馬瑞雪，寇婷婷，孫霞芝，范艷麗

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 銀川 750021）

枸杞（Lycium barbarum L.）屬茄科，多年生落葉灌木，是我國珍貴的傳統(tǒng)藥用植物[1]，也是藥食同源品種之一[2]，具有抗炎、抗老和神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)功能[3-5]。其種植區(qū)域從傳統(tǒng)的寧夏中寧產(chǎn)區(qū)，逐漸擴(kuò)展為“寧夏道地產(chǎn)區(qū)為核心，青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙為兩翼”的大枸杞種植區(qū)[6]。枸杞多糖（Lycium Barbarum polysaccharides，LBP）是 枸杞的主要活性成分，是一種有效的抗氧化劑[7]。由于環(huán)境因素不同，導(dǎo)致不同產(chǎn)地枸杞的品質(zhì)存在很大差異[8]，而枸杞多糖結(jié)構(gòu)和活性是否存在典型的地區(qū)差異，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)和產(chǎn)品研發(fā)有至關(guān)重要的作用[9]。

基于同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，i-TRAQ）技術(shù)的蛋白組學(xué)分析，廣泛應(yīng)用于植物蛋白的識(shí)別和定性、定量分析中，該技術(shù)可同時(shí)比較8 個(gè)樣品的表達(dá)量[10]。目前關(guān)于不同產(chǎn)區(qū)枸杞多糖的研究已有報(bào)道。Wang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，青海產(chǎn)地的枸杞果實(shí)明顯大于寧夏和新疆，而其產(chǎn)量低于其它產(chǎn)地，研究還發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地枸杞多糖的單糖組成、分子質(zhì)量和構(gòu)象相似，抗氧化和免疫活性結(jié)果也一致。徐金楠等[11]通過對(duì)不同產(chǎn)地枸杞多糖結(jié)構(gòu)特征對(duì)比，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的枸杞多糖結(jié)構(gòu)相似，且環(huán)境因素對(duì)多糖糖環(huán)形式和單糖組成的影響比品種因素大。在蛋白水平探究不同產(chǎn)地枸杞多糖差異的相關(guān)報(bào)道較少，課題組前期比較了不同產(chǎn)地枸杞多糖的含量、分子質(zhì)量、單糖組成以及結(jié)構(gòu)特征，通過iTRAQ 技術(shù)比較枸杞蛋白表達(dá)差異[12]，而未分析枸杞多糖的相關(guān)蛋白。本文基于前期iTRAQ 定量蛋白組學(xué)技術(shù)，對(duì)不同產(chǎn)地“寧杞1號(hào)”枸杞果實(shí)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，篩選出與枸杞多糖合成代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，并初步推測(cè)枸杞多糖合成代謝相關(guān)通路，為不同產(chǎn)地枸杞多糖的差異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SDS（色譜純）、Urea（色譜純）、二硫蘇糖醇（色譜純）、碘乙酰胺（色譜純），美國Bio-Rad 公司；碳酸氫銨（色譜純）、Tris（色譜純）、三氟乙酸（色譜純），美國Sigma-Aldrich 公司；甲酸（色譜純），德國Fluka 公司；乙腈（色譜純），德國Merck 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

液相色譜系統(tǒng)（Easy nLC）、質(zhì)譜儀（Q Exactive）、微量紫外光度計(jì)（2000c）、酶標(biāo)儀（Multiskcan FC），美國Thermo Scientific；低溫高速離心機(jī)（5430R）、真空離心濃縮儀（Concentrator Plus），德國Eppendorf 公司；超聲破碎儀（JY92-II），寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣 枸杞樣品為分別采摘自寧夏中寧、新疆精河、內(nèi)蒙古烏拉特前旗、甘肅瓜州和青海德令哈的“寧杞1 號(hào)”枸杞。于7 月枸杞夏果期，選擇6 年生樹勢(shì)健壯、栽培管理一致的“寧杞1 號(hào)”代表性植株5 株，從開花坐果起第32 天進(jìn)行取樣。共設(shè)3 個(gè)重復(fù)，兼顧東、西、南、北4 個(gè)方向及上、下、內(nèi)、外各個(gè)方位的果實(shí)，并將其充分混勻。取樣后立即用液氮冷凍24 h，并用-80 ℃冰箱貯藏，待所有產(chǎn)地全部采樣完成后，用干冰冷凍快遞至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)樣。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取與定量 將5%TCA/丙酮（1∶9）加入枸杞細(xì)粉中，并用渦旋混勻。混合物在-20 ℃下沉淀4 h 后離心（6 000×g、40 min），并將沉淀風(fēng)干。將30%的SDT 緩沖液加入20 μg 粉末中，混合煮沸5 min，并在80 W 的條件下勻漿超聲10 次，每次10 s，間歇15 s。煮沸15 min 并離心（14 000×g、40 min），用0.22 μm 過濾器過濾上清液。用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并于-80 ℃保存。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)枸杞蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 蛋白質(zhì)消化 利用過濾輔助樣品制備程序進(jìn)行蛋白質(zhì)消化[13]，并用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 iTRAQ 標(biāo)記 按說明使用iTRAQ 試劑標(biāo)記每個(gè)枸杞樣品的100 μg 肽混合物。蛋白質(zhì)樣品分別標(biāo)記為113（寧夏中寧）、114（新疆精河）、115（內(nèi)蒙古烏拉特前旗）、116（甘肅瓜州）及117（青海德令哈）。

1.3.5 分離標(biāo)記肽 利用純化系統(tǒng)通過強(qiáng)陽離子交換SCX 色譜分離iTRAQ 標(biāo)記的肽。用緩沖液A（25% ACN、10 mmol/L KH2PO4、pH 3.0）酸化重組干燥的肽混合物，并將其裝入聚硫乙基（4.6×100）mm 柱（5 μm，200?）。用緩沖液B（500 mmol/L KCl，10 mmol/L KH2PO4，25% ACN，pH 3.0）以1 mL/min 的流速梯度洗脫肽。緩沖液B 吸光度值的線性梯度和后續(xù)步驟與前人研究方法相同[14]。

1.3.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析的方法與Wang等[15]的研究相同。每個(gè)樣品都采用液相色譜系統(tǒng)Easy nLC 分離。0.1%甲酸為緩沖液A，0.1%甲酸（84%乙腈）為緩沖液B，色譜柱與95%緩沖液A 平衡。將樣品從自動(dòng)進(jìn)樣器裝入裝載柱，并通過ntelliFlow 技術(shù)用分析柱分離，流速為300 nL/min。在Q Exactive 上進(jìn)行LC-MS/MS 分析，并將其與Easy nLC 耦合。

1.3.7 數(shù)據(jù)庫搜索和蛋白質(zhì)鑒定與定量 質(zhì)譜的鑒定和定量通過Proteome Discoverer 1.4 和Mascot 2.2 進(jìn)行。用蛋白表達(dá)倍數(shù)≥1.2 或≤0.83 且P<0.05 來確定上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)蛋白（DEPs），用t 檢驗(yàn)進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)比值。

1.3.8 生物信息學(xué)分析 以寧夏中寧“寧杞1 號(hào)”枸杞作為相對(duì)定量參考，采用層次聚類算法對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的總蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析，對(duì)所有DEPs進(jìn) 行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。后將各個(gè)比較組DEPs 通過蛋白質(zhì)ID 在uniprot 網(wǎng)站進(jìn)行查找，標(biāo)注所有DEPs 的主要功能，并篩選出與多糖合成相關(guān)的DEPs。將篩選的DEPs 通過STRING 軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），利用KEGG 通路結(jié)合篩選后的DEPs推測(cè)出多糖合成代謝途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定和聚類分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖1a）表明共有818 444 個(gè)LCMS/MS 譜與已知譜進(jìn)行了匹配；匹配譜數(shù)為60 795 個(gè)，利用率為7.43%；得到16 384 個(gè)肽段；其中鑒定到的唯一肽段總數(shù)有12 375 個(gè)。這些肽共鑒定得到4 852 個(gè)蛋白質(zhì)，表明采自寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅和青海的“寧杞1 號(hào)”枸杞共鑒定出4 852 個(gè)蛋白質(zhì)。將鑒定到的蛋白進(jìn)行聚類分析（圖1b），結(jié)果表明采自各產(chǎn)地的枸杞樣品的3次重復(fù)結(jié)果較好，蛋白組學(xué)測(cè)定結(jié)果可靠。

圖1 蛋白質(zhì)鑒定（a）和聚類分析（b）Fig.1 Mass spectrometry identification results（a）and Cluster analysis（b）

2.2 差異蛋白篩選與分析結(jié)果

4 個(gè)比較組共鑒定出1 437 個(gè)DEPs，如圖2a，青海/寧夏組的DEPs 數(shù)量最多，共1 015 個(gè)。其次是甘肅/寧夏組和新疆/寧夏組，分別是966 個(gè)和446 個(gè)。而內(nèi)蒙古/寧夏組的DEPs 最少，共166個(gè)。此外，各比較組上調(diào)的DEPs 數(shù)量均小于下調(diào)的。將4 個(gè)比較組的DEPs 做Venn 圖，結(jié)果如圖2b 所示，發(fā)現(xiàn)在4 個(gè)比較組中都存在的DEPs 有56 個(gè)，且新疆/寧夏組、青海/寧夏組和內(nèi)蒙古/寧夏組共有的DEPs 最少，共2 個(gè)。

圖2 DEPs 分布及重疊情況Fig.2 Distribution and overlap of DEPs

2.3 差異蛋白KEGG 通路分析

對(duì)新疆/寧夏組、內(nèi)蒙古/寧夏組、甘肅/寧夏組及青海/寧夏組的DEPs 進(jìn)行KEGG 通路分析，并將各組注釋到DEPs 數(shù)最多的前20 個(gè)通路列出。結(jié)果如圖3 所示，新疆和寧夏比較組KEGG 途徑中DEPs 數(shù)目最多的條目是“碳代謝”，其次為“氨基酸的生物合成”和“核糖體”。內(nèi)蒙古和寧夏比較組KEGG 途徑中DEPs 數(shù)目最多的條目是 “內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工”，其次為“氨基酸的生物合成”和“嘌呤代謝”。甘肅和寧夏比較組KEGG 途徑中DEPs 數(shù)目最多的條目是“碳代謝”，其次為“氨基酸的生物合成”和“核糖體”。青海和寧夏比較組KEGG 途徑中DEPs 數(shù)目最多的條目是“碳代謝”，其次為“氨基酸的生物合成”和“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工”。在4 個(gè)比較組中DEPs 占比最大的是光合有機(jī)體的“碳代謝”，中心碳代謝是所有生物體最基本的細(xì)胞代謝途徑之一[16]，而且光合作用本身是糖合成和運(yùn)輸?shù)臎Q定性因素，并連接著調(diào)節(jié)果實(shí)發(fā)育的環(huán)境和生物因素[17]。

圖3 差異蛋白KEGG 通路注釋Fig.3 KEGG pathway annotation of protein expression

2.4 枸杞中多糖相關(guān)DEPs 篩選

篩選與枸杞多糖合成代謝相關(guān)的DEPs，共160 個(gè)。結(jié)果如圖4 所示，青海/寧夏組得到的相關(guān)差異蛋白最多，共102 個(gè)；內(nèi)蒙古/寧夏組得到的相關(guān)差異蛋白最少，共11 個(gè)。

圖4 各個(gè)比較組蛋白篩選結(jié)果Fig.4 Screening results of proteins in each comparison group

進(jìn)一步篩選后，除去未表征蛋白和在KEGG通路中無法注釋的外，與枸杞多糖相關(guān)的DEPs共23 個(gè)，得到的多數(shù)表達(dá)蛋白與植物多糖合成代謝有直接關(guān)系。而這23 個(gè)DEPs 大多表征在甘肅/寧夏組和青海/寧夏組中，且在新疆/寧夏組和內(nèi)蒙古/寧夏組中多不顯著表達(dá)（P>0.05），因此剔除這兩個(gè)比較組，只比較甘肅/寧夏組和青海/寧夏組，得到的結(jié)果如表1 所示。

表1 不同產(chǎn)地枸杞果實(shí)多糖相關(guān)差異蛋白篩選Table 1 Screening of wolfberry polysaccharide related proteins from different habitats

2.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

由于缺乏枸杞及其近邊緣物種的蛋白質(zhì)互作，故而通過茄科的同源性蛋白構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（圖5）。利用160 個(gè)與多糖相關(guān)的DEPs 制作蛋白質(zhì)互作互交作用最明顯的一組由21 個(gè)DEPs組成，包括：糖基轉(zhuǎn)移酶家族（K4CPX6、K4CMS0）、己糖激酶家族（K4C7S0）、ATP 依賴的6-磷酸果糖激 酶（K4CES3）、α -1，4 -葡聚糖 磷酸化 酶（K4CSQ2）及一些尚未被驗(yàn)證的蛋白（annotation not available）。另一組由6 個(gè)DEPs 組成，包括β-半乳糖苷酶（E3UVW7），α -半乳糖苷酶（K4BP29）、α-甘露糖苷酶（E0XN34）及一些尚未被驗(yàn)證的蛋白（annotation not available）。

圖5 篩選后差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Interaction network of differentially expressed proteins after screening

2.6 枸杞多糖相關(guān)蛋白通路分析

植物中的多糖主要分為纖維素、半纖維素和果膠三大類[18]，并利用這23 個(gè)多糖相關(guān)蛋白與KEGG 通路分析結(jié)合，初步預(yù)測(cè)枸杞多糖合成代謝相關(guān)通路，主要有5 個(gè)過程。這些過程并非單獨(dú)存在，而是由UDP-葡萄糖連接在一起的，UDP-葡萄糖通過一系列反應(yīng)參與果膠物質(zhì)、半纖維素、糖脂和其它糖基化分子的合成[19]，因此多糖的合成是通過UDP-葡萄糖池的通量進(jìn)行碳分配和循環(huán)[20]。在多糖合成代謝的過程中，當(dāng)不同產(chǎn)地的同一個(gè)蛋白的表達(dá)倍數(shù)存在差異時(shí)，可能導(dǎo)致其多糖合成代謝也存在差異。

2.6.1 蔗糖合成分解代謝過程 蔗糖合成和分解代謝的過程如圖6 所示，蔗糖磷酸合成酶（EC：2.4.1.14，SPS）先催化果糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為蔗糖-6-磷酸。通過對(duì)不同淀粉葉物種茄科植物番茄、馬鈴薯和煙草等植物的SPS 過表達(dá)的分析得到證實(shí)，SPS 活性與這些物種葉片的蔗糖合成率呈正比關(guān)系[21]。青海和甘肅枸杞中SPS 的表達(dá)量低于寧夏枸杞（表1），推測(cè)寧夏蔗糖合成率可能高于青海和甘肅。鄭國琦[22]研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育期枸杞果實(shí)中枸杞多糖含量的積累與蔗糖含量呈負(fù)顯著相關(guān)，表明寧夏中寧產(chǎn)地枸杞的多糖含量可能會(huì)低于青海和甘肅，但這與課題組前期試驗(yàn)結(jié)果并不一致[12]。前期枸杞多糖含量測(cè)定結(jié)果表明，青海和寧夏產(chǎn)地微高于甘肅產(chǎn)地，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是SPS 的活性與蔗糖積累量并不總是密切相關(guān)，葡萄柚汁囊中蔗糖含量增加時(shí)，SPS 活性趨于穩(wěn)定[23]。

圖6 蔗糖與纖維素合成代謝過程Fig.6 The synthesis and metabolism of sucrose and cellulose

蔗糖分解代謝具有復(fù)雜的生理生化過程，主要調(diào)控因子是蔗糖代謝酶，包括蔗糖合成酶（EC：2.4.1.13，SS）和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（EC：3.2.1.26，INV），二者活性的變化明顯影響了總碳水化合物的積累狀態(tài)，其中SS 的作用是雙向的，促進(jìn)蔗糖和UDP-葡萄糖的平衡[24]。UDP-葡萄糖作為纖維素合成的底物，通過SS 被引導(dǎo)到纖維素合成酶復(fù)合物，催化蔗糖裂解生成UDP-葡萄糖和果糖[25]。SPS（果糖-6-磷酸+UDP-葡萄糖）通過循環(huán)使果糖生成蔗糖，為SS 提供連續(xù)的底物，以UDP-葡萄糖的形式的進(jìn)行纖維素的生物合成，同時(shí)限制了細(xì)胞內(nèi)果糖的數(shù)量[26]。如表1 所示，青海枸杞蛋白中的SS表達(dá)量低于寧夏，可能會(huì)導(dǎo)致青海枸杞中纖維素的前體底物UDP-葡萄糖較少，使纖維素含量較少，影響枸杞多糖合成。

2.6.2 纖維素合成代謝過程 纖維素合成代謝的過程如圖6 所示，一部分UDP-葡萄糖通過一系列反應(yīng)生成纖維素后，纖維素需要一個(gè)酶聯(lián)合體來逐漸將纖維素分解，最終代謝為葡萄糖；另一部分UDP-葡萄糖生成1，3-β-葡聚糖和β-葡萄糖苷，并分別由β-1，3-葡聚糖酶（EC：3.2.1.39，GN5-6）和β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，BGL）最終代謝為葡萄糖[27]。研究表明純化后的野生杏β-葡萄糖苷酶可以將纖維二糖糖化成葡萄糖，β-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.21，BGL）對(duì)纖維素材料的糖化具有高親和力和催化能力[28]。纖維素的底物UDP-葡萄糖通過一系列酶的作用轉(zhuǎn)化為纖維素是利用一個(gè)高效的酶聯(lián)合體來水解纖維素，轉(zhuǎn)化為葡萄糖通常需要3 種酶：內(nèi)切葡聚糖酶（EC：3.2.1.4，EG）、外切葡聚糖酶（EC：3.2.1.91，CBH）和BGL。如表1 所示，在酶聯(lián)合體中，除青海和甘肅枸杞中BGL 的表達(dá)量高于寧夏枸杞外，未發(fā)現(xiàn)其它兩種酶有差異表達(dá)，推測(cè)BGL 可能是導(dǎo)致青海和甘肅與寧夏枸杞的纖維素水解效果速率產(chǎn)生差異的主要原因。在纖維素水解過程中，產(chǎn)物葡萄糖在很多情況下會(huì)抑制BGL 的活性[29]，因而青海和甘肅產(chǎn)地枸杞多糖中的葡萄糖含量可能會(huì)低于寧夏產(chǎn)地，這一結(jié)果與前期研究一致[12]。

2.6.3 半乳聚糖合成代謝過程 如圖7 所示，UDP-葡萄糖-4-表異構(gòu)酶（EC：5.1.3.2，galE）催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖相互轉(zhuǎn)化。UDP-半乳糖在半乳糖醇合成酶（EC：2.4.1.123，GOLS）的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇作為半乳糖基供體，分別由棉子糖合成酶（EC：2.4.1.82，E2.4.1.82）和水蘇糖合成酶（EC：2.4.1.67，E2.4.1.67）這兩種專門的合成酶合成棉子糖和水蘇糖；隨后由β-呋喃果糖苷酶（EC：3.2.1.26，INV）將兩種糖分別水解成蜜二糖和甘露三糖；最后由α-半乳糖苷酶（EC：3.2.1.22，GLA）水解棉子糖、水蘇糖、甘露三糖和蜜二糖最終生成半乳糖和葡萄糖[30]。在擬南芥中，棉子糖和半乳糖醇在冷適應(yīng)條件下會(huì)增加，而棉子糖的合成降解會(huì)受到半乳糖醇合成酶和棉子糖合成酶的作用[31]。在矮牽?；ㄖ蠫LA 下調(diào)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)植株的耐寒性增加，因此認(rèn)為GLA 基因的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性棉子糖含量降低，從而減低植物抗凍性[32]。由表1 可知甘肅和青海地區(qū)枸杞GLA 和INV 與寧夏地區(qū)相比表達(dá)下調(diào)，推測(cè)甘肅和青海地區(qū)枸杞耐寒性高于寧夏，寧夏地區(qū)枸杞棉子糖家族寡糖含量可能低于甘肅和青海地區(qū)。

圖7 半乳聚糖合成代謝過程Fig.7 The synthesis and metabolism of galactan

2.6.4 半纖維素合成代謝過程 半纖維素主要為阿拉伯木聚糖，如圖8 所示，UDP-葡萄糖通過UDP-葡萄糖脫氫酶（EC：1.1.1.22，UGDH）不可逆地反應(yīng)生成UDP-葡萄糖醛酸，并在UDP-葡萄糖醛酸脫羧酶（EC 4.1.1.35，UXS）、UDP-木糖/木糖合酶（AXS）和其它一系列酶的作用下一部分轉(zhuǎn)化為UDP-D-芹菜糖和UDP -D-木糖[33]，UDP-木糖通過一些與阿拉伯聚糖合成代謝相關(guān)的酶作用下進(jìn)行分解代謝。UDP-葡萄糖作為轉(zhuǎn)換UDP-糖的重要分支節(jié)點(diǎn)在UGDH、UXS 及AXS 和UDP-阿拉伯糖-4-表異構(gòu)酶（EC 5.1.3.5，UXE）的催化下分別轉(zhuǎn)換為UDP-葡萄糖醛酸、UDP-木糖和UDP-L-阿拉伯糖。

圖8 半纖維素合成代謝過程Fig.8 The synthesis and metabolism of hemicellulose

有研究表明，高表達(dá)的AXS 和低表達(dá)的UXE會(huì)導(dǎo)致UDP-木糖的積累[34]。前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，寧夏產(chǎn)地枸杞多糖中木糖含量高于青海，而阿拉伯糖含量低于青海?？赡芤?yàn)榍嗪ｈ坭街蠻XS 和AXS 的表達(dá)量均低于寧夏，青海枸杞中UGDH 的表達(dá)量高于寧夏而導(dǎo)致木糖和阿拉伯糖積累發(fā)生變化。

2.6.5 果膠合成代謝過程 果膠是存在所有植物初級(jí)細(xì)胞壁中的多糖家族，屬于酸性植物細(xì)胞壁多糖，（1，4）-鏈接的β-D-吡喃半乳糖醛酸作為骨架結(jié)構(gòu)的一部分。如圖9 所示，UDP-葡萄糖-4-表異構(gòu)酶（EC：5.1.3.2，galE）催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖相互轉(zhuǎn)化，UDP-半乳糖醛酸在α-1，4-半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（EC：2.4.1.43，GAUT）的作用下生成果膠，而PG（EC 3.2.1.15）和果膠酯酶（EC：3.1.1.11，E3.1.1.11）是最佳的果膠修飾酶，可降解果膠[35-36]。

圖9 果膠合成代謝過程Fig.9 The synthesis and metabolism of pectin

果膠裂解酶（EC：4.2.2.2，PLY）主要通過降解原代細(xì)胞壁中的果膠在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)張和分化[38-39]。在植物中，已經(jīng)證實(shí)，在香蕉等水果的成熟和軟化過程中PLY 參與果膠多糖主鏈的降解[37]。果膠酯酶（EC：3.1.1.11，E3.1.1.11）是一種羧酸酯酶，屬于水解酶類，該酶通過使細(xì)胞壁中存在的多半乳糖醛酸果膠主鏈中的甲基化羧基脫酯化，促進(jìn)果膠的降解，從而提高了多半乳糖醛酸酶的效率[40]。甘肅和青海地區(qū)枸杞中PLY 和E3.1.1.11 的表達(dá)量與寧夏產(chǎn)地有差異，PLY 和果膠酯酶可能對(duì)枸杞果實(shí)中的果膠多糖具有一定的降解作用，從而影響不同產(chǎn)地枸杞多糖差異。

3 結(jié)論

本文基于iTRAQ 結(jié)合2D LC-MS/MS 的技術(shù)研究不同產(chǎn)地“寧杞1 號(hào)”枸杞的蛋白質(zhì)差異，共篩選到1 437 個(gè)DEPs，進(jìn)行KEGG 通路注釋，進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)與枸杞多糖相關(guān)的差異表達(dá)蛋白共23 個(gè)，推測(cè)枸杞多糖合成代謝通路，主要分為蔗糖合成代謝、纖維素合成代謝、半乳聚糖合成代謝、阿拉伯木聚糖合成代謝及果膠合成代謝5 個(gè)過程，主要參與其中的酶為蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、UDP-葡萄糖醛酸脫羧酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、果膠酯酶和果膠裂解酶等，這些酶可能是影響不同產(chǎn)地枸杞多糖差異的重要蛋白。本文為深入了解不同產(chǎn)地枸杞多糖差異變化機(jī)理提供了一定的參考，下一步可針對(duì)不同成熟期的枸杞進(jìn)一步分析，以探究不同產(chǎn)地枸杞多糖變化規(guī)律。