢乳癥狀,6%～40%的患者有不育癥,15%～80%的患者有月經(jīng)量少或閉經(jīng)癥狀。但是并沒(méi)有直接證據(jù)顯示這些癥狀是由巨泌乳素引起的。同時(shí),閉經(jīng)和溢乳在巨泌乳素血癥患者中的發(fā)生率(57%和29%)明顯低于真正的高泌乳素血癥的患者中的發(fā)生率(84%和63%)。由于部分巨泌乳素血癥患者的癥狀與高泌乳素血癥相似,最初被發(fā)現(xiàn)患有高泌乳素血癥,但在隨訪和進(jìn)一步診治中發(fā)現(xiàn)其排卵或自發(fā)受孕,最后確診是巨泌乳素血癥。

因此,巨泌乳素的生物學(xué)活性很低,通常無(wú)明顯臨床癥狀,除非患者自身抗體IgG與泌乳素之間發(fā)生間歇性解離,才會(huì)由于單體泌乳素的增加而表現(xiàn)出明顯的高泌乳素的臨床癥狀。也有部分巨泌乳素血癥的患者表現(xiàn)出和高泌乳素血癥相一致的臨床癥狀,是由于巨泌乳素血癥患者伴有單體泌乳素的增高所導(dǎo)致。美國(guó)臨床內(nèi)分泌學(xué)家協(xié)會(huì)和美國(guó)內(nèi)分泌疾病學(xué)會(huì)推薦,當(dāng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)發(fā)現(xiàn)和/或?qū)χ委煹姆磻?yīng)不一致時(shí)應(yīng)考慮巨泌乳素血癥的存在[9]。因此,在所有高泌乳素血癥的患者中,特別是在缺乏癥狀的患者中,建議實(shí)驗(yàn)室常規(guī)篩查巨泌乳素。

2 巨泌乳素對(duì)泌乳素檢測(cè)的干擾

2.1 泌乳素的檢測(cè)

高泌乳素血癥由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性,診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室對(duì)泌乳素含量的測(cè)定。目前實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血清泌乳素主要采用免疫學(xué)方法,通常采用兩點(diǎn)法或夾心法原理。待測(cè)泌乳素分別與固相上的捕獲抗體和用于檢測(cè)的標(biāo)記抗體發(fā)生反應(yīng),形成捕獲抗體-泌乳素-標(biāo)記抗體復(fù)合物。通過(guò)洗滌步驟去除未反應(yīng)的試劑后,標(biāo)記抗體產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與泌乳素的濃度直接相關(guān)。該方法可以在很寬的濃度范圍內(nèi)提供快速、精確的結(jié)果,并且在外部質(zhì)量評(píng)估方案中顯示出很好的方法一致性。盡管大多數(shù)泌乳素免疫測(cè)定方法已按照世界衛(wèi)生組織的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化,但各個(gè)平臺(tái)檢測(cè)泌乳素仍存在一定的差異,泌乳素參考范圍取決于測(cè)定平臺(tái)且差異很大,可能與檢測(cè)抗體對(duì)泌乳素不同表位的反應(yīng)性差異有關(guān)[10]。

值得注意的是所有免疫測(cè)定法都容易受到異嗜性抗體的干擾,制造商通常會(huì)添加“封閉劑”以最大程度地減少此類干擾。在目前的泌乳素免疫測(cè)定中,雖然異源抗體的干擾非常罕見(jiàn),但巨泌乳素的干擾很常見(jiàn),導(dǎo)致高泌乳素血癥的誤診,可能引發(fā)進(jìn)一步甚至不適當(dāng)?shù)闹委煛?/p>

2.2 巨泌乳素干擾檢測(cè)的原理

通常情況下巨泌乳素都是單體泌乳素和IgG的復(fù)合物,少數(shù)情況下,巨泌乳素是被高度糖基化的異常高分子量形式(200～669 kDa),但這類泌乳素特征與常見(jiàn)的泌乳素-IgG復(fù)合物形式相似,都具有單體泌乳素的抗原表位,因此巨泌乳素保留了許多商業(yè)化免疫測(cè)定中使用的抗泌乳素抗體的部分(或全部)免疫反應(yīng)性,在使用免疫法進(jìn)行泌乳素測(cè)定時(shí),巨泌乳素會(huì)與捕獲抗體和標(biāo)記抗體發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生信號(hào);另外一方面,IgG和單體泌乳素形成的復(fù)合物具有比單體泌乳素更長(zhǎng)的半衰期[7],會(huì)造成巨泌乳素在血中的聚集,從而導(dǎo)致泌乳素水平的測(cè)值升高。

2.3 不同檢測(cè)平臺(tái)受干擾現(xiàn)狀

由于不同檢測(cè)平臺(tái)所使用的反應(yīng)抗體有所不同,同時(shí)巨泌乳素的空間結(jié)構(gòu)有差異,巨泌乳素雖然在不同檢測(cè)平臺(tái)的泌乳素免疫測(cè)定中都會(huì)發(fā)生反應(yīng),但是反應(yīng)程度不同[6]。SMITH等[11]利用目前使用較為廣泛的9種泌乳素免疫測(cè)定法評(píng)估含有巨泌乳素血清的反應(yīng)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同方法測(cè)定結(jié)果有2.3～7.8倍的差異,并且所有結(jié)果均高于對(duì)單體泌乳素濃度的估計(jì)。對(duì)于當(dāng)前泌乳素的主要檢測(cè)平臺(tái),Tosoh AIA對(duì)于巨泌乳素的反應(yīng)最強(qiáng)烈,西門子Centaur、貝克曼 Access和羅氏 Elecsys相對(duì)較弱。KELLY等[12]使用目前的參考范圍和嚴(yán)格的巨泌乳素血癥定義,通過(guò)兩種不同的測(cè)定系統(tǒng)診斷巨泌乳素血癥,使用Tosoh AIA分析,在3 101個(gè)連續(xù)的常規(guī)樣本中有670個(gè)表現(xiàn)出高泌乳素,其中165例(24.6%)確診為巨泌乳素血癥。當(dāng)用反應(yīng)性較低的Roche Elecsys Ⅱ測(cè)定法重新測(cè)定高泌乳素血癥樣品時(shí),只有79例(11.8%)確診為巨泌乳素血癥。HATTORI等[13]研究發(fā)現(xiàn)抗泌乳素自身抗體可識(shí)別人泌乳素N和C末端殘基上的表位。泌乳素測(cè)定中的反應(yīng)性不同可能是因?yàn)榫廾谌樗氐淖陨砜贵w在不同程度上掩蓋了免疫測(cè)定捕獲或檢測(cè)抗體靶向的表位[14]。

雖然在不同檢測(cè)系統(tǒng)上巨泌乳素的反應(yīng)性有所不同,但是聯(lián)合多平臺(tái)檢測(cè)并不能提高巨泌乳素的檢出率。一項(xiàng)回顧性研究選取了70例高泌乳素血癥患者分別在雅培I 2000和貝克曼系統(tǒng)檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雅培I 2000檢出巨泌乳素血癥29例,貝克曼檢出巨泌乳素血癥20例,兩系統(tǒng)同時(shí)判定巨泌乳素血癥15例,聯(lián)合檢測(cè)檢出率與二者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可見(jiàn)聯(lián)合檢測(cè)并不能提高巨泌乳素的檢出率,而會(huì)提高檢測(cè)成本[15],更重要的是選擇合適的巨泌乳素檢測(cè)方法,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室高泌乳素血癥的診斷流程。

3 巨泌乳素的測(cè)定方法

選擇合適的巨泌乳素測(cè)定方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)室巨泌乳素的篩查具有重要意義。測(cè)定巨泌乳素的參考方法是色譜法,文獻(xiàn)報(bào)道一種利用高效液相色譜(HPLC)的方法,通過(guò)超濾去除巨泌乳素再進(jìn)行血清泌乳素的測(cè)定,具有常規(guī)適用性[16]。聚乙二醇沉淀法是目前應(yīng)用較多的檢測(cè)方法,此外還有蛋白質(zhì)A/G色譜柱或125I泌乳素結(jié)合劑法。

3.1 凝膠過(guò)濾色譜法

凝膠過(guò)濾色譜法(Gel filtration chromatography,GFC)被認(rèn)為是巨泌乳素測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)和參考方法,這是一種基于體積差異的分離方法。固定相由一列多孔珠組成,孔徑范圍明確。它具有分餾范圍,可以分離該分子量范圍內(nèi)的分子。足夠小的蛋白質(zhì)可以通過(guò)珠子的孔內(nèi),并被稱為“內(nèi)含物”。這些較小的蛋白質(zhì)可接近珠粒內(nèi)部的流動(dòng)相以及珠粒之間的流動(dòng)相,最后在凝膠過(guò)濾分離中洗脫,太大而不能塞入珠孔的蛋白質(zhì)被排除在外,只能進(jìn)入微珠之間的流動(dòng)相,因此首先洗脫。將含有巨泌乳素的樣品用此類色譜柱時(shí),巨泌乳素將首先洗脫,然后是大泌乳素和單體泌乳素,當(dāng)巨泌乳素線下的面積大于泌乳素洗脫總面積的30%時(shí),即巨泌乳素陽(yáng)性[17]。GFC法不僅可以測(cè)定所有形式的泌乳素,而且可以估算其分子量,但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且成本較高,應(yīng)用受到一定的限制,通常不適合常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室。

3.2 聚乙二醇沉淀法

目前應(yīng)用最為廣泛的是聚乙二醇(poly-ethylene-glycol,PEG)沉淀法,PEG沉淀法是將待測(cè)血清與25%PEG混合后,孵育一定時(shí)間,然后離心沉淀巨泌乳素復(fù)合物,取離心后的上清液測(cè)定泌乳素,和未處理的血清樣品泌乳素測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。一般認(rèn)為PEG沉淀后回收率≤40%是診斷巨泌乳素血癥的標(biāo)準(zhǔn)。但是有研究[18]認(rèn)為此標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷,因?yàn)樗鼰o(wú)法識(shí)別出以巨泌乳素為主要形式但同時(shí)單體泌乳素也升高的情況,而這一情況更具有病理意義。因此目前有兩種方式報(bào)告巨泌乳素血癥的存在即PEG沉淀后回收率或PEG沉淀后泌乳素濃度,用回收率診斷多認(rèn)為≤40%或≤60%時(shí)存在巨泌乳素血癥,使用回收率≤60%的標(biāo)準(zhǔn)可檢測(cè)到更多的巨泌乳素血癥患者[19]。但是當(dāng)巨泌乳素與高濃度的單體泌乳素同時(shí)發(fā)生時(shí),推薦同時(shí)使用PEG沉淀前后的泌乳素濃度作為參考,防止漏診或誤診。

PEG沉淀法簡(jiǎn)單、快速且成本較低,同時(shí)還可以用于檢測(cè)類似的由于內(nèi)源抗體與測(cè)定試劑反應(yīng)而產(chǎn)生的干擾。但值得注意的是該方法的特異性有限,部分單體泌乳素可能與免疫球蛋白共沉淀,使回收率降低,特別是在血清球蛋白濃度升高疾病(單克隆丙種球蛋白病或多克隆性高丙種球蛋白血癥)患者中可能造成假性巨泌乳素血癥的錯(cuò)誤診斷[20]。

3.3 巨泌乳素檢測(cè)方法的選擇

目前常用的巨泌乳素檢測(cè)方式每一種都有其優(yōu)勢(shì)和不足。KAVANAGH等[21]用41例巨泌乳素血癥患者血清比較了幾種檢測(cè)巨泌乳素的方法的特異性和臨床實(shí)用性,研究發(fā)現(xiàn)所有預(yù)處理血清中的泌乳素殘留濃度與GFC后獲得的單體濃度均有不同,但是PEG沉淀法與GFC法一致性最高,因此雖然所檢查的方法均未產(chǎn)生與GFC方法相同的結(jié)果,但PEG預(yù)處理產(chǎn)生的結(jié)果最好,被推薦作為GFC的首選替代方法。目前聚乙二醇沉淀廣泛用于檢測(cè)巨泌乳素,并且可以用于檢測(cè)類似的大分析物以及由于內(nèi)源抗體與測(cè)定試劑反應(yīng)而產(chǎn)生的干擾[22]。

4 巨泌乳素血癥實(shí)驗(yàn)室診斷路徑

診斷高泌乳素血癥必須根據(jù)已知原因進(jìn)行鑒別診斷,尤其是巨泌乳素導(dǎo)致的高泌乳素血癥。如果存在巨泌乳素血癥,單體催乳素的濃度是正常的,則無(wú)需其他進(jìn)一步檢查。僅憑臨床表現(xiàn)無(wú)法將巨泌乳素血癥和真正的泌乳素過(guò)多癥區(qū)分,因此需要基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的解決方案,建立巨泌乳素血癥的實(shí)驗(yàn)室診斷路徑,見(jiàn)圖1。包括受干擾樣本的篩選,選擇適合巨泌乳素測(cè)定方法,設(shè)定PEG沉淀后單體泌乳素的參考范圍和報(bào)告方式。

圖1 PEG沉淀法篩查巨泌乳素血癥診斷路徑圖

4.1 受干擾樣本的篩選

高泌乳素血癥診斷指南建議對(duì)所有無(wú)癥狀高泌乳素血癥患者進(jìn)行巨泌乳素血癥檢測(cè)[23]。但是由于部分巨泌乳素血癥患者經(jīng)常伴有高泌乳素的臨床癥狀,會(huì)導(dǎo)致誤診漏診,進(jìn)行不必要的進(jìn)一步診治,因此建議對(duì)所有高于參考上限的進(jìn)行巨泌乳素血癥的篩查[24]。MILICA等[25]研究發(fā)現(xiàn)將臨界值從制造商的參考上限提高到32.9 μg/L并不會(huì)明顯改變巨泌乳素血癥的檢出率;若臨界值提高至47.0 μg/L會(huì)使超半數(shù)巨泌乳素血癥患者被漏診。因此研究建議根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室免疫測(cè)定平臺(tái)的不同,建立自己的篩查臨界值,同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)于隨訪患者1年內(nèi)巨泌乳素變化差異不大的,可不再進(jìn)行重復(fù)篩查。

4.2 檢測(cè)流程與臨床報(bào)告

實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)著重于對(duì)具有生物活性的泌乳素即單體泌乳素的測(cè)定,這可以為臨床醫(yī)生提供最有用的信息。PEG沉淀后的泌乳素濃度提供了生物活性單體泌乳素的相對(duì)準(zhǔn)確的量度。但是由于各個(gè)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于泌乳素的反應(yīng)性不同,因此應(yīng)設(shè)定單體泌乳素特定的參考區(qū)間,才可有效減少假性高泌乳素的發(fā)生。建立實(shí)驗(yàn)室巨泌乳素檢測(cè)的篩查流程,設(shè)置特定的巨泌乳素參考范圍及診斷標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于為臨床提供準(zhǔn)確的單體泌乳素濃度具有重要意義。MILICA等[25]進(jìn)行了1項(xiàng)回顧性研究,巨泌乳素血癥由PEG沉淀后回收百分率和PEG沉淀后的泌乳素濃度診斷,通過(guò)對(duì)1 136例患者在羅氏cobas e601上PEG沉淀前后泌乳素濃度的測(cè)定,建立了實(shí)驗(yàn)室巨泌乳素診斷路徑,如圖1所示。在報(bào)告結(jié)果時(shí)應(yīng)同時(shí)報(bào)告PEG沉淀后回收百分率和PEG沉淀后的泌乳素濃度,并注明實(shí)驗(yàn)室PEG沉淀后單體泌乳素的參考區(qū)間,有助于臨床醫(yī)生對(duì)于巨泌乳素血癥的診斷,有效減少假性高泌乳素血癥的誤診和誤治。

綜上所述,巨泌乳素是免疫法泌乳素中最常見(jiàn)的干擾因素。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)為所有高泌乳素血癥病例引入篩查流程,建立篩查方法,設(shè)定自己的巨泌乳素參考范圍及診斷標(biāo)準(zhǔn)。