超聲輔助醇沉法制備淀粉納米顆粒同步包埋葉黃素

史永桂，姚先超，焦思宇，劉 鑫，廖如杏，林日輝

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 廣西多糖材料與改性重點實驗室 林產(chǎn)化學(xué)與工程國家民委重點實驗室廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室/協(xié)同創(chuàng)新中心 南寧 530006）

葉黃素，分子式C40H56O2，是胡蘿卜素中的一種，主要存在于綠色蔬菜和萬壽菊中，具有多種生物活性功能，是天然的食品著色劑和抗氧化劑[1]。在預(yù)防動脈粥樣硬化、癌癥和神經(jīng)性損傷以及延緩衰老等方面具有重要的影響[2-3]。Fred等[4]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素可激活人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，有效預(yù)防白內(nèi)障等眼疾。馬曉雨[2]在大米蛋白與葉黃素構(gòu)建的納米級輸送體系中發(fā)現(xiàn)，每日葉黃素攝入量在18 mg，不會產(chǎn)生任何不良反應(yīng)且無任何毒副作用，這為葉黃素的體內(nèi)給藥提供了可靠的理論參考。Wallace等[5]也發(fā)現(xiàn)，人體口服10 mg/d 葉黃素，可顯著降低老年黃斑的形成，可見葉黃素在醫(yī)藥和食品添加劑方面的應(yīng)用可行。然而，葉黃素是一種長脂鏈、含兩個酮環(huán)的分子，水溶性差，對給藥及人體有效吸收帶來困難；且分子中具有多個共軛雙鍵，易被氧化破壞，穩(wěn)定性差[6]。為了進一步提高葉黃素在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用，研發(fā)適宜載體對葉黃素進行包埋或負載是有效的技術(shù)途徑，特別是使用生物相容性好、可降解的納米級天然產(chǎn)物材料作為載體[7]。

淀粉作為一種天然的高分子材料，在藥物載體方面有廣泛的應(yīng)用，其中納米淀粉（Nanometer starch，SNPs）是將天然淀粉經(jīng)物理或化學(xué)方法制備成顆粒小于1 μm 的淀粉顆粒，因具有較小的粒徑和較大的比表面積且能在藥物傳遞系統(tǒng)中表現(xiàn)出良好的藥物結(jié)合能力和有效釋放吸收而受到關(guān)注[8]。劉占軍等[9]制備了SNPs，并與疏水性藥物蝦青素（類胡蘿卜素）混合制成蝦青素納米粒，研究蝦青素納米粒在不同的溫度、pH 值、不同的光照條件下蝦青素的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在不同條件下蝦青素的穩(wěn)定性有所提高，其中光照條件下的保留率相比丙酮溶液提高了58.1%。寇宗亮等[10]將SNPs 置于姜黃素（疏水性藥物）的醇溶液中，通過物理吸附制成SNPs-姜黃素，結(jié)果表明：相比姜黃素原料藥，SNPs-姜黃素在5 h 的緩釋由95%降至15%，具有明顯的緩釋效果，且提高了姜黃素的生物活性。Narayanan等[11]采用交聯(lián)沉淀法制備平均粒徑為160 nm 的羥乙基淀粉納米顆粒，在沉降過程包埋兩種疏水性分子——吲哚美辛和布洛芬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包埋后的納米顆粒在體外血液/細胞環(huán)境中均表現(xiàn)出比原料藥更好的細胞通透性，表明淀粉納米載體在控制藥物傳遞中的潛力。綜上可知，納米級淀粉顆粒在食品和藥物輸送體系中能有效提高疏水性分子的生物利用度和穩(wěn)定性。

醇沉法操作簡單，將糊化淀粉乳通入乙醇溶液，在溶劑置換過程中經(jīng)攪拌剪切可產(chǎn)生SNPs，是制備SNPs 的主要方法之一[12]。馮濤等[13]對淀粉糊化過程的研究表明，糊化后淀粉多聚糖鏈由雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋成一種具有疏水性的、空腔和親水性外部的單螺旋結(jié)構(gòu)，這種疏水性空腔可與疏水性分子形成穩(wěn)定的包合物，這是淀粉負載疏水性分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Arvisenet等[14]將己酸乙酯和乙酸異戊酯芳香化合物加入糊化淀粉中，研究其對風(fēng)味化合物的作用，結(jié)果表明糊化的淀粉可與芳香化合物形成包合物，對芳香化合物的保留有顯著得影響。Zhu等[15]研究了糊化后淀粉與小分子萘酚的絡(luò)合作用，結(jié)果表明：直鏈淀粉含量與萘酚的絡(luò)合指數(shù)呈正相關(guān)。Tan等[16]研究了SNPs 在乙醚溶液中對疏水性藥物芘的負載過程，熒光光譜分析表明芘逐漸在SNPs 表面轉(zhuǎn)移向內(nèi)部，說明SNPs 內(nèi)部存在極性較低的區(qū)域，與芘發(fā)生較強的疏水相互作用。由此可初步判斷，糊化后淀粉顆粒中的淀粉分子鏈和SNPs 的內(nèi)部非極性區(qū)域?qū)κ杷运幬锞哂幸欢ǖ陌窈拓撦d作用。本文擬在SNPs 沉降過程中同步完成對疏水性藥物葉黃素的包埋。之前，本課題組已成功進行SNPs 對小分子疏水性藥物山奈酚的包埋負載，包埋率可達62.94%[17]。為進一步研究SNPs 對長鏈大分子疏水性藥物的包埋負載，本文選擇葉黃素為模型分子，在SNPs 制備過程中同步完成對葉黃素的包埋，并對SNPs-葉黃素進行表征，為SNPs 用于疏水性藥物的負載提供參考。

圖1 醇沉法同步包埋葉黃素原理圖Fig.1 Schematic diagram of simultaneous embedding of lutein by alcohol precipitation method

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯淀粉（純度95%以上，直鏈淀粉含量10%），食品級，廣西岑溪市三角淀粉責(zé)任有限公司；葉黃素BR（純度80%），阿拉丁試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼BR，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

超聲波細胞粉碎機（JY92-IIN），寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍干燥機（FD-A10N-50），上海皓莊儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（UV23II），上海天美科學(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet is10），美國賽默飛世爾科技公司；X-射線衍射儀（MiniFlex600），日本理學(xué)公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SUPRA 55 Sapphire），德國卡爾蔡司公司；納米激光粒度及電位分析儀（Nicomp380ZLS），美國PSS 粒度儀公司。

1.3 方法

1.3.1 SNPs-葉黃素制備 參考Hu等[18]配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的淀粉分散液，置恒溫磁力攪拌器中以冷凝器進行回流，在90 ℃恒溫1 h 至淀粉完全糊化。將糊化淀粉液于超聲波細胞粉碎機中以功率600 W 超聲處理10 min，降低黏度。將低黏度淀粉液8 000 r/min 離心5 min，取上清液，即淀粉乳。在超聲波運行條件下，將1，3，5，10 mL 葉黃素溶液（質(zhì)量濃度0.5，1.0，2.0，3.0 mg/mL ）分別通入處于超聲波細胞粉碎機下的10 mL 淀粉乳中，得葉黃素與SNPs 混合液。8 000 r/min 離心5 min，取沉淀，冷水沖洗，置-20 ℃冰箱冷凍10 h，最后于-45℃冷凍干燥至恒重，制得SNPs-葉黃素顆粒。

參考上述步驟分別制備4%，5%，6%淀粉乳溶液，將5 mL 葉黃素溶液（0.5，1.0，2.0，3.0 mg/mL）分別通入10 mL 淀粉乳中，得葉黃素與SNPs混合液。離心，冷凍干燥至恒重，得SNPs-葉黃素顆粒。

1.3.2 葉黃素含量分析 采用紫外分光光度計法波長445 nm 處SNPs 對葉黃素的包埋量[19]。以葉黃素質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.13X-0.037（R2=0.9985）。取1.3.1節(jié)制備的葉黃素與SNPs 的混合溶液，12 000 r/min 離心5 min，取上清液，量取體積V1（mL）。用紫外分光光度計測定吸光度，計算得到葉黃素上清液質(zhì)量濃度C1（mg/mL），計算被包埋的葉黃素質(zhì)量為M葉黃素（g），稱量冷凍干燥至恒重的SNPs-葉黃素質(zhì)量為M（g）。包埋量計算公式：

1.3.3 場發(fā)射掃描電鏡觀察（SEM）用毛細管取少量的SNPs-葉黃素均勻撒到雙面導(dǎo)電膠上，輕輕吹去多余的浮樣，置真空鍍膜儀下噴鍍鈀金，制成電鏡觀察樣品，在掃描電鏡下20 000 倍拍照觀察。

1.3.4 粒徑檢測（DLS）取適量樣品溶于冷超純水中制得混合懸濁液，在冰浴條件下，將混合液在超聲波細胞粉碎機中超聲分散10 s。取適量分散液放入比色皿中，設(shè)定儀器參數(shù)，溫度25 ℃、水折射率1.33、淀粉折射率1.53，在此條件下測量粒度[20]。

1.3.5 X-射線衍射檢測（XRD）用XRD 測定結(jié)晶性。設(shè)置測定條件：電壓40 kV，電流20 mA，使用單色Cu-kα 射線和Ni 片濾波，以0.02°為掃描步長，以4°/min 為掃描速率，以4°～40°為2θ 的掃描范圍[21]。

1.3.6 傅里葉紅外光譜檢測（FT-IR）將SNPs-葉黃素、葉黃素、SNPs 樣品與KBr 按1∶50 比例均勻研磨，取適量混合粉末壓成透明薄片，用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1掃描范圍測定紅外光譜。

1.3.7 碘-淀粉絡(luò)合物UV 分析 為研究葉黃素與淀粉形成的復(fù)合物，根據(jù)復(fù)合指數(shù)（CI）評價淀粉與碘的結(jié)合能力強弱[22]。在90℃，將SNPs-葉黃素在去離子水中糊化成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的淀粉乳。冷卻至室溫后取1 mL 淀粉乳，用去離子水定容25 mL，攪拌均勻，8 000 r/min 離心5 min，得上清液。將10 mL 上清液和0.1 mL 碘液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0% KI 和1.3% I2分散到去離子水中）混勻，靜置5 min。以SNPs 為對照組，在690 nm 處測定吸光值，在300～900 nm 范圍掃描波長。CI 計算公式：

式中：ASNPs——SNPs 吸光度；ASNPS-葉黃素——SNPs-葉黃素吸光度。

1.3.8 抗氧化活性的測定 根據(jù)先前報道[23]的方法并稍作修改，以對DPPH 自由基清除率評價SNPs-葉黃素的抗氧化活性。采用無水乙醇配制50 μg/mL DPPH 溶液。取10 mg SNPs-葉黃素和0.5 mL 1 mg/mL 葉黃素溶液加入10 mL DHHP 溶液中，在血液混凝器上避光混合10，20，40，60，120 min。離心取上清液，用紫外分光光度計波長515 nm 處測定樣品的吸光度。以不加DPPH 的SNPs-葉黃素的乙醇溶液作對照組，DPPH 乙醇溶液作空白。計算DPPH 的自由基清除率D（%）：

式中：A空白——DPPH 乙醇溶液吸光度；A樣品——SNPs-葉黃素吸光度；A對照——未加DPPH 的SNPs-葉黃素的乙醇溶液。

1.3.9 貯藏穩(wěn)定性的測定 SNPs-葉黃素在冷藏（5 ℃）、室溫（25 ℃）、升溫（50 ℃）條件下分別避光儲存1～30 d。定時取0.5 g 不同貯藏條件下的SNPs-葉黃素分散在10 mL 去離子水中，加入5 mL 1 mol/L NaOH 混合，在55 ℃下持續(xù)攪拌1 h。將混合液冷卻至室溫，用1 mol/L HCl 中和至pH 7.0。向中性溶液中加入10 mL 乙酸乙酯，持續(xù)劇烈攪拌萃取葉黃素，直至水相為無色，分離上層得葉黃素乙酸乙酯溶液。將上層葉黃素乙酸乙酯溶液與5 mL 飽和NaCl 溶液混合去除乙酸乙酯中微量水分，分層即得葉黃素乙酸乙酯溶液[24]。按照1.3.2 節(jié)步驟，用紫外分光光度計計算葉黃素含量。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 所有試驗重復(fù)3 次，使用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)統(tǒng)計和線性相關(guān)進行分析。采用Origin 2018 繪圖，Photoshop 對圖片進行排版。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs-葉黃素制備

表1 顯示淀粉納米顆粒對葉黃素的包埋率和包埋量與葉黃素溶液體積和濃度的關(guān)系。SNPs-葉黃素包埋量隨葉黃素濃度的增加而增加，這是因為淀粉分子鏈的單螺旋內(nèi)腔與葉黃素會發(fā)生絡(luò)合作用，在沉降體系中，隨葉黃素濃度的升高，葉黃素分子與淀粉分子鏈空腔結(jié)合的幾率增大，更多的葉黃素分子與空腔結(jié)合，生成的絡(luò)合物量增加[22]。此外，體系內(nèi)較多游離的葉黃素分子也與淀粉分子鏈交聯(lián)在一起，隨沉降過程被包裹在淀粉納米顆粒內(nèi)部，使淀粉納米顆粒對葉黃素的包埋量提高[25]。當(dāng)葉黃素質(zhì)量濃度增到2 mg/mL 時，包埋量增加不明顯，此時，淀粉分子鏈與葉黃素分子的結(jié)合位點趨于飽和，包埋量達到最高（63.86 mg/g）。相比Fu等[24]研究淀粉納米顆粒對葉黃素的最高包埋量為13.2 mg/g 顯著提高。而包埋率隨葉黃素濃度的增加而減小，這歸結(jié)于乙醇溶液體積一定，可沉降淀粉的質(zhì)量保持恒定，淀粉沉降體系中淀粉分子鏈與葉黃素的結(jié)合位點保持恒定，因此在高濃度葉黃素溶液中，沉降過程中較多的葉黃素溶解在乙醇中，導(dǎo)致葉黃素包埋率下降。

表1 3%淀粉乳對葉黃素的包埋量和包埋率Table 1 The embedding amount and embedding rate of lutein in 3% starch milk

值得注意的是，葉黃素的酮環(huán)結(jié)構(gòu)決定其疏水性較強，難溶于水，可溶于乙醇，因此葉黃素醇溶液與淀粉乳體積比對包埋量也有較大的影響[26]。當(dāng)葉黃素醇溶液體積增加時，包埋量逐漸降低，歸結(jié)于在乙醇溶液通入淀粉乳中時，增加乙醇溶液使淀粉分子鏈對葉黃素的絡(luò)合能力降低，形成的絡(luò)合物減少，且淀粉沉降時較多的葉黃素溶解在乙醇中，不能將其包裹在顆粒內(nèi)部，包埋量下降。然而，隨著乙醇體積的增加，沉降體系中更多的淀粉納米顆粒沉降出來，提高了葉黃素包埋率。

在沉降過程中，較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3%）的淀粉乳，雖然包埋量較高，但是SNPs-葉黃素得率和葉黃素包埋率并不理想，為獲得較高的SNPs-葉黃素得率，采用提高淀粉乳濃度的方法。SNPs-葉黃素的包埋率和包埋量與淀粉乳濃度的關(guān)系見表2。SNPs-葉黃素中葉黃素包埋量隨淀粉乳濃度的增大而減小，這是因為沉降體系中較高濃度的淀粉乳沉降時，淀粉納米顆粒中葉黃素的含量下降，降低了SNPs-葉黃素中葉黃素的含量。而較高濃度的淀粉乳，使更多的淀粉分子鏈與葉黃素分子結(jié)合，更多的葉黃素隨著淀粉納米顆粒的沉降被包埋到顆粒內(nèi)部，使SNPs-葉黃素對葉黃素的包埋率顯著提高。當(dāng)?shù)矸廴橘|(zhì)量濃度5%時包埋率提高至62.45%，而淀粉乳濃度再升高包埋率不再明顯提高。此時，部分葉黃素存留乙醇中，而淀粉分子鏈親和力不足以將葉黃素從乙醇中奪取并置換出來，包埋率增加不明顯。

表2 不同淀粉乳濃度對葉黃素包埋量和包埋率影響Table 2 The influence of different starch milk concentration on the embedding amount and embedding rate of lutein

綜上所述，通過優(yōu)化葉黃素濃度、淀粉乳濃度和葉黃素乙醇溶液添加量，可以制備出較高的包埋量和較高的包埋率的SNPs-葉黃素納米顆粒，提高葉黃素的利用率。

2.2 SEM 分析

木薯淀粉顆粒主要呈圓形和少許不規(guī)則形，顆粒的尺寸為微米級[27]。由圖2 可知，經(jīng)沉降法制備的SNPs 和SNPs-葉黃素的形貌和尺寸改變較大。形成納米級別的淀粉顆粒，顆粒均保持圓形或橢圓形，尺寸分布較均勻。對比SNPs 可知，SNPs-葉黃素顆粒仍具有良好的結(jié)構(gòu)完整性，添加表明葉黃素不會影響沉降過程中淀粉顆粒的形成。這與Yuan等[28]在研究玉米醇溶蛋白納米顆粒對葉黃素包埋時，葉黃素添加量對蛋白納米顆粒的形貌和結(jié)構(gòu)沒有影響的結(jié)果相似。

圖2 SNPs 和SNPs-葉黃素的SEM圖Fig.2 SEM images of SNPs and SNPs-lutein

2.3 DLS 分析

圖3 為SNPs 和SNPs-葉黃素在去離子水中的尺寸分布圖。制備的顆粒尺寸分布較集中，主峰均在200～600 nm 之間，表明成功制備納米級淀粉顆粒，印證了SEM 的結(jié)果。

圖3 SNPs 和SNPs-葉黃素的DLS圖Fig.3 DLS images of SNPs and SNPs-lutein

相對SNPs 的單峰尺寸分布，SNPs-葉黃素的粒徑出現(xiàn)增大的趨勢，可能是淀粉分子鏈與葉黃素形成絡(luò)合物后增加了淀粉分子鏈的極性，增強了淀粉分子鏈間的氫鍵作用力，從而在沉降過程中更多的淀粉分子鏈發(fā)生聚合，形成的淀粉顆粒尺寸偏大，粒徑較大。這與Fu等[24]在淀粉納米顆粒制備過程中添加疏水性藥物分子，也發(fā)現(xiàn)淀粉納米顆粒尺寸增大的結(jié)果相似。SNPs-葉黃素顆粒產(chǎn)生兩個峰，根據(jù)納米顆粒的沉降過程推測，尺寸分布中較小的峰，可能是純淀粉顆粒。

2.4 XRD 分析

圖4 顯示不同包埋量的SNPs-葉黃素納米顆粒的X 射線衍射圖。經(jīng)沉降法制備的SNPs 的A型特征峰消失，衍射峰為大包峰，為無定型結(jié)晶[29]。而同步包埋的SNPs-葉黃素的衍射峰隨包埋量的增加出現(xiàn)差異。包埋量為14.57 mg/g 的SNPs-葉黃素衍射峰仍為大包峰，未顯示特征峰，這可能是因為包埋量太低，主要衍射峰仍為SNPs衍射峰。當(dāng)包埋量增至33.4 mg/g 時，SNPs-葉黃素在13.1 和20.9 產(chǎn)生新的特征衍射峰。據(jù)前人研究表明，該處衍射峰為V 型淀粉結(jié)構(gòu)特征衍射峰，而V 型淀粉的形成是由淀粉分子鏈俘獲疏水性客體分子形成的特殊晶體結(jié)構(gòu)配合物[30-31]。綜上，在納米顆粒沉降過程中，淀粉分子鏈可有效與葉黃素分子結(jié)合形成絡(luò)合物，完成對疏水性藥物葉黃素的包埋。當(dāng)包埋量增至65.61 mg/g 時，在7.8 處出現(xiàn)新的V 型結(jié)構(gòu)特征峰，這是因為隨著包埋量的增加，更多的葉黃素分子進入淀粉分子鏈中，絡(luò)合物含量增加，增強衍射強度，顯示淀粉分子鏈對葉黃素分子的絡(luò)合作用。此外，當(dāng)包埋量較高時，在15.8 和17.2 處有新的微弱衍射峰，這可能是由交纏在淀粉顆粒內(nèi)部的葉黃素產(chǎn)生。其原因是葉黃素溶解在乙醇中，原有的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，在冷凍干燥過程中，重新形成新的晶體結(jié)構(gòu)，使衍射峰的位置發(fā)生一定的偏移。

圖4 SNPs 和SNPs-葉黃素的XRD圖Fig.4 XRD images of SNPs and SNPs-lutein

2.5 FT-IR 分析

傅里葉變換紅外光譜廣泛應(yīng)用于對淀粉結(jié)構(gòu)和淀粉分子鏈間相互作用的分析[32]。通過比較葉黃素、SNPs 和SNPs-葉黃素紅外譜圖發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)生新的特征峰，也沒有特征峰消失，說明沉降過程中，淀粉顆粒和葉黃素仍能保持本身性質(zhì)。Nalawade等[33]研究表明，葉黃素在2 856 cm-1為上的-CH2-的C-H 伸縮振動產(chǎn)生的特征吸收峰，淀粉顆粒在該處無吸收峰，通過該處特征峰強度可判斷SNPs-葉黃素中葉黃素含量的高、低。SNPs-葉黃素（14.57 mg/g）在該處未檢測到明顯的吸收峰，推測可能是葉黃素含量較低和葉黃素分子進入淀粉分子鏈的疏水空腔，無法被檢測到。這表明較低包埋量時，納米顆粒對葉黃素的負載可能由淀粉分子鏈與葉黃素分子的相互作用引起。當(dāng)包埋量提至33.4 mg/g 時，在該處出現(xiàn)吸收峰，且隨包埋量的提高，SNPs-葉黃素在該處吸收峰逐漸增強，此時較多的葉黃素被包裹在淀粉納米顆粒內(nèi)，產(chǎn)生葉黃素的特征吸收峰。綜上，通過紅外光譜證明淀粉納米顆粒成功對葉黃素進行包埋。

受淀粉分子鏈與葉黃素分子間相互作用的影響，SNPs-葉黃素在1 645 cm-1處的吸收峰相對SNPs 發(fā)生藍移。根據(jù)Fan等[34]的研究表明，1 645 cm-1處吸收峰由淀粉無定型區(qū)的結(jié)晶水分子的H-O-H 彎曲振動引起。H-O-H 鍵的彎曲振動與所需激發(fā)能量有關(guān)，當(dāng)峰向高波數(shù)偏移時，需要較高的能量才能激發(fā)鍵的振動。由圖5 可知，隨著包埋量的增加，該處吸收峰逐漸向高波數(shù)偏移，推測原因是葉黃素分子與淀粉分子鏈結(jié)合后，形成V型晶體結(jié)構(gòu)，增強了淀粉分子鏈間的氫鍵作用力，使無定型區(qū)淀粉分子鏈上結(jié)晶水分子含量減少，使該處需要較高的能量激發(fā)振動。因V 型晶體結(jié)構(gòu)生成，增強了淀粉分子鏈間的氫鍵作用力，減弱了淀粉分子鏈與水分子間的氫鍵作用力，使3 360 cm-1處的-OH 的振動也向高波數(shù)偏移。

圖5 SNPs 和SNPs-葉黃素的FT-IR圖Fig.5 FT-IR images of SNPs and SNPs-lutein

2.6 碘-淀粉絡(luò)合物的UV 分析

碘離子可與淀粉分子鏈上裸露在外部的羥基作用，嵌入淀粉分子鏈的螺旋體的軸心部位，形成一種藍色包合物。從圖6 可看出，隨著SNPs-葉黃素中包埋量的增加，CI 值逐漸增加，表明包埋量增加，淀粉分子鏈與碘離子的結(jié)合能力降低，這是因為葉黃素分子已存于淀粉分子的單螺旋內(nèi)腔中，阻礙了碘離子與淀粉分子鏈的結(jié)合，進一步證明葉黃素與淀粉分子鏈發(fā)生絡(luò)合作用。Kawai等[22]通過淀粉與碘結(jié)合能力評價淀粉中的脂肪酸含量，也發(fā)現(xiàn)隨著脂肪酸含量的增加，CI 指數(shù)升高。

圖6 碘對SNPs 和SNPs-葉黃素的影響Fig.6 The effect of iodine on SNPs and SNPs-lutein

從圖6 可知SNPs 與碘作用呈深藍色，SNPs-葉黃素（14.57 mg/g）與碘作用呈淺藍色，且隨包埋量的增加，顏色逐漸變化。這可能是因為SNPs 與葉黃素絡(luò)合，使SNPs 結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而顯色不同[35]。結(jié)合掃描波長分析，SNPs-葉黃素的UV 吸收，與SNPs 相比，λmax發(fā)生紅移，偏移至351.5 nm附近，而紅移的產(chǎn)生通常是淀粉分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致。初步推測，這可能是SNPs-葉黃素形成的V 型晶體結(jié)構(gòu)，使淀粉顆粒的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起的。李賀[36]用酶催化制備松香淀粉酯，發(fā)現(xiàn)引入松香?；鶊F破壞了淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)，使λmax也發(fā)生紅移。綜上分析可知，葉黃素分子可與淀粉分子鏈發(fā)生絡(luò)合作用，并對淀粉的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，印證了XRD 與FT-IR 的結(jié)果。

2.7 抗氧化能力分析

DPPH 醇溶液在遇到氫供體時，會生成DPPH-H，使醇溶液顏色褪去，通過記錄吸光值準(zhǔn)確計算自由基的清除率，該測定方法已廣泛應(yīng)用于評價各類天然藥物的自由基清除能力[37]。葉黃素原料藥和SNPs-葉黃素對自由基的清除率如圖7 所示。葉黃素原料藥與DPPH 反應(yīng)較快，在20 min 時基本與DPPH 發(fā)生完全反應(yīng)，這是由于葉黃素分子的共軛結(jié)構(gòu)能快速消除自由基，表明葉黃素可作為抗氧化劑[38]。相比葉黃素原料藥，SNPs-葉黃素自由基清除率低于葉黃素原料藥，這是因為SNPs-葉黃素中葉黃素含量低于葉黃素原料藥和顆粒內(nèi)部的葉黃素不能完全釋放有關(guān)[17]。SNPs-葉黃素在60 min 內(nèi)具有持續(xù)的抗氧化性，且自由基消除率不斷增加，印證了其具有緩釋的功能。SNPs-葉黃素不僅具有延長抗氧化的作用，還可以保護葉黃素的抗氧化活性。SNPs-葉黃素表現(xiàn)出較高的釋放率和釋放速率，這與葉黃素易溶于乙醇，對乙醇具有更好的相親性有關(guān)。在乙醇溶液中，乙醇作為極性分子更易到達淀粉分子的單螺旋內(nèi)腔，能快速將葉黃素分子置換出來，表現(xiàn)出較快的釋放速率。

圖7 DPPH 自由基清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging rate

2.8 穩(wěn)定性分析

葉黃素為不飽和結(jié)構(gòu)，化學(xué)穩(wěn)定性較差，在溫度、光照和氧氣等因素下容易發(fā)生降解，顏色逐漸變淺，吸光值降低，通過記錄吸光值的變化可以計算葉黃素的保留率[39]。由圖8 可知，30 d 內(nèi)，低溫保存的葉黃素原料藥和SNPs-葉黃素的保留率均在90%以上，有良好的穩(wěn)定性，說明淀粉納米顆粒對葉黃素具有良好的生物兼容性，不會使葉黃素的穩(wěn)定性降低。貯藏30 d 時，室溫條件下的葉黃素原料藥保留率降至64.91%，SNPs-葉黃素（14.57，33.4，65.61 mg/g）分別降至81.35%，76.73%，75.26%；升溫條件下葉黃素原料藥降至44.91%，SNPs-葉黃素（14.57，33.4，65.61 mg/g）分別降至66.14%，59.12%，56.66%。

圖8 不同儲藏條件下的穩(wěn)定性圖Fig.8 Stability diagram under different storage conditions

可見，SNPs-葉黃素中葉黃素的保留率均高于葉黃素原料藥，葉黃素的穩(wěn)定性有較大提高，表明淀粉納米顆粒對葉黃素有良好的保護作用。結(jié)合XRD 和UV 結(jié)果分析，葉黃素分子與淀粉分子鏈形成絡(luò)合物而被包裹進淀粉顆粒內(nèi)部，葉黃素處于淀粉分子鏈的保護作用下，使穩(wěn)定性得到提高。同時，淀粉本身具有阻隔氧氣進入顆粒內(nèi)部的性質(zhì)，進而保護葉黃素不被氧氣氧化[40]。常豐丹[41]研究淀粉與疏水性脂質(zhì)類物質(zhì)形成的復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒對包裹的客體脂質(zhì)分子具有良好的保護作用，這與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

在無任何穩(wěn)定劑和有毒溶劑情況下，采用超聲波攪拌法制備形貌較好，顆粒尺寸分布均勻的SNPs。在SNPs 沉降過程中，完成對疏水性大分子葉黃素的包埋和負載，制備出納米級別的SNPs-葉黃素顆粒。研究表明葉黃素分子主要與淀粉分子鏈單螺旋空腔內(nèi)的疏水性和SNPs 內(nèi)部的疏水性微質(zhì)發(fā)生絡(luò)合作用，可形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。通過調(diào)節(jié)淀粉乳與乙醇的體積比、葉黃素濃度以及淀粉乳濃度制備出包埋量為（57.62±0.36）mg/g 和包埋率為（40.33±0.56）%的SNPs-葉黃素顆粒。這為SNPs 對疏水性藥物的負載提供了方法，為SNPs在藥物負載和食品方面的應(yīng)用提供參考。